淫羊藿苷對大鼠骨髓間充質干細胞遷移作用的影響

張黎聲 韓小晶 羅志榮 邵水金 葉曉春 牟芳芳 國海東

摘要：目的 探討淫羊藿苷調控大鼠骨髓間充質干細胞（MSC）遷移作用機制。方法 CCK-8法檢測細胞增殖。建立體外細胞缺糖缺氧模型，Hoechst33342染色觀察細胞凋亡。Western blot檢測淫羊藿苷處理后MSC表面基質細胞衍生因子l（SDF-1）受體趨化因子受體4（CXCR4）的蛋白表達。Transwell小室跨膜實驗觀察淫羊藿苷對MSC遷移的作用。結果 0.01、0.1、1 μmol/L淫羊藿苷可明顯促進MSC增殖，10 μmol/L淫羊藿苷抑制MSC增殖。經體外缺糖缺氧處理后，0.1、1 μmol/L淫羊藿苷可明顯抑制MSC凋亡。淫羊藿苷可顯著促進MSC CXCR4的蛋白表達，同時可提高MSC跨膜遷移的數量。加入CXCR4拮抗劑AMD3100后，各組間細胞遷移數量無明顯差異。結論 一定濃度淫羊藿苷可促進MSC的增殖、存活和遷移，SDF-1/CXCR4信號通路參與淫羊藿苷調控MSC遷移的作用。

關鍵詞：淫羊藿苷；骨髓間充質干細胞；存活；遷移；信號通路

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.013

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）02-0044-05

干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的原始細胞。在一定條件下，干細胞可以分化成多種功能細胞，成為治療損傷性疾病極具潛力的療法。在心

血管領域，近年來的臨床研究表明，干細胞移植在一定程度上有利于心功能的恢復[1]。我們的研究發現，骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）移植可降低大鼠心肌梗死后梗死面積，促進血管新生和旁分泌[2-3]。然而，心肌梗死后局部微環境不利影響干細胞的存活，也限制了干細胞的遷移[4]。淫羊藿苷（icariin）是一種從淫羊藿中提取的異黃酮類化合物，可補腎壯陽、延緩衰老，增加心腦血管血流量、強心、降血壓和抗心律失常[5]。淫羊藿苷不僅可誘導胚胎干細胞向心肌細胞分化[6]，還可以促進細胞增殖和抑制細胞凋亡[7-8]。最近的研究發現，淫羊藿苷可促進血管內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPC）的遷移，但其具體作用機制尚不明確[9]。基質細胞衍生因子l（stromal cell derived factor-l，SDF-l）/趨化因子受體4（CXCL receptor 4，CXCR4）信號通路在干細胞歸巢、遷移和募集過程中發揮重要的調控作用[10]。因此，本研究探討SDF-1/CXCR4信號通路在淫羊藿苷調控MSC遷移中的作用機制，為臨床應用干細胞移植治療心肌梗死等損傷性疾病提供實驗數據。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠10只，體質量（200±50）g，上海中醫藥大學實驗動物中心，動物許可證號SYXK（滬）2014-0008，購入后直接用于原代MSC培養。

1.2 主要試劑和儀器

胰酶、多聚賴氨酸、AMD3100和牛血清白蛋白（美國Sigma 公司），高糖DMEM和無糖DMEM培養基（美國Gibco公司），胎牛血清（美國Hyclone公司），CCK-8試劑盒、Hoechst33342、PMSF和RIPA裂解液（上海碧云天生物技術有限公司），Transwell小室和24孔板（美國Corning Costar公司），SDF-1α （美國PeproTech公司），CXCR4抗體、GAPDH抗體和HRP標記二抗（美國CST公司）。電泳儀和轉膜儀（美國Bio-Rad公司），IX53顯微鏡（日本Olympus），細胞培養箱（美國Thermo Fisher公司）。

2 實驗方法

2.1 骨髓間充質干細胞培養

將成年雄性SD大鼠脫頸處死，無菌條件下分離雙側股骨和脛骨。剪開骨兩端的干骺端，暴露骨髓腔，用含有肝素的0.01 mol/L PBS沖洗骨髓腔至10 mL離心管內，1000 r/min離心8 min。吸去上清液，用含15%FBS DMEM培養液混懸沉淀，均勻接種至培養瓶中，37 ℃、5%CO2條件下培養。當細胞達到70%～80%匯合時，進行傳代培養。

2.2 CCK-8法檢測細胞增殖

取第5代MSC，用0.01 mol/L PBS漂洗后，經0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液消化，收集細胞懸液，1000 r/min離心8 min，棄去上清液，加入新鮮培養液重新混懸沉淀后將細胞以5×104個/mL接種至96孔板中。用不同濃度的淫羊藿苷對MSC進行刺激，分為0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L淫羊藿苷組，未加淫羊藿苷處理的作為對照組。加入不同濃度淫羊藿苷處理48 h后，CCK-8法檢測各組細胞吸光度（OD）值。取各組細胞，每孔加入10 μL CCK-8溶液，于細胞培養箱內繼續孵育1 h后，于酶標儀波長450 nm處測定OD值。

2.3 體外缺糖缺氧模型建立

參照Hori O等[11]方法自制缺氧盒，并加以改進。在有機塑料盒的2個側面各建立1個通氣孔，分別用于進氣和排氣，將95% N2和5% CO2的混合氣體通過進氣孔通入缺氧盒中，通過排氣孔將盒內氣體抽空和連接測氧儀。實驗分為對照組（未加淫羊藿苷）和0.01、0.1、1 μmol/L淫羊藿苷組。將細胞接種至24孔板內的滅菌蓋玻片上，培養24 h后從培養箱內取出24孔板，吸去培養液，用0.01 mol/L PBS漂洗3次，更換無糖無血清的DMEM，淫羊藿苷組分別添加相應濃度的淫羊藿苷進行處理。然后將24孔板放入自制無菌缺氧盒中，密封盒蓋，關閉通氣孔。通過排氣孔用50 mL注射器將缺氧盒中的氣體盡可能抽空。然后密封排氣孔，經通氣孔通入體積分數為5% CO2和95% N2的混合氣體，并通過測氧儀檢測盒中的氧氣含量。當缺氧盒內氧濃度低于1%時迅速密封通氣孔，然后將缺氧盒置于37 ℃下繼續培養。

2.4 Hoechst33342染色

各組細胞經體外缺糖缺氧處理24 h后，棄去培養液，用0.01 mol/L PBS漂洗3次，加入4%多聚甲醛固定20 min，0.01 mol/L PBS漂洗3次后加入Hoechst33342染色液，室溫孵育10 min，0.01 mol/L PBS漂洗3次，磷酸甘油封片，熒光顯微鏡下觀察細胞核的形態。每孔隨機選取5個視野，分別計數凋亡和全部細胞數。實驗重復5次，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率（%）=凋亡細胞數÷細胞總數×100%。

2.5 Western blot檢測CXCR4蛋白表達

實驗分為對照組和0.01、0.1、1 μmol/L淫羊藿苷組。將MSC接種至6孔板中，不同濃度淫羊藿苷處理48 h，吸去上清液，經0.01 mol/L PBS漂洗3次，每孔加200 μL預冷的含PMSF的RIPA裂解液，充分裂解細胞后12 000 r/min離心15 min，取上清液。BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。取各組蛋白30 μg，加入5×SDS上樣緩沖液，于沸水中煮5 min使蛋白變性。上樣后行電泳，至溴酚蘭剛跑出時終止電泳，經半干轉轉膜儀轉膜，20 V條件下轉印60 min，使膠內蛋白充分轉移至PVDF膜上。將膜用PBST浸濕后，移至含5%脫脂奶粉的平皿中，室溫脫色搖床上搖動封閉1 h。加入CXCR4抗體（1∶2000）、GAPDH抗體（1∶5000），4 ℃脫色搖床上孵育過夜。PBST室溫清洗3次，每次10 min。加入HRP標記的二抗（1∶10 000），室溫脫色搖床上搖動孵育2 h。PBST清洗3次后，ECL發光，化學發光成像儀上直接成像并拍照。

2.6 Transwell小室跨膜實驗

實驗分對照組和0.01、0.1、1 μmol/L淫羊藿苷組及0.01 μmol/L淫羊藿苷+1 μg/mL AMD3100組、0.1 μmol/L淫羊藿苷+1 μg/mL AMD3100組。Transwell小室（8 μmol/L）檢測細胞遷移。培養時Transwell小室置于24孔板，將600 μL含100 ng/mL SDF-1α的DMEM添加到小室的下池。將各組MSC（1×105）混懸于200 μL含0.1%BSA的DMEM中，加入培養小室內，置5% CO2培養箱培養24 h。棄去孔中DMEM，用棉簽小心將小室膜上表面細胞擦去，用4%多聚甲醛固定10 min，結晶紫常溫染色10 min，蒸餾水充分洗滌后，顯微鏡下觀察并拍照，計數表面細胞的數量。

3 統計學方法

采用SPSS21.0統計軟件進行分析。實驗結果以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 淫羊藿苷對骨髓間充質干細胞增殖的影響

0.001 μmol/L淫羊藿苷對MSC的增殖無明顯影響。0.01、0.1、1 μmol/L淫羊藿苷均可促進MSC增殖（P<0.01），其中1 μmol/L淫羊藿苷促進MSC增殖的作用最明顯，與0.01、0.1 μmol/L組比較，差異均有統計學意義（P<0.01）。10 μmol/L淫羊藿苷則對MSC具有一定的細胞毒性作用，可顯著抑制MSC的增殖。結果見圖1。

4.2 淫羊藿苷對骨髓間充質干細胞凋亡的影響

經缺血缺氧處理24 h后，對照組中有大量的MSC細胞核表現出典型的凋亡形態，染色質發生固縮或斷裂為大小不等的片段，有的出現凋亡小體，鏡下可見細胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。加入不同濃度淫羊藿苷可減少凋亡MSC的數量。0.01 μmol/L淫羊藿苷組與對照組比較，凋亡細胞數量無明顯差異，而0.1 μmol/L或1 μmol/L淫羊藿苷可明顯抑制MSC的凋亡（P<0.05，P<0.01）。1 μmol/L淫羊藿苷組發生凋亡的MSC數量最少，與0.1 μmol/L淫羊藿苷組比較差異有統計學意義（P<0.05）。

4.3 淫羊藿苷對骨髓間充質干細胞CXCR4蛋白表達的影響

與對照組比較，0.01 μmol/L或0.1 μmol/L淫羊藿苷組CXCR4的蛋白表達有升高趨勢，但差異無統計學意義（P>0.05）。1 μmol/L淫羊藿苷可促進CXCR4蛋白表達，明顯高于對照組和0.1 μmol/L淫羊藿苷組（P<0.05，P<0.01）。

與對照組比較，0.01 μmol/L淫羊藿苷處理不能提高MSC跨膜遷移的數量。0.1、1 μmol/L淫羊藿苷組遷移細胞數量均明顯高于對照組（P<0.05，P<0.01）。與0.1 μmol/L淫羊藿苷組比較，1 μmol/L淫羊藿苷組遷移細胞數量增加明顯（P<0.01）。加入AMD3100后，0.1、1 μmol/L淫羊藿苷促進MSC遷移能力被削弱。各濃度淫羊藿苷+AMD3100組之間細胞遷移數量無明顯差異。與1 μmol/L淫羊藿苷組比較，1 μmol/L淫羊藿苷+AMD3100組遷移細胞數明顯減少（P<0.01）。

5 討論

干細胞領域的興起與快速發展為心肌梗死等缺血性心肌病的治療帶來曙光。通過中藥復方或有效成分處理可促進干細胞增殖、存活、遷移和分化等，為解決干細胞移植面臨的問題提供思路和方向。淫羊藿具有補腎陽、堅筋骨、強心的功效。淫羊藿苷作為淫羊藿的主要活性成分，在心血管方面具有多種藥理活性。研究表明，淫羊藿苷不僅對異丙腎上腺素所致大鼠急性心肌缺血具有一定的保護作用[12]，還可以保護缺血再灌注引起的心肌損傷，縮小心肌梗死面積[13]。本研究發現，一定濃度的淫羊藿苷可明顯促進MSC的增殖，但高濃度的淫羊藿苷卻對MSC的活性有明顯的抑制作用，這與文獻[7]報道一致。10 μmol/L淫羊藿苷對MSC活性的抑制作用可能是該濃度淫羊藿苷具有較大的細胞毒性。我們以前的研究也發現，高濃度的丹酚酸B對MSC也有一定的細胞毒性，明顯抑制MSC的增殖[2]。因此，在選擇中藥或其有效成分處理干細胞時，首先要考慮不同濃度對細胞活力的影響。

干細胞移植后在移植部位停留和存活是治療成功與否的關鍵所在。絕大部分的干細胞在移植到心肌局部缺血缺氧環境后出現凋亡、壞死或直接丟失，這也是目前制約干細胞治療的瓶頸所在。淫羊藿苷可通過抑制活性氧依賴的JNK/NF-κB減少H9c2大鼠心肌細胞凋亡[14]。本實驗通過體外建立缺糖缺氧模型，研究淫羊藿苷對大鼠骨髓MSC抗缺血缺氧的保護作用。經缺血缺氧處理24 h后，對照組大量MSC細胞核表現出明顯的凋亡形態變化。而在0.1 μmol/L或1 μmol/L淫羊藿苷組，大部分細胞仍保持較好的形態，凋亡細胞數目明顯減少。以上結果提示，缺糖缺氧處理可導致MSC產生細胞凋亡，而適當濃度的淫羊藿苷有助于細胞對抗缺血缺氧微環境，提高其存活能力。有研究表明，淫羊藿苷可顯著抑制H2O2誘導的EPC凋亡，其機制可能與上調mTOR、p70S6K和4EBP1磷酸化水平和下調ATF2和ERK1/2蛋白表達水平有關[9]。然而，淫羊藿苷促進MSC存活的具體作用機制尚需進一步研究。干細胞存活后向梗死部位的遷移和募集也是影響干細胞移植效果的主要問題。干細胞移植后如在梗死部位或梗死邊緣區域成簇存在，不僅不利于新生心肌細胞與宿主心肌之間的偶聯，還有可能造成心律失常[15]。淫羊藿苷可以在體外增加EPC增殖和跨膜遷移的能力[9]。本研究發現，一定濃度的淫羊藿苷可以提高MSC的遷移能力。進一步研究發現，淫羊藿苷可以促進MSC表達趨化因子SDF-1的受體CXCR4，經CXCR4阻斷劑AMD3100處理后跨膜遷移的MSC數顯著降低，提示淫羊藿苷可通過SDF-1/CXCR4信號通路調控MSC的遷移。SDF-l與CXCR4特異性結合后，通過激活下游的二級信使，調控細胞遷移、凋亡、黏附等多種功能。SDF-l/CXCR4軸在組織缺血損傷和心肌再生修復中發揮重要作用，它參與調節組織缺血損傷后的血管新生和心肌梗死后的干細胞募集，在干細胞的動員、歸巢、黏附、血管穿透和在靶器官內的增殖、存活的整個過程中發揮著重要作用。有研究表明，MSC在體外培養后，其表面受體CXCR4的表達水平逐漸降低，導致MSC向心肌組織的募集減少。研究發現，對急性大腦中動脈梗死大鼠灌胃低劑量淫羊藿苷可顯著提高腦組織中SDF-1和CXCR4的表達，促進大鼠腦缺血后的神經功能恢復[16]。因此，移植淫羊藿苷預處理的MSC可能會提高干細胞治療心肌梗死的效果。

綜上所述，一定濃度的淫羊藿苷可促進MSC的增殖、存活和遷移。SDF-1/CXCR4信號通路參與淫羊藿苷調控MSC遷移的作用。本研究可為臨床應用干細胞移植治療心肌梗死等損傷性疾病提供實驗數據參考。

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（收稿日期：2016-06-26）

（修回日期：2016-07-12；編輯：華強）