基于化學發光磁酶免疫分析技術檢測單增李斯特菌

范龍興，寧保安，孫智勇，白家磊，彭媛，曲曉辰，劉超，烏恩琦，高志賢，*，劉穎，*

（1.內蒙古醫科大學公共衛生學院，內蒙古呼和浩特010110；2.軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究

所天津市環境與食品安全風險監控技術重點實驗室，天津300050；3.中國人民解放軍第十一醫院，新疆伊寧835000）

基于化學發光磁酶免疫分析技術檢測單增李斯特菌

范龍興1，2，寧保安2，孫智勇3，白家磊2，彭媛2，曲曉辰1，劉超2，烏恩琦1，高志賢2，*，劉穎1，*

（1.內蒙古醫科大學公共衛生學院，內蒙古呼和浩特010110；2.軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究

所天津市環境與食品安全風險監控技術重點實驗室，天津300050；3.中國人民解放軍第十一醫院，新疆伊寧835000）

探索化學發光磁酶免疫分析技術在單核細胞增生性李斯特菌檢測中的應用，并初步建立和優化檢測方法及條件。將抗LM兔多抗與磁性微球偶聯構建免疫磁分離原件，應用雙抗夾心法ELISA檢測LM全菌抗原，應用化學發光法進行定量檢測，應用正交設計優化主要反應條件，建立標準曲線，測試靈敏性與特異性。通過正交試驗優化的反應條件為37℃條件下，免疫磁珠用量20μL、含0.1%BSA的PBS封閉15min，捕獲抗原2 h，HRP標記的抗LM單抗稀釋至1∶10 000（體積比）特異性結合反應30min后進行化學發光檢測，標準曲線擬合優度0.954，最低檢出限104CFU/mL，特異性良好，檢測時限為3h～4 h。

化學發光；免疫磁珠；單增李斯特菌

單核細胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）簡稱單增李斯特菌，是有著強大致死能力的食源性致病菌之一，其感染致命性僅次于沙門氏菌[1-3]。單增李斯特菌廣泛存在于自然環境中，且在4℃條件下仍能緩慢生長，人類主要通過受其污染的肉乳及其制品感染而發病[4-5]。因此，我國對食源性單增李斯特菌的檢測十分重視。目前，我國檢測單增李斯特菌的金標準仍然是傳統的培養法[6]，但過長的檢測周期和繁瑣的操作仍然無法滿足快速檢驗的要求。酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）自提出以來，廣泛應用于食品安全檢測，但常規的ELISA需要復雜的樣品前處理和繁瑣的洗脫程序，這同樣使檢測過于耗時，且靈敏性和特異性受到一定影響[7-8]。化學發光免疫分析技術（chemiluminescence immunoassay，CLIA）有著較高的靈敏性，近年來備受學者們的關注[9-10]。同時，隨著新興的磁性納米材料的研究和發展，應用免疫磁分離技術（immunomagnetic separation，IMS）使得簡化樣品前處理和快速富集目標物成為可能[11-13]。本研究以單增李斯特菌為目標物，將化學發光測定技術、磁分離技術與夾心法ELISA相結合，旨在探索并建立一個快速靈敏的食源性致病菌檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

雄性新西蘭白兔：軍事醫學科學院實驗動物中心。

1.1.2 菌株

單核細胞增生性李斯特菌（L.monocytohenes，LM）、英諾克李斯特菌（L.Innocua，LI）、威爾斯李斯特菌（L.Welshimeri，LW）、大腸桿菌O157：H7（E.Coli O157：H7，O157：H7）、沙門氏菌（Salmonella，Sal）、金黃色葡萄球菌（S.Aureus，SA）：軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所凍存。

1.1.3 主要試劑

含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯TSB-YE：中國Solarbio公司；弗氏完全/不完全佐劑：美國Sigma公司；Protein A瓊脂糖凝膠親和層析柱、PD-10脫鹽柱：美國General Electric公司；Dynabeads M-270環氧基磁珠抗體偶聯試劑盒、Pierce增強型化學發光底物液：美國Themo Fisher公司；HRP標記抗LM鼠源單抗：英國abcam公司。

1.1.4 主要儀器

DRP-9162電熱恒溫培養箱：中國森信公司；ZWY-100H溫控回旋臺式震蕩器：中國上海智誠公司；渦旋振蕩器；HS-3型垂直混合儀：中國寧波新芝公司；DynaMag-2磁分離器、Multiskan MK3酶標儀、Fluoroskan AscentFL熒光/化學發光分析儀：美國Themo Fisher公司。

1.1.5 主要分析軟件

Image J1.45：美國softonic公司；SPSS 22.0：美國IBM公司。

1.2 方法

1.2.1 全菌滅活抗原的制備

將上述保存于-80℃的菌株復蘇純化，接種于含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯培養基中，37℃震蕩增菌16 h，4℃、4 000 r/min離心10min去除培養基，重懸于pH7.4PBS緩沖液中，進行平板計數。應用終濃度0.4%甲醛溶液37℃滅活24小時，4℃、4 000 r/min離心10min更換緩沖液除去甲醛，將滅活抗原濃度定溶至109CFU/mL，4℃保存。

1.2.2 免疫磁珠的制備

取成年健康雄性新西蘭白兔2只行四點免疫（頸背部皮下2點、后肢肌肉2點），每只1mL抗原量，每次免疫追加抗原用量，每次免疫間隔2周，第3次免疫后進行間接ELISA檢測抗血清效價，梯度至1∶104～1∶105（體積比）時，腹腔麻醉后行頸總動脈取血。兔源抗LM IgG多克隆抗體粗純化采用辛酸-硫酸銨法，再采用親和層析法進一步純化多克隆IgG抗體，最后進行蛋白定量及特異性檢測。參照DynabeadsM-270環氧基磁珠抗體偶聯試劑盒說明書，按30μg抗體/mg磁性微珠比例偶聯，免疫磁性微球定溶至10mg/mL，4℃保存。

1.2.3 檢測方法的建立及條件優化

偶聯有兔源抗LM IgG多抗的免疫磁性微珠作為捕獲元件，HRP標記的抗LM鼠源IgG單抗作為檢測抗體，建立200μL反應體系的雙抗夾心化學發光磁酶免疫分析法檢測單增李斯特菌?？乖瓭舛葹?06CFU/mL，根據正交設計進行試驗對反應條件進行優化。

1.2.4 確定檢出限及特異性

用pH7.4 PBS緩沖液將單增李斯特菌全菌抗原稀釋至103CFU/mL～108CFU/mL，根據1.2.3建立的方法進行靈敏性檢驗，并繪制標準曲線。應用濃度為106CFU/mL的單增李斯特菌、英諾克李斯特菌；威爾斯李斯特菌、大腸桿菌O157：H7、沙門氏菌、金葡菌滅活全菌抗原對1.2.3建立的方法進行特異性檢驗。

1.2.5 模擬實際樣品檢測

將單增李斯特菌滅活全菌按105、106、107CFU/mL加入牛肉浸膏培養基中混勻，應用1.2.3建立的方法進行回收檢測。

2 結果

2.1 兔源抗LM IgG多抗效價及特異性

第5次免疫后間隔1周耳緣靜脈采血檢測抗血清效價及特異性?？寡逍r見圖1，將抗血清按梯度稀釋后與106數量級各滅活全菌抗原進行間接ELISA檢測。各梯度吸光值與陰性血清1∶1 000（體積比）稀釋吸光值之比大于2.1為判斷標準，效價可達1∶64 000～ 1∶128 000（體積比），抗血清特異性良好，僅對英諾克李斯特菌和威爾斯李斯特菌有輕微非特異性反應。多抗效價見圖2，抗血清純化后多抗效價可達1∶6 400～ 1∶12 800（體積比），仍有輕微非特異性反應。

圖1 兔源抗血清效價及特異性檢測結果Fig.1 The titer and specificity of rabbit antiserum were detected

圖2 純化兔源多克隆抗體效價及特異性檢測結果Fig.2 The titer and specificity of purified rabbit polyclonal antibody were detected

2.2 檢測方法關鍵條件優化

以107CFU/mL單增李斯特菌滅活抗原為檢測目標物，根據正交試驗設計L27（35×24）對化學發光磁酶免疫分析檢測方法的關鍵條件進行優化，主要優化因素見表1。檢測指標以相對化學發光值比表示，計算方法見公式1。試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表1 化學發光磁酶免疫分析檢測優化正交設計因素水平Table1 Factor level of chemiluminescent magnetic enzyme immunoassay were optimized by orthogonal design

表2 化學發光磁酶免疫分析檢測優化正交試驗結果Table2 The optimization results of orthogonal design for chemiluminescent magnetic enzyme immunoassay

續表2化學發光磁酶免疫分析檢測優化正交試驗結果Continue table2 The optimization results of orthogonal design for chemiluminescent magnetic enzyme immunoassay

表3 化學發光磁酶免疫分析檢測優化正交試驗方差分析結果Table3 Analysis of variance of orthogonal design for chemiluminescent magnetic enzyme immunoassay

如結果所示，免疫磁球用量A（F=5.365，p=0.036）、捕捉孵育溫度C（F=92.902，p=0.000）、捕捉孵育時間D（F=8.757，p=0.003）和檢測洗脫次數H（F=6.384，p= 0.024）的主效應有統計學意義，其余因素差異不顯著。故根據正交試驗結果并綜合專業理論及經濟條件，選擇A1B2C2D3E1F2J2H2（即取20μL免疫磁球、封閉或沖洗15min、37℃捕捉目標物2 h、洗脫1次、1∶10 000（體積比）稀釋檢測抗體37℃孵育30min、洗脫3次后進行檢測）為最佳條件，進行后續試驗。

2.3 繪制標準曲線確定檢出限

根據2.2優化條件，將單增李斯特菌滅活抗原按梯度稀釋至104CFU/mL～108CFU/mL，重復試驗每次試驗設立3個平行孔，繪制標準曲線，確定檢出限。標準曲線見圖3。

圖3 化學發光磁酶免疫分析檢測單增李斯特菌靈敏性試驗結果（±S）Fig.3 Sensitivity test results of Listeria monocytogenes detected by chemiluminescent magnetic enzyme immunoassay（x±S）

相對化學發光值比與濃度變化近似呈線性關系，線性擬合優度R2=0.954。根據公式1，相對化學發光值比已排除背景值影響，故檢出限為104CFU/mL（相對化學發光值比0.203）。

2.3 化學發光磁酶免疫分析的特異性檢測

將單增李斯特菌及其他菌株作為抗原，檢測化學發光磁酶免疫檢測方法的特異性。特異性檢測結果見圖4。

圖4 化學發光磁酶免疫分析檢測特異性試驗結果（x±S）Fig.4 Specific test results of chemiluminescent magnetic enzyme immunoassay（x±S）

單增李斯特菌檢測值和單增李斯特菌混合抗原（Mix+）檢測值呈顯著陽性結果，混合抗原較單純單增李斯特菌抗原相對化學發光值比偏低，可能與多抗非特異性吸附有關。其他抗原檢測值均小于0.2，故本檢測方法對單增李斯特菌有顯著的特異性。

2.4 食物樣品加標模擬檢測

將單增李斯特菌滅活全菌抗原稀釋至105、106、 107CFU/mL，分別加入至滅菌牛奶、滅菌牛肉膏溶液、滅菌鹵肉湯中，調節pH值至7.2～7.4后進行模擬檢測試驗。不同食物樣品加標模擬試驗結果見圖5。

圖5 不同食物樣品加標模擬試驗結果（x±S）Fig.5 Simulation test results of different food samples（x±S）

如圖5所示，與標準液（pH7.4，0.01mol PBS緩沖液）相比，牛奶與牛肉膏溶液回收值較好，鹵肉汁檢測結果偏低，可能與鹵肉汁中鹽離子強度過高，影響抗體識別活性有關。

3 分析與討論

本研究以傳統的免疫分析為基礎，結合磁分離技術和化學發光檢測技術初步建立并優化了一個針對食品中單增李斯特菌為檢測目標物的化學發光磁酶免疫分析方法。眾所周知，傳統的免疫分析（ELISA）方法主要依賴于高特異性抗體，而目前全國乃至全球，能識別單增李斯特菌的高特異性抗體仍然不多且售價昂貴。我們以本所凍存的單增李斯特菌菌株為抗原制備兔源抗單增李斯特菌多克隆抗體，在我們的研究中得到了識別能力良好的多抗，雖然其對英諾克李斯特菌和威爾斯李斯特菌存在一定程度的非特異性識別，但將其與磁性微球偶聯和傳統的酶標板固相載體相比大大增加了反應面積，有利于捕獲檢測樣品中的單增李斯特菌，同時相比識別能力相差不多的進口多抗，我們節約了大量生產成本有著重要的經濟效益。

目前食源性單增李斯特菌的主要有培養法、ELISA和PCR法等，培養法的主要缺點是用時過長；ELISA法雖然檢測較為快速但其繁瑣的洗脫過程導致檢測的靈敏性和特異性不高且難以達到定量的要求[14-16]；PCR法檢測同樣較為迅速，但其需要一個精細的樣品前處理環節，同時以來于高特異性的擴增引物，在實際檢測中往往因此出現非特異性擴增，從而導致誤判[17-19]。化學發光檢測技術十分靈敏曾廣泛應用于痕跡檢測[20]，本研究將傳統ELISA與其結合，增加了檢測中的靈敏度。應用免疫磁微球識別檢測樣品中的目標物簡化了樣品的前處理過程，使目標物容易分離[21]。捕獲識別過程在一個動態溶液中進行，相比傳統ELISA靜置孵育，大大增加了識別載體與目標物的接觸機會，有利于對目標物的捕獲。

我們應用正交試驗設計優化了檢測方法的主要反應條件，簡化了多余的洗脫次數，將檢測時間優化到最少，3 h～4 h即可進行一次試驗。在試驗中我們還發現，化學發光檢測技術雖然靈敏性很高，但其發光穩定性并不好。針對這一問題，我們在試驗中將檢測的發光值進行換算，以相對化學發光值比為檢測指標，同時每次檢測需要繪制標準曲線，排除批間試驗差異過大的問題，使檢測結果穩定容易比較。

4 結論

本研究將免疫分析技術、磁分離技術和化學發光檢測技術相結合，初步建立并優化了一個以食品中單增李斯特菌為目標物的快速檢測方法。根據正交試驗設計，我們發現該檢測方法對檢測環境要求不高，整個試驗在37℃條件下進行，所需時間3 h～4 h即可完成。試驗操作較為簡便，檢測限可達104CFU/mL，與其他菌株交叉反應極低，具有良好的靈敏性和特異性。本研究初步建立的檢測方法一些反應條件仍可進一步優化，其社會效益和經濟效益均不容小覷，它為快速檢驗食品中單增李斯特菌和其他食源性致病菌提供了一個良好思路。

[1]Goulet V,Hedberg C,Le M A,et al.Increasing incidence of listeriosis in France and other European countries[J].Emerging Infectious Diseases,2008,14(5):734-740

[2]崔煥忠,喬立橋,王義沖.單核細胞增生性李斯特菌的主要毒力因子及其致病機理[J].中國畜牧獸醫,2010(1):128-133

[3]Pamer EG.Immune responses to Listeria monocytogenes[J].Nature Reviews Immunology,2004,4(4):812-823

[4]朱小花,李燕杰,杜冰,等.食品工業中生物被膜態與浮游態單核細胞增生性李斯特菌的危害及其控制[J].食品研究與開發, 2010,31(10):212-216

[5]郭宏華,賈芙蓉,韓曉英,等.單核細胞增生性李斯特菌研究進展[J].中國實驗診斷學,2013,17(1):197-199

[6]中華人民共和國衛生部.GB 4789-2010食品安全國家標準食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗[S].北京:中國標準出版社,2010:3-26

[7]Portanti O,Di F T,Luciani M,et al.Development and validation of an antigen capture ELISA based on monoclonal antibodies specific for Listeria monocytogenes in food[J].Veterinaria Italiana,2011,47 (3):271-280

[8]Cavaiuolo M,Paramithiotis S,Drosinos EH,et al.Development and optimization of an ELISA based method to detect Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in fresh vegetables[J].Analytical Methods,2013,5(18):4622-4627

[9]Zhang Y,Tan C,Fei R,et al.Sensitive chemiluminescence immunoassay for E.coli O157:H7 detection with signal dual-amplification using glucose oxidase and laccase[J].Analytical Chemistry, 2014,86(2):1115-1122

[10]Chen L,Zhang Z,Zhang X,et al.A novel chemiluminescence immunoassay of staphylococcal enterotoxin B using HRP-functionalised mesoporous silica nanoparticle as label[J].Food Chemistry, 2012,135(1):208-212

[11]Estrada C SM L,Velázquez L D C,Favier G I,et al.Detection of Yersinia,spp.in meat products by enrichment culture,immunomagnetic separation and nested PCR[J].Food Microbiology,2012,30(1): 157-163

[12]Zhao W,Zhang W P,Zhang Z L,et al.Robust and highly sensitive fluorescence approach for point-of-care virus detection based on immunomagnetic separation[J].Analytical Chemistry,2012,84(5): 2358-2365

[13]董乾,王君,郝紅,等.磁性微球的制備方法及應用[J].離子交換與吸附,2015(5):472-480

[14]Cavaiuolo M,Ferrante A,Botticella G,et al.Evaluation of an ELISA method to detect Listeria monocytogenes in fresh-cut rocket[J].Acta Horticulturae,2015(1071):369-372

[15]段霞,黃欣,黃嶺芳,等.雙抗夾心ELISA方法檢測食品中單核細胞增生李斯特氏菌[J].食品科學,2010,31(24):272-276

[16]劉雅莉,劉芳,韓舜愈,等.九種單核細胞增生性李斯特菌檢測技術效果比較及評價[J].中國生物工程雜志,2012,32(6):84-92

[17]Oliveira M A D,Ribeiro EGA,Bergamini A M M.Quantification of Listeria monocytogenes,in minimally processed leafy vegetables using a combined method based on enrichment and 16S rRNA realtime PCR[J].Food Microbiology,2010,27(1):19-23

[18]Garrido-Maestu A,Chapela M J,Vieites JM,et al.Application of real-time PCR to detect Listeria monocytogenes,in a mussel processing industry:Impact on control[J].Food Control,2014,46(12): 319-323

[19]馮可,胡文忠,姜愛麗,等.單核細胞增生性李斯特菌分子生物學檢測技術的研究進展[J].食品工業科技,2014,35(4):392-396

[20]汪晨,吳潔,宗晨,等.化學發光免疫分析方法與應用進展[J].分析化學,2012,40(1):3-10

[21]唐瑤,許宙,丁利,等.磁性納米材料在食品組分分離和安全檢測領域的研究進展[J].食品與機械,2015(6):224-227

Detection of Listeria monocytogenes through Chemiluminescent Magnetic Enzyme Immunoassay

FAN Long-xing1，2，NING Bao-an2，SUN Zhi-yong3，BAI Jia-lei2，PENG Yuan2，QU Xiao-chen1，LIU Chao2，WU En-qi1，GAO Zhi-xian2，*，LIU Ying1，*
（1.College of Public Health，Inner Mongolia Medical University，Hohhot010110，Inner Mongolia，China；2.Tianjin Key Laboratory of Risk Assessment and Control Technology for Environment and Food Safety，Tianjin Institute of Health and Environmental Medicine，Tianjin 300050，China；3.Chinese PLA Eleventh Hospital，Yining 835000，Xinjiang，China）

To explore the application of chemiluminescent magnetic enzyme immunoassay in the detection of Listeria monocytogenes，and to establish and optimize the detection methods and conditions.The magnetic beads were coupled with rabbit anti LM polyclonal antibody to structure the original of immunomagnetic separation.L.monocytogenes was detected by chemiluminescence through double antibody sandwich ELISA.Orthogonal design was used to optimize the reaction conditions，and to establish the standard curve，the sensitivity and specificity were tested.Through orthogonal design，the optimization of reaction conditions were in 37℃，immunomagnetic bead dosage of20μL，containing 0.1% BSA in PBS blocking 15min，antigen captured 2 h and HRP labeled anti LM monoclonal antibody dilution to1∶10 000（體積比）specificity binding reaction 30min after chemiluminescence detection.The goodness of fit of standard curve is 0.954，the minimum detection limit is104CFU/mL，the specificity is good，and the detection time is3 h-4 h.

chemiluminescence immunoassay；immunomagnetic beads；Listeria monocytogenes

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.027

2016-07-18

國家重大科學儀器設備開發專項（2013YQ14037106）

范龍興（1988—），男（漢），碩士研究生，研究方向：流行病與食品安全相關工作。

*通信作者：劉穎（1973—），女，副教授，碩士生導師；高志賢（1963—），男，研究員，博士生導師。