兩種酵素產品抗氧化活性分析

陳爽，朱顯峰

（河南大學生命科學學院生物工程研究所，河南開封475004）

兩種酵素產品抗氧化活性分析

陳爽，朱顯峰*

（河南大學生命科學學院生物工程研究所，河南開封475004）

試驗通過復合酵素對羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的清除能力以及還原力的大小的測定，來評價、比較兩種酵素產品的體外抗氧化能力。結果表明：試驗范圍內，酵素產品在體外的抗氧化性良好，抗氧化能力總體上與0.1g/L抗壞血酸相當；其中，產品A的抗氧化性能優于產品B，產品A的總酚含量可達280mg/mL。

酵素；自由基；還原力；總酚

酵素與人類的生活息息相關，近些年來，研究者越來越多的關注酵素的研究。酵素有個正式的名字--酶，它的產生類似堆肥的原理。它是以一種或多種水果、蔬菜為原料，經多種有益菌發酵而成[1]，這種經復合發酵得到的棕色液體稱為混合發酵液。這種混合發酵液中除了含有酵素原材料中豐富的營養物質之外，還含有發酵過程中產生的多種活性物質，如各種酶、有機酸、酚類、氨基酸等。酵素在食品和醫藥等領域中具有很廣泛的應用，酵素也可預防現代文明病、解酒護肝、美容，并且其在女性的健康中也有著不可或缺的作用[2-5]。

傳統上，物質與氧結合生成氧化物的過程稱為氧化，人體內的氧化是一種生物化學過程。體內的氧化伴隨著新陳代謝時時刻刻都在進行，氧化的結果會生成許多自由基，自由基或氧化劑會將細胞和組織分解，影響新陳代謝并加速衰老，進而引發各種健康問題。據文獻記載，衰老或許多疾病被證實與活性氧和自由基有關聯[6-8]。因此，若能夠消除過多的自由基，將會預防許多自由基引起的衰老及相關疾病?？寡趸瘎┑目寡趸钚灾饕憩F在抑制脂質氧化降解、清除活性氧、清除自由基、螯合過渡金屬和還原能力等幾方面。酵素產品的抗氧化活性對活性氧與幾種自由基有顯著的清除作用，例如其中的超氧化物歧化酶（SOD）體內活性氧的清除作用[9]。生物體內對活性氧和自由基的清除作用，使其在生命研究領域具有良好的應用前景。

酚類物質是很好的抗氧化劑[10]，如兒茶素能清除體內的自由基，使自由基變為穩定的分子狀態，阻斷其傳遞電子，阻止機體的氧化損傷；此外，兒茶素對Fe3+的還原能力，是VC相對還原能力的11.76%[11]。

酵素發酵液對超氧陰離子自由基、羥自由基和DPPH自由基均有一定的清除能力，它對物質的還原能力，以及其中含有的大量酚類物質，賦予這種復合酵素在體外的抗氧化能力。酵素抗氧化活性對機體代謝有積極的影響，人體含有的酵素越多，人就越健康。實驗室將購于市場上的新鮮水果或蔬菜按一定比例，裝入5 L發酵罐中，密封，常溫常壓發酵半年，得到復合發酵液——以下統稱酵素產品，來進行體外抗氧化實驗。通過對酵素產品抗氧化活性的研究可以為酵素產品在醫藥健康等領域的進一步發展提供參考，提高人們的生活質量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

將市售新鮮的富士蘋果、碭山梨、海南香蕉、巨峰葡萄以及白心火龍果作為A組，本地西紅柿、白蘿卜、芹菜、白菜、黃瓜作為B組，洗凈晾干，按照一定的質量比，在超凈工作臺中加入適量的無菌白砂糖，均勻平鋪于5 L玻璃罐中，補水至刻度，密封，并定期釋放產生的氣體，避免染菌。利用各種水果自身攜帶的微生物，使晝夜溫差保持在10℃，常壓密閉發酵半年，得到兩種酵素產品。

1.1.2 試驗試劑

Tris、鄰苯三酚、鹽酸、30%雙氧水、FeSO4、水楊酸、無水乙醇、DPPH、甲醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、FeCl3、Folin-酚、碳酸鈉、焦性沒食子酸、抗壞血酸，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Eppendorf5810R臺式高速冷凍離心機：德國艾本德股份公司；PHB-1型便攜式酸度計：杭州真立龍儀器有限公司；CP213電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；FA124電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；INESA 752N紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；玻璃儀器氣流烘干器C型：河南省予華儀器有限公司；數顯恒溫水浴鍋HH-6：國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超氧陰離子自由基（O2－·）清除能力測定

采用鄰苯三酚自氧化法[11-12]。鄰苯三酚在堿性條件下能迅速自氧化，釋放出O2－·，生成黃色的中間產物，在325 nm處測定溶液的吸光度。利用抗壞血酸作為對照組。用石英比色皿于325 nm處測其OD值。

1.3.2 羥自由基（·OH）清除能力測定

H2O2與Fe2+混合反應會產生·OH，在體系內加入水楊酸捕捉·OH并產生有色物質，該物質在510 nm下有最大吸收。參照徐建東[12]的方法，利用此原理對酵素的羥基自由基清除能力進行測定?？箟难嶙鳛閷φ战M存在；用玻璃比色皿于510 nm處測其OD值。

1.3.3 DPPH自由基（DPPH·）清除能力測定

DPPH自由基是較穩定的有機自由基，其在甲醇溶液中呈紫色，在517 nm處有較強吸收峰，在有自由基清除劑存在時，DPPH醇溶液有褪色情況出現，其褪色程度與DPPH自由基被清除量有關，可用比色法進行定量[11]。抗壞血酸作為對照組存在；用玻璃比色皿于517 nm處測其OD值。

1.3.4 還原力與總酚含量的關系試驗

分別取兩種酵素產品額梯度稀釋液進行試驗，以蒸餾水作為空白對照，用玻璃比色皿于760 nm處測其OD值，根據線性方程A=0.018 4C+0.004 6，R2=0.999 7來計算總酚含量，其中：A為吸光度，C為樣品濃度（mg/mL）[12]。還原力的測定參照程德竹[13]的方法，以蒸餾水代替樣品作為空白對照；用玻璃比色皿于700 nm處分別測其OD值。以對應濃度測得還原力的大小為橫坐標，總酚含量為縱坐標進行線性擬合。

2 結果與分析

2.1 對自由基清除能力及總酚含量的測定

按照公式：清除率/%=[A0-（Ai-Aj）]/A0×100，計算酵素產品對自由基的清除率。其中：Ai是樣品測得的吸光度值，A0為水代替待測液時測得的吸光度值；Aj為水代替反應試劑時待測液不同濃度下測得的吸光度值。

對自由基的清除能力見圖1。

圖1 對自由基的清除能力Fig.1 Free radicals scavenging ability

由圖1可以看出，兩種酵素產品對羥基自由基、超氧陰離子與DPPH自由基均有一定的清除能力，其中對DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除能力均在85%以上，而對羥基自由基的清除能力略低。就兩種酵素產品而言，產品A的整體清除能力較產品B高5%左右，且二者對超氧陰離子自由基的清除能力都高達90%以上；與0.1 g/L抗壞血酸相比，兩種酵素產品對超氧陰離子自由基的清除能力較高，而清除DPPH自由基的能力與抗壞血酸基本持平，羥基自由基的清除能力明顯低于抗壞血酸。

2.2 還原力與總酚含量的關系分析

隨酵素產品濃度的增加，其酚類物質隨之增加，還原力水平也越來越高，并且還原力的增加與總酚濃度表現出較好的線性關系，產品A的總酚含量高于產品B，如圖2。兩種產品還原力與總酚含量的相關性R均可達到0.99。

圖2 還原力與總酚含量的相關性Fig.2 The correlation between reducing capacity and total phenol content

3 結論

本試驗通過兩種酵素產品對超氧陰離子自由基，羥自由基、DPPH自由基的清除能力以及還原力的大小的測定，發現酵素產品在體外的抗氧化性良好，抗氧化能力總體上與0.1 g/L抗壞血酸相當；其中，產品A對自由基的清除能力與總酚含量均高于產品B，說產品A的抗氧化性能優于產品B。由于酵素產品中含有具有抗氧化活性的酚類物質，使其還原力非常高。產品A的總酚含量也高于產品B，可達280mg/mL。兩種酵素產品還原力與總酚含量的線性相關R均可達0.99，而酚類物質是具有抗氧化活性的主要原因，其與抗氧化活性的線性相關可達0.97[15]，由此可知，表明還原能力與多種抗氧化機制有關。

酵素產品良好的抗氧化性能及其還原力與抗氧化機制的關系，引發以后對水果與蔬菜的綜合作用，來發酵更高質量的酵素產品，為以后酵素產品的全面開發與應用做好一定的鋪墊，將會推動果蔬復合酵素未來在人類健康方面的發展與應用。

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Analysis on Antioxidant Activity of Two Natural-ferments

CHEN Shuang，ZHU Xian-feng*
（Institute of Bioengineering，College of Life Science，Henan University，Kaifeng475004，Henan，China）

In this experiment，the scavenging effect evaluated the antioxidant activity of two miciobial natural-ferments on·OH，O2－·，DPPH·and reducing capacity.The results showed that the two ferments both had well performance in vitro antioxidant activity and as excellent as ascorbic acid（0.1 g/L）.Ferments A was quite significant than B，its total phenol content was 280mg/mL.

natural-ferments；radical；reducing capacity；total phehol

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.008

2016-05-22

陳爽（1990—），女（漢），碩士研究生，研究方向：微生物學專業，生物物質分離方向。

*通信作者