阿膠三寶膏的質量標準提高研究Δ

焦 陽，汪 冰，林永強，徐麗華（山東省食品藥品檢驗研究院，濟南 250101）

阿膠三寶膏的質量標準提高研究Δ

焦 陽＊，汪 冰，林永強，徐麗華（山東省食品藥品檢驗研究院，濟南 250101）

目的：提高阿膠三寶膏的質量標準。方法：采用超高效液相色譜-質譜聯用法（UPLC-MS）鑒別制劑中的阿膠：色譜柱為Acquity UPLC BEH-C18，流動相為乙腈-0.1%甲酸溶液（梯度洗脫），流速為0.3 mL/min，進樣量為5μL，離子源為電噴霧離子源，毛細管電壓為3.5 kV，毛細管出口電壓為120 V，錐孔電壓為50 V，脫溶劑溫度為400℃，干燥氣流速為10 L/min，霧化器壓為40 psi，碰撞能量為10～45 V，掃描范圍m/z 200～1 500，檢測方式為正離子模式（ESI+），多反應監測（MRM）；采用高效液相色譜法測定制劑中4種水解氨基酸的含量：色譜柱為Agela Venusil XBP-C18，流動相A為乙腈-0.1 mol/L乙酸鈉溶液（36%乙酸調pH至6.5）（7∶93，V/V），流動相B為80%乙腈溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫為43℃。結果：阿膠的UPLC-MS圖峰形清晰，專屬性強，陰性無干擾。L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸檢測進樣量線性范圍分別為0.081 9～0.655 2 μg（r＝0.999 9）、0.186 2～1.489 6 μg（r＝0.999 8）、0.070 3～0.562 0 μg（r＝0.999 9）、0.124 2～0.993 6 μg（r＝0.999 9）；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為99.85%～103.69%（RSD＝1.35%，n＝6）、99.91%～103.93%（RSD＝1.46%，n＝6）、96.86%～101.27%（RSD＝1.69%，n＝6）、97.44%～101.45%（RSD＝1.54%，n＝6）。結論：提高的標準能更加有效地控制阿膠三寶膏的質量。

阿膠三寶膏由阿膠、大棗和黃芪3味中藥組合而成，具有補氣血、健脾胃之功效，常用于氣血兩虧、脾胃虛弱所致的心悸、氣短、崩漏、浮腫、食少等癥的治療[1]。其最早載于《衛生部藥品標準·中藥成方制劑（第二冊）》[2]，但僅收載了性狀和常規檢查項。現行標準為2015年版《中國藥典》（一部），增加了采用高效液相色譜法（HPLC）測定黃芪甲苷含量和總氮量項目。本試驗對現行標準進行完善，增加了制劑中君藥阿膠的特征鑒別[3]，并將原標準中總氮量的測定修訂為阿膠中4種水解氨基酸的HPLC定量測定[4]。

1 材料

1.1 儀器

Quattro Premier XE型超高效液相色譜-質譜聯用（UPLC-MS）儀、LC-20A型HPLC儀（包括LC-20AT四元泵、SPD-20A紫外可見光檢測器、DGU-20A5自動脫氣裝置、SIL-20AC自動進樣器、CTO-20AC柱溫箱）均購自美國Waters公司；CP225D型電子分析天平（德國Sartorius公司）；KQ5200DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：500 W，頻率：40 kHz）。

1.2 藥品與試劑

阿膠三寶膏（山東東阿阿膠股份有限公司，批號：120701、1211001、1301001，規格：250 g/瓶）；L-羥脯氨酸對照品（批號：111578-200201，純度：100%）、甘氨酸對照品（批號：140689-201103，純度：99.9%）、丙氨酸對照品（批號：140680-201303，純度：99.9%）、L-脯氨酸對照品（批號：140677-201206，純度：100%）、阿膠對照藥材（批號：121274-201202）均購于中國食品藥品檢定研究院；胰蛋白酶（美國Promega公司，批號：ADV5280000 01120296）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 阿膠的鑒別

2.1.1 試驗條件 （1）色譜條件。色譜柱：Acquity UPLC BEH-C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～25 min，5%→20%A；25～40 min，20%→50%A）；流速：0.3 mL/min；進樣量：5μL。（2）質譜條件。離子源：電噴霧離子源；毛細管電壓：3.5 kV；毛細管出口電壓：120 V；錐孔電壓：50 V；脫溶劑溫度：400℃；干燥氣流速：10 L/min；霧化器壓：40 psi；碰撞能量：10～45 V；掃描范圍：m/z 200～1 500；檢測方式：正離子模式（ESI+），多反應監測（MRM）。

2.1.2 對照藥材溶液的制備 取阿膠對照藥材0.1 g，加1%碳酸氫銨溶液50 mL，超聲處理30 min，微孔濾膜濾過，取續濾液100μL，置于微量進樣瓶中，加胰蛋白酶溶液（胰蛋白酶100μg溶于1%碳酸氫銨溶液100μL中，下同）10μL，搖勻，37℃恒溫酶解12 h，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取樣品1.0 g，加1%碳酸氫銨溶液50 mL，超聲處理30 min，微孔濾膜濾過，取續濾液100μL，置于微量進樣瓶中，加胰蛋白酶溶液10μL，搖勻，37℃恒溫酶解12 h，即得。

2.1.4 陰性對照溶液的制備 按阿膠三寶膏處方和制備工藝制備缺阿膠的陰性樣品，并按“2.1.3”項下方法制成陰性對照溶液。

2.1.5 專屬性試驗 取“2.1.2”“2.1.3”“2.1.4”項下對照藥材溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.1.1”項下試驗條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結果表明，陰性對照在相應位置未見干擾峰，方法專屬性良好。

圖1 對照藥材、供試品、陰性對照的超高效液相色譜-質譜圖Fig 1 UPLC-MS chromatograms of reference medicinal herbs，test samples and negative control

2.1.6 精密度試驗 取“2.1.2”項下對照藥材溶液適量，按“2.1.1”項下試驗條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，m/z 539.8→612.4提取離子流峰與m/z 539.8→923.8提取離子流峰峰面積的RSD分別為4.32%、4.18%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 樣品鑒別 取3批樣品各適量，分別按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下試驗條件進樣測定，鑒別其成分，詳見圖2。結果，3批樣品的UPLCMS出峰時間一致。

2.2 4種水解氨基酸的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agela Venusil XBP-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：乙腈-0.1 mol/L乙酸鈉溶液（36%乙酸調pH至6.5）（7∶93，V/V），流動相B：80%乙腈溶液，梯度洗脫（0～20 min，100%→93%A；20～23.9 min，93%→88%A；23.9～24 min，88%→85%A； 24～39 min，85%→66%A；39～40 min，66%→0A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：43℃。

圖2 樣品的超高效液相色譜-質譜圖Fig 2 UPLC-MS chromatograms of samples

2.2.2 混合對照品溶液的制備 取待測水解氨基酸對照品適量，加0.1 mol/L鹽酸溶液制成L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸質量濃度分別為0.081 9、0.186 2、0.070 3、0.124 2 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取樣品約2.5 g，精密稱定，加0.1 mol/L鹽酸溶液20 mL，超聲處理30 min，放冷，加0.1 mol/L鹽酸溶液定容至25 mL，搖勻。精密量取上述溶液2 mL，置于10 mL安瓿中，加2 mL鹽酸，熔封，置于150℃恒溫箱中1 h，放冷，移至蒸發皿中，用水10 mL分次洗滌，洗液并入蒸發皿中，蒸干，殘渣加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并定容至25 mL，搖勻，濾過，即得。

2.2.4 混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液的衍生化溶液的制備 分別精密量取“2.2.2”“2.2.3”“2.1.4”項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各5 mL，加1 mol/L異硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液2.5 mL，然后再加1 mol/L三乙胺乙腈溶液2.5 mL，搖勻，室溫放置1 h，加50%乙腈定容至25 mL，搖勻。量取上述溶液10 mL，置于分液漏斗中，加正己烷10 mL，振搖后靜置分層，取下層溶液，濾過，即得。

2.2.5 專屬性試驗 取“2.2.4”項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液的衍生化溶液各適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖3。結果表明，陰性對照在相應位置未見干擾峰，方法專屬性良好。

圖3 高效液相色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms

2.2.6 線性關系考察 取待測水解氨基酸對照品適量，加0.1 mol/L鹽酸溶液制成L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸質量濃度分別為0.081 9、0.186 2、0.070 3、0.124 2 mg/mL的混合對照品溶液。分別精密量取上述混合對照品溶液1、2、4、6、8 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測水解氨基酸進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸回歸方程，分別為y＝1 356 820.6x—254.3（r＝0.999 9）、y＝2 065 568.1x—7 326.1（r＝0.999 8）、y＝1 675 750.1x—1 011.6（r＝0.999 9）、y＝1 561 586.887 8x+65.615 9（r＝0.999 9）。結果表明，L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸檢測進樣量線性范圍分別為0.081 9～0.655 2、0.186 2～1.489 6、0.070 3～0.562 0、0.124 2～0.993 6 μg。

2.2.7 精密度試驗 取“2.2.4”項下混合對照品溶液的衍生化溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸峰面積的RSD分別為0.35%、0.38%、0.37%和0.52%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩定性試驗 取“2.2.4”項下供試品溶液（批號：1301001）的衍生化溶液適量，分別于室溫下放置0、5、10、15、20、25 h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸峰面積的RSD分別為1.27%、1.25%、1.48%和1.18%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置25 h內基本穩定。

2.2.9 重復性試驗 精密稱取同一批樣品（批號：1301001）適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項下方法制備供試品溶液的衍生化溶液，共6份，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算含量。結果，L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸平均含量分別為 8.33、16.37、6.96、13.89 mg/g，RSD分別為1.61%、1.94%、1.19%、1.69%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 取已知含量樣品（批號：1301001）適量，共6份，分別加入一定質量的待測水解氨基酸對照品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，另按“2.2.4”項下方法制備供試品溶液的衍生化溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.2.11 樣品含量測定 取3批樣品各適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，另按“2.2.4”項下方法制備供試品溶液的衍生化溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表2。結合阿膠三寶膏中阿膠的處方量和制成總量計算4種水解氨基酸的理論含量分別為7.2、16.2、6.3和9.0 mg/g。考慮水分、制劑工藝等影響因素，并結合實際測定結果，暫定限度為每1 g含阿膠以L-羥脯氨酸計，不得少于6.1 mg；以甘氨酸計，不得少于13.8 mg；以丙氨酸計，不得少于5.4 mg；以L-脯氨酸計，不得少于7.7 mg。

3 討論

阿膠是馬科動物驢Equus asinus L.的干燥皮或鮮皮經煎煮、濃縮制成的固體膠，是我國的傳統中藥，具有滋陰補血、潤燥、止血之效。處方中含有阿膠的中藥制劑品種繁多，但由于現行方法對制劑中阿膠的質量控制缺乏針對性，專屬性較差。不法廠家用其他劣質皮類替代驢皮熬制阿膠的違法行為時有發生，導致此類制劑質量良莠不齊，藥效無法得到保障。

表2 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 2 Results of contents determination of samples（n＝3）

本試驗采用UPLC-MS法，建立了阿膠特征肽的專屬性鑒別，結果表明，本鑒別方法高效、快速、專屬性強，耐用性強，可有效地對阿膠三寶膏中的阿膠進行鑒別。

本試驗參照2015年版《中國藥典》（一部）阿膠項下含量測定的方法，建立了阿膠三寶膏中阿膠4種水解氨基酸的HPLC含量測定項。由于制劑處方中還含有大棗和黃芪，水溶性雜質較多，因此筆者根據制劑的實際情況優化液相條件，延長洗脫時間，以獲得更好的分離度。按優化后的色譜方法進行試驗，所得數據線性關系、精密度、重復性和回收率均良好。

綜上所述，提高的標準能更加有效地控制阿膠三寶膏的質量。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：1010.

[2] 國家藥典委員會.衛生部藥品標準：中藥成方制劑：第二冊[S].WS3-B-0297-90.

[3] 程顯隆.膠類藥材質量控制關鍵技術研究[D].北京：北京中醫藥大學，2014.

[4] 陳再潔，殷金龍，李坤，等.柱前衍生RP-HPLC法測定人參中17種氨基酸的含量[J].中國藥房，2012，23（35）：3334-3337.

Study on the Improvement of Quality Standard for Ejiao Sanbao Cream

JIAO Yang，WANG Bing，LIN Yongqiang，XU Lihua（Shandong Institute for Food and Drug Control，Jinan 250101，China）

OBJECTIVE：To improve the quality standard of Ejiao sanbao cream.METHODS：UPLC-MS was adopted to identify the donkey-hide glue in the preparation，the chromatographic conditions：column was Acquity UPLC BEH-C18with mobile phase of acetonitrile-0.1%formic acid（gradient elution），volumetric flow rate was 0.3 mL/min，injection volume was 5 μL，ion source is electrospray ionization source，capillary voltage was 3.5 kV，capillary outlet voltage was 120 V，cone voltage was 50 V，desolvation temperature was 400℃，drying gas flow was 10 L/min，nebulizer pressure was 40 psi，collision energy was 10-45 V，scan range was m/z 200-1 500；detection mode was positive ion mode（ESI+），multiple reaction monitoring.HPLC was used to determine the contents of 4 hydrohyzing amino acid：column was Agela Venusil XBP-C18with mobile phase A of acetonitrile-0.1 mol/ L sodium acetate solution（36%acetic acid adjusted to pH 6.5）（7∶93，V/V）and B of 80%acetonitrile solution（gradient elution）at a flow rate of 1.0 mL/min，the detection wavelength was 254 nm，and column temperature was 43℃.RESULTS：The UPLC-MS peak of Equus asinus was clear and specific，without negative interference.The linear range was 0.081 9-0.655 2 μg for L-hydroxyproline（r＝0.999 9），0.186 2-1.489 6 μg for glycine（r＝0.999 8），0.070 3-0.562 0 μg for alanine（r＝0.999 9）and 0.124 2-0.993 6 μg for L-proline（r＝0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 99.85%-103.69%（RSD＝1.35%，n＝6），99.91%-103.93%（RSD＝1.46%，n＝6），96.86%-101.27%（RSD＝1.69%，n＝6）and 97.44%-101.45%（RSD＝1.54%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The improved standard can more effectively control the quality of Ejiao sanbao cream.

Ejiao sanbao cream；Quality standard；UPLC-MS；HPLC

R927.2

A

1001-0408（2017）03-0376-05

2016-02-09

2016-04-25）

（編輯：張 靜）

國家科技重大專項課題（No.2014ZX09304307-002-002）；山東省自然科學基金資助項目（No.ZR2013HM074）

＊藥師。研究方向：藥物分析。電話：0531-81216522。E-mail：jiaoyang579@hotmail.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.03.25

關鍵詞阿膠三寶膏；質量標準；超高效液相色譜-質譜聯用法；高效液相色譜法