生物氣溶膠核酸檢測技術分析

韓麗麗 齊秀麗 徐 莉

(防化學院 北京 102205)

生物氣溶膠核酸檢測技術分析

韓麗麗 齊秀麗 徐 莉

(防化學院 北京 102205)

生物氣溶膠由一些細菌、真菌、病毒等微生物粒子構成,有時又被稱為微生物氣溶膠。生物氣溶膠作為絕大多數生物戰劑的施放形式,經常在生物恐怖襲擊中扮演重要角色。論文在介紹生物氣溶膠定義、來源、特點的基礎上,深入分析生物氣溶膠核酸檢測技術原理、優缺點、裝備應用及國內外研究現狀,并針對我國生物氣溶膠檢測技術的研究提出自己的幾點建議。

生物氣溶膠; 核酸檢測技術; 建議

Class Number X831

1 引言

當前,國際戰略環境錯綜復雜,戰爭的非對稱性和作戰手段的多樣性更加明顯,盡管從1972年以來已有162個國家簽署了《禁止生物武器公約》,但是不少國家仍在致力于生物武器的研制,造成了一定的生物威脅。2001年的“美國炭疽粉末郵件事件”引起了全球范圍內的恐慌,標志著生物恐怖襲擊己經成為現實威脅。生物氣溶膠作為絕大多數生物戰劑的施放形式,經常在生物恐怖襲擊中扮演重要角色。如何對生物氣溶膠實施快速、準確的檢測,已經成為防生物戰和反生物恐怖襲擊的重要課題。對此,世界各國都越來越重視對生物氣溶膠檢測技術的研究,以最大限度地杜絕生物恐怖襲擊的發生。

2 生物氣溶膠概述

2.1 生物氣溶膠的定義

具有生命的氣溶膠粒子(包括細菌、真菌、病毒等微生物粒子)和活性粒子(花粉、孢子等)以及由有生命活性的機體所釋放到空氣中的各種質粒被統稱為生物氣溶膠。由于空氣微生物是大氣生物氣溶膠的主要組成部分,所以生物氣溶膠有時又被稱為微生物氣溶膠,依其種類可劃分為細菌氣溶膠、真菌氣溶膠、病毒氣溶膠等。

2.2 生物氣溶膠的來源

由于空氣中缺少微生物直接可利用的養料,不能繁殖生長,因此空氣中無固有的微生物群系,其均由暫時懸浮于空氣中的塵埃攜帶著的微生物所構成,所以大氣生物氣溶膠主要來源于土壤、灰塵、江河湖海、動物、植物及人類本身。具有較大意義的生物氣溶膠的粒徑范圍是0.1μm～20.0μm。生物氣溶膠種類繁多,分布廣泛,涉及很多領域,與人類社會的關系較為密切。

2.3 生物氣溶膠的特點

體積小且無色無味,從而使得以此為施放形式的生物戰劑隱蔽性較強;易滲透,使其對應的生物戰劑難于防護,尤其是難于進行物理防護;易擴散,直接噴灑的生物氣溶膠可隨風飄到較遠地區,殺傷范圍可達數百至數千平方公里。

3 核酸檢測技術

微生物基因組內均含有特異的、有別于其他種或屬的核酸序列,這些特征序列相當于微生物的“身份證”或者“指紋”。利用核酸檢測技術檢測微生物樣品中的特征序列及豐度即可實現微生物的鑒別從而進一步檢測生物氣溶膠。

3.1 核酸雜交技術

核酸雜交技術依據堿基互補配對原理,將帶有標志物的核酸探針與被檢樣品中的目標核酸序列特異性地結合,然后利用特定手段測定標志物,通過確定樣品中目標核酸序列的豐度來實現對微生物的鑒別。如果以某種微生物的特征序列為探針,那么通過雜交技術就可以檢測樣品中是否含有該微生物。核酸雜交技術具有高特異性、高靈敏度的優點,能在幾分鐘至幾小時內檢測出pg水平的基因組DNA;利用熒光原位雜交還可以實現目標序列的定位與可視化。

如今,核酸雜交技術已經廣泛應用于致病微生物中,以生物氣溶膠形式施放的病毒、細菌、立克次體等多種生物戰劑都可以被成功檢測出來。

3.2 PCR技術

聚合酶鏈反應(PCR)是一種能在體外快速擴增特定基因片段的方法,即通過高溫變性、低溫退火、適溫延伸三個步驟,對寡核苷酸引物所界定的基因片段進行擴增,通過檢測出來的DNA和RNA來實現對微生物的鑒別。Haug-land第一次用PCR技術檢測了人工發生真菌Stachybotry chartarum的氣溶膠,檢測值與直接鏡檢和已知濃度值相符,證明PCR可以快速定量空氣中某種生物氣溶膠的濃度。隨后他又研究了真菌孢子不同DNA提取方法對PCR技術結果的影響。Cruz-perez研究了應用PCR技術檢測環境真菌的引物和探針,并評價了各種DNA純化方法對PCR技術檢測結果的影響。Sou-ichi人為地把炭疽直接加入到空氣微生物采樣液中,然后用PCR技術進行了分析,結果1個炭疽細胞在1小時內就可檢出。Yadav應用PCR技術直接檢測工作環境中導致職業病的分枝桿菌和假單孢菌的氣溶膠總數,用于對氣溶膠暴露的危險評估。Zeng用PCR技術檢測了農場環境空氣中walleniasebi并與培養計數方法進行了比較,發現PCR技術比培養計數法更靈敏,可以檢測出更小濃度的氣溶膠。由于生物氣溶膠沉降在物體表面可再次形成氣溶膠造成二次污染,Buttner研究了生物氣溶膠的二次污染對PCR技術的影響以及利用PCR技術檢測物體表面消毒前后污染菌的數量以評價消毒措施是否有效。

PCR技術具有特異、快速、靈敏度高并可對初始生物氣溶膠濃度進行定量分析,在生物氣溶膠的檢測中具有很好的應用前景。

如今,PCR技術及其改進技術(如熒光定量PCR技術、多重PCR技術等)已廣泛應用于致病微生物的檢測與鑒定領域。隨著自動化與集成化程度的提高,基于PCR技術的生物戰劑檢測裝備已開始應用于戰場。例如,Idah公司研制的耐用型病原菌檢測裝備能夠在30min內實現對炭疽菌、肉毒梭菌、布魯菌屬、沙門菌屬和李斯特菌屬等的檢測,目前已有40多個國家的軍隊配備了該裝備。

3.3 基因芯片技術

基因芯片技術的基本原理是利用核酸探針捕獲靶基因來識別生物體的種類。它通過平面微加工技術將大量的核酸探針有規律地排列固定于硅片或玻片等固相支持物上,構成二維探針陣列,用于捕獲預先經過熒光物質或核素標記的靶基因,再通過激光共聚焦顯微等技術對雜交信號進行實時、靈敏、準確的檢測與分析。該技術結合了微電子、微機械、化學合成、光學、計算機等一系列現代科學前沿技術,利用構建的基因芯片及其表面微流分析系統,快速、準確地完成對微生物的鑒定。2005年,Zhou等根據GenBank中SARS-CoV基因組序列,設計了靶向SARS-CoV保守序列的寡核苷酸探針,并將這些探針整合到70-mer基因芯片上,實現了對SARS-CoV的早期檢測。通過對臨床樣品的檢測結果表明,基于基因芯片的SARS-CoV早期檢測方法特異、有效,對SARS患者的檢測敏感性約為91%。2009年,Felder等建立了基于基因芯片技術檢測環境樣品中炭疽菌的方法,其構建的基因芯片包含靶向炭疽菌質粒毒力基因rpoB以及各亞型炭疽菌、蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌16S rDNA的寡核苷酸探針,并利用該芯片對158份環境樣品進行了檢測。結果表明:該方法可將炭疽菌與其他桿菌有效區分,整個檢測過程僅需12小時。

目前基因芯片已在生物戰劑氣溶膠檢測領域廣泛應用。多國權威媒體和刊物中都已有采用基因芯片技術檢測大腸埃希菌、霍亂弧菌、炭疽桿菌、鼠疫桿菌、西部馬腦炎病毒、出血熱病毒等和采用免疫芯片技術檢測葡萄球菌腸毒素的研究報道。

但是基因芯片的制作成本還很高,并且需要昂貴的檢測儀器,因此該技術主要局限于實驗室研究而未能廣泛應用于臨床致病微生物的檢測與鑒定。

3.4 核酸檢測技術特點分析

核酸檢測技術具有如下優點:和免疫學技術優點相同,該技術具有高特異性、高靈敏度的優點,能在幾分鐘至幾小時內檢測出pg水平的基因組DNA。

可是核酸檢測技術也有自身的缺陷:該技術本身的專業要求較高,導致形成裝備的難度偏大,一定程度上限制了該技術的應用。

3.5 國內外研究現狀

早在20世紀90年代初期,西方發達國家便已發明了以PCR技術為代表的核酸檢測技術。在隨后的20多年里,核酸檢測技術以其高特異性、高靈敏度的優點得到廣泛關注和良好發展。

汪曉輝等于1996年利用逆轉錄半套式PCR技術對風疹病毒氣溶膠進行檢測。但隨后,由于各種條件的限制,遲遲未能有創新進展,與西方發達國家的水平差距較大。

4 對我國研究生物氣溶膠檢測技術的幾點建議

通過對生物氣溶膠檢測技術國內外研究現狀的分析,本文認為國內生物氣溶膠檢測技術與發達國家相比,存在起步較晚、發展較慢、研究較淺、技術較為落后的問題。為提高我國生物氣溶膠檢測水平,需要做的工作還有很多,本文針對我國實際研究情況,提出以下建議。

4.1 加大對生物氣溶膠檢測技術的研究力度

我國對生物氣溶膠檢測技術的研究起步較晚,在人力物力投入方面明顯不夠,導致一些關鍵技術較發達國家相比落后較多。而隨著生物氣溶膠檢測技術向自動化、實時化、遠程化的趨勢發展,其在技術上的要求必定越來越高,這更是需要我國加大對此的研究力度,緊緊追蹤國外生物氣溶膠檢測技術的發展動態和前沿水平,將積極引進先進技術和自主研制有機結合起來,集中力量,聯合攻關,以期在不久的將來研究出具有國際先進水平和我軍特色的生物氣溶膠檢測技術。

4.2 重點發展核酸檢測技術

檢測生物氣溶膠的技術很多,遙測技術、免疫學技術、核酸技術、質譜技術、生物發光技術等。每種技術各有優缺點,從目前檢測技術發展的現狀來看,核酸檢測技術在分析時間、靈敏性、可靠性、特異性等方面均優于其他技術,結果如表1所示。

表1 各種檢測技術的比較

雖然核酸檢測技術有以上多方面的優勢,但是其對專業技術的要求較高,一些關鍵技術尚未得到優化,仍需廣大科研人員繼續攻堅克難。因此,本文認為我國的研究重點應放在核酸檢測技術上,做到優化技術,簡化流程,高效地完成對生物氣溶膠的檢測。

4.3 嘗試發展集多種檢測技術優點于一身的新型技術

生物氣溶膠的檢測已經發展為一個涉及多種學科與技術的系統工程,它包括遙測、免疫、核酸、質譜等多種技術。每種技術都含有其特定的優缺點,經研究發現,有時僅靠一種技術很難高效地完成對生物氣溶膠的檢測。因此,早在20世紀80年代美國等先進國家已開始研究由幾種技術、幾種儀器組成的JBPDS系統來解決某些復雜的生物氣溶膠檢測難題。我國應跟隨國際先進水平的步伐,嘗試發展集多種檢測技術優點于一身的新型技術,以期高效的完成對生物氣溶膠的檢測。

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Analysis of Biological Aerosoldetection Technology

HAN Lili QI Xiuli XU Li

(Institute of Chemical Defence, Beijing 102205)

Biological aerosol is composed of bacteria, fungi and viruses and is sometimes referred to as microbial aerosol. As a releasing form of most biological warfare agents, bioaerosol often plays an important role in the biological terrorist attacks. This paper based on the introduction to the definition, source, and the characteristics of the bioaerosol, summarizes the current biological aerosol detection technology. It also makes a deep analysis on the principles, strengths and weaknesses, the employment of equipment as well as the current research of each technology at home and abroad, and put forward suggestions on the detection of bioaerosol are put forward.

biological aerosol, nucleic acid testing technique, suggestions

2016年8月3日,

2016年9月17日

韓麗麗,女,碩士,講師,研究方向:生物防護與安全。齊秀麗,女,碩士,副教授,研究方向:生物防護與安全。徐莉,女,博士,副教授,研究方向:生物防護與安全。

X831

10.3969/j.issn.1672-9730.2017.02.005