靶向親和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)快速篩選黃藤總生物堿中乙酰膽堿酯酶抑制劑

何忠梅　呂娜　南敏倫　趙昱瑋　赫玉芳　孟令文　孫佳明　張連學(xué)

摘要采用靶向親和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) （Target molecule affinityLCESIMSn） 快速篩選黃藤總生物堿中能夠抑制乙酰膽堿酯酶活性的成分， 共篩選出12種具有潛在抑制乙酰膽堿酯酶的活性成分， 并鑒定了6種成分，分別為黃藤素 （Palmatine）、小檗堿 （Berberine）、藥根堿 （Jatrorrhizine）、巴馬汀紅堿 （Palmatrubine）、7，8二氫8羥基小檗堿 （7，8Dihydro8hydroxyberberine）、Groenlandicine，結(jié)合體外酶學(xué)實驗對這6種化合物進行了活性驗證實驗。結(jié)果表明，黃藤素抑制活性最強，其抑制作用強于陽性對照藥鹽酸多奈哌齊，說明黃藤素具有開發(fā)成抗阿爾茨海默癥藥物的潛力。本方法簡單、快速、準(zhǔn)確地從復(fù)雜的中藥提取物中篩選出具有抑制乙酰膽堿酯酶活性的成分，適用于復(fù)雜體系中的高通量篩選。

關(guān)鍵詞靶向親和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)； 黃藤總生物堿； 乙酰膽堿酯酶； 抑制劑

1引 言

阿爾茨海默病 （Alzheimer's disease， AD） 是以大腦中β淀粉樣蛋白老年斑 （SPs） 沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié) （Neurofibrillary tangles， NFTs） 和突觸及神經(jīng)元缺失為特征的一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，已成為威脅現(xiàn)代社會老年人健康的重大疾病之一[1]。針對AD的病理特征及病因所研發(fā)的藥物中， 乙酰膽堿酯酶抑制劑（AChEI）已廣泛用于臨床治療AD。AchEI通過抑制體內(nèi)AChE活性，減少乙酰膽堿分解，緩解AD對生活能力和認知能力的損害[2]。但已上市的AChEI如他克林、利斯的明等雖然有一定效果，但存在活性不強、副作用較大的缺點[3]。目前，從中藥中尋找具有選擇性強、副作用小的AChEI成為醫(yī)藥研究的熱點[4～6]，同時也是治療AD的研究中最活躍的領(lǐng)域。

黃藤為防己科天仙藤屬植物黃藤（Fibraurea recisa Pierre.）的藤莖，收載于2015年版藥典，具有清熱解毒、瀉火通便的功效，主要含有異喹啉類生物堿，具有抗真菌[7]、抗炎、抗腫瘤[8]等藥理作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[9]，黃藤總生物堿主要成分為黃藤素， 具有顯著抑制AChE活性的作用。

靶向親和技術(shù)主要利用親和原理，將待測的具有潛在活性的小分子混合物與生物活性受體（主要是酶類）在接近生理條件下的緩沖液中混合，得到受體配體復(fù)合物和未結(jié)合的小分子化合物，通過超濾除去未結(jié)合的小分子，復(fù)合物經(jīng)有機溶劑處理，將小分子配體釋放出來，再通過LCMS技術(shù)，直接或者間接檢測解離的復(fù)合物[10，11]。與傳統(tǒng)生物活性篩選方法即在化合物庫中逐一的篩選相比，此方法靈敏、快速，且不改變蛋白結(jié)構(gòu)， 可以高通量地篩選出活性化合物[12，13]， 已廣泛用于篩選與靶蛋白結(jié)合的藥物中[14]，成為藥物篩選的重要工具[6，15，16]。本研究采用靶向親和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)篩選黃藤中能夠抑制乙酰膽堿酯酶的活性成分，篩選出12種具有潛在抑制乙酰膽堿酯酶的活性成分，并鑒定了其中6種化合物，為建立中藥中乙酰膽堿酯酶抑制劑的快速篩選提供了科學(xué)依據(jù)。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Agilent 1100 series LCMSD液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司），包括：Agilent SL型多級離子阱質(zhì)譜儀、低壓四元梯度泵、二極管陣列檢測器（DAD）、自動進樣、柱溫箱、Chemistation化學(xué)工作站等； BS124S電子天平（美國賽多利斯公司）； MR96A自動酶標(biāo)儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）； XL90超速離心機（美國Beckman公司）； 旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器（蘇州培英實驗設(shè)備有限公司）； 尤尼柯UV2800紫外可見分光光度計（尤尼柯（上海）儀器有限公司）； RE5298型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

黃藤藥材購于安國市瑞泰堂藥材行，經(jīng)吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院趙全成研究員鑒定為防己科天仙藤屬植物黃藤（Fibraurea recisa Pierre.）的干燥藤莖； 黃藤素、鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿均購于中國食品藥品檢定研究院（批號分別為：0732200005、110733201007、110713200609）； 巴馬汀紅堿、7，8二氫8羥基小檗堿、Groenlandicine（自制，純度≥98%）。乙酰膽堿酯酶（來源于蒼蠅頭部， 上海源葉生物科技有限公司）； 碘化硫代乙酰膽堿（ATCI）、5，5二硫雙（2硝基苯甲酸）（DTNB）（美國Sigma公司）； 鹽酸多奈哌齊（衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司）； YM30離心超濾管（美國Millipore公司）； 24孔板，96孔板（美國Corning公司）； 乙睛、甲醇和甲酸均為色譜純（美國Fisher公司）； 實驗用水為娃哈哈純凈水； 其余試劑均為分析純。

2.2黃藤總生物堿樣品的制備

取黃藤藥材2 kg，用10倍量的60%乙醇回流提取2次，每次2 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮得浸膏228.3 g。將浸膏加水溶解，通過預(yù)先處理好的D101大孔樹脂柱（Φ100×10 cm），先用3倍柱體積水洗，再用8倍柱體積40%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇，干燥，得黃藤總生物堿50.6 g。

取黃藤總生物堿適量，加0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 8.0）溶解，制成1.0 mg/mL的溶液，用于超濾實驗和活性實驗分析。取黃藤總生物堿適量，加甲醇溶解并配制成0.1 mg/mL溶液，用于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析； 黃藤素、鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿、巴馬汀紅堿、7，8二氫8羥基小檗堿、Groenlandicine對照品用上述的0.1 mol/L PBS溶液配成1.0 mg/mL溶液，用于活性實驗分析。

2.3乙酰膽堿酯酶（AChE）活性抑制實驗

參照文獻[17]方法并做適當(dāng)調(diào)整，在96孔板中加入0. 1 mol/L PBS緩沖液（pH 8.0） 140 μL，待測樣品溶液20 μL和0.5 U/mL酶溶液15 μL，混勻，在4℃放置20 min。加入2 mmol/L DTNB 10 μL和15 mmol/L ATCI 10 μL，37℃反應(yīng)20 min，立刻測定405 nm處吸光度值。同時設(shè)立背景對照組和空白對照組。按下式計算酶活性抑制率（Enzyme activity inhibition ratio， EAIR）。

EAIR（%）=Ablank-（Asample-Abackground）Ablank×100%（1）

其中， Ablank表示不加樣品體系的吸光度值； Asample表示為加入樣品和酶的體系吸光度值； Abackground表示為不加酶的體系吸光度值。

樣品組設(shè)定5個等梯度濃度，重復(fù)實驗3次。以樣品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以AChE抑制率為縱坐標(biāo)，繪制曲線，計算IC50。

2.4離心超濾篩選方法

參照文獻[15，18]的方法，在24孔板中加入0.1 mol/L PBS緩沖液（pH 8.0）300 μL、1 mg/mL黃藤總生物堿溶液100 μL、0.5 U/mL乙酰膽堿酯酶的酶液100 μL，37℃孵育30 min，轉(zhuǎn)移至離心超濾管（YM30）中。12000 r/min離心20 min，加PBS緩沖液重復(fù)3次，每次500 μL，棄去離心液，再向超濾管中加入90%（V/V）甲醇500 μL，室溫放置10 min后，離心15 min，重復(fù)3次，合并離心液，冷凍干燥后加40 μL甲醇/水（50∶50， V/V）溶解，用于LCMS/MS分析。同時設(shè)立空白對照組和陽性對照組。

同時，為了考察酶與底物的相互作用強度，設(shè)置了滅活酶的對照實驗。AChE經(jīng)100℃熱滅活后，通過AChE的抑制率實驗確定酶已失活。并稱取等量的滅活酶同法處理進行實驗，求出結(jié)合率（Binding degree， BD）[19]。

BD（%）= （Ab-Ac） /Aa×100%（2）

其中， Aa表示親和離心超濾篩選前黃藤總生物堿溶液各化合物色譜峰面積； Ab表示親和作用后活性酶結(jié)合的各相對應(yīng)化合物的色譜峰面積； Ac表示變性失活酶結(jié)合的各相對應(yīng)化合物的色譜峰面積。

2.5色譜與質(zhì)譜條件

液相色譜條件： ACE C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm， 5 μm）； 流動相： 乙腈0.1% H2PO4（每100 mL中加0.1 g 十二烷基硫酸鈉）=36∶64（V/V）； 流速： 1 mL/min； 檢測波長： 345 nm； 柱溫： 30℃； 進樣量： 10 μL。

質(zhì)譜條件： 電噴霧離子源（ESI）； 正離子模式同時采集； 掃描范圍m/z 50～1200； 目標(biāo)分子量： 350 Da； 干燥氣溫度： 350℃； 干燥氣流量： 10.0 L/min； 霧化氣壓強： 0.24 MPa； 毛細管電壓： 4 kV。

3結(jié)果與討論

3.1黃藤總生物堿的含量測定結(jié)果

參照文獻[20]中總生物堿的測定方法，以黃藤素為對照品，采用0.05%溴甲酚綠為酸性染料進行染色，在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行掃描，最終選擇在345 nm測得2.2項下制備的樣品中總生物堿的含量為97.5%。說明制備的樣品主要成分為生物堿類成分，本研究所建立的提取方法可以作為黃藤總生物堿的提取方法。

3.2黃藤總生物堿的靶向親和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析

黃藤總生物堿經(jīng)親和超濾實驗共篩選出12種可能的AChE抑制劑（見圖1A）。與黃藤總生物堿原溶液的HPLC色譜圖（圖1B）相比，在超濾實驗條件下黃藤總生物堿中只有部分化合物能夠與乙酰膽堿酯酶結(jié)合。并且與不加酶的空白對照試驗的HPLC色譜圖相比，說明本方法可以有效地避免由小分子化合物吸附到超濾膜上而造成假陽性（圖1C）。 進行了黃藤總生物堿與滅活的乙酰膽堿酯酶的結(jié)合實驗，依據(jù)色譜峰的峰面積與其在緩沖溶液中的濃度成正比，利用圖1B和1D的HPLC色譜圖中峰面積的變化情況來反映其對應(yīng)的化合物與AChE的結(jié)合率[12]，求出各化合物與AChE的結(jié)合率均大于13.00%，這表明黃藤總生物堿中的活性成分能夠與AChE有效結(jié)合（圖1D）。對陽性對照藥鹽酸多奈哌齊進行了超濾實驗（見圖1E），結(jié)果表明， 超濾實驗方法可行，具有較強的準(zhǔn)確性。

采用HPLCDADESIMS2聯(lián)用技術(shù)，在正離子模式下，通過自動二級質(zhì)譜方式同時獲取樣品中生物堿類成分的一級和二級質(zhì)譜圖，根據(jù)每一成分的色譜保留時間、準(zhǔn)分子離子峰和二級質(zhì)譜碎片信息，參照ESIMSn數(shù)據(jù)、標(biāo)準(zhǔn)對照品及文獻[7，21～23]數(shù)據(jù)進行對比，對其結(jié)構(gòu)進行鑒定，確定了黃藤總生物堿中12種可能的AChE抑制劑，并且鑒定了其中6種化合物的的結(jié)構(gòu)，分析結(jié)果見表1。

AbstractA target molecule affinityultrafiltration liquid chromatographyelectrospray ionization tandem mass spectrometric （LCESIMSn） method was established for rapid screening acetylcholinesterase （AChE） inhibitors from total alkaloids of fibraurea recisa Pierre. A total of 12 potential inhibitors were screened from Fibraurea recisa Pierre. and 6 compounds were identified including palmatine， berberine， jatrorrhizine， palmatrubine， 7，8dihydro8hydroxyberberine and groenlandicine. The AChE inhibitory activity of these 6 compounds was validated in vitro. Palmatine showed the strongest inhibitory activity for AChE， which was stronger than that of donepezil hydrochloride， demonstrating the potential of palmatine as antiAlzheimer's drug. This method is simple， rapid， and accurate for directly screening active ingredients which can inhibit AChE from complex extract of traditional Chinese medicines.

KeywordsTarget molecule affinityliquid chromatographytandem mass spectrometry； Total alkaloids of Fibraurea recisa Pierre.； Acetylcholinesterase； Inhibitor.