海水中硝酸鹽的無閥連續流動分析

林坤寧　馬劍　袁東星　黃勇明　馮思超　吳巧玲

摘要建立了一種無閥連續流動分析方法和裝置，僅用一臺多通道蠕動泵傳送試劑和樣品，無需依靠注入閥、電磁閥和定量環進行試劑或樣品的選擇和定量輸入。樣品通過銅鎘還原柱，將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，然后用重氮偶氮光度法進行測定。研究結果表明，硝酸鹽的線性范圍為5～180 μmol/L，方法檢出限為0.27 μmol/L，對10 和80 μmol/L硝酸鹽溶液連續測定11次，相對標準偏差分別為1.4%和1.3%，不同鹽度的實際水樣加標回收率在99.4%～106.1%之間。測定結果與流動注射分析法相比，無顯著性差異。與流動注射分析相比，無閥設計裝置大大降低了成本，操作更加簡便，有利于在普通實驗室或現場連續監測中推廣使用。本方法成功應用于廈門西港海水樣品中硝酸鹽的測定以及九龍江河口區的硝酸鹽走航式監測。

關鍵詞 無閥； 連續流動分析； 海水； 硝酸鹽

1引 言

硝酸鹽作為一種常見的營養鹽，廣泛存在于各種水體中。過多的硝酸鹽進入水環境，會導致水體富營養化[1]，因此檢測海水中的硝酸鹽含量具有重要意義?！逗Ｑ蟊O測規范》中規定，利用手工操作將樣品通過銅鎘還原柱，將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，然后以重氮偶氮光度法進行測定[2]。該方法的還原效率高，但操作過程繁瑣、耗時長，且手工操作帶來的人為誤差大，不適合大量樣品的快速和現場分析。目前，已有商品化的營養鹽自動分析儀，如德國的BRAN+LUEBBE AutoAnalyzer 3、荷蘭的SKALAR等[3，4]，這些儀器基于氣泡間隔連續流動分析（Segmented continous flow analysis， SCFA）技術，自動化程度高，分析速度較快，但儀器價格昂貴?，F今，流動注射分析（Flow injection analysis， FIA）技術在海水水質監測中得到了廣泛開發和應用，基于FIA原理研發了硝酸鹽測定系統[5～7]，這些系統均使用了注入閥（Injection valve）或電磁閥（Solenoid valve）進行試樣或試劑的定量，以提高分析的精密度以及重現性。但各種閥的價格較高，且控制程序復雜，不利于普通實驗室的推廣及應用。如能以某種裝置或方式取代閥，一定程度上將降低實驗成本，簡化控制程序。目前，有研究者利用注射泵定量地將試劑注入樣品，同時測定了4種金屬元素，但其利用的化學反應只需單一試劑[8]。而對于需用銅鎘還原柱還原硝酸鹽的測定，單一試劑顯然不能滿足分析要求。為了注入多種試劑，閥的使用不可缺少[9，10]。

本課題組研發了一種無閥連續流動分析系統[11]，利用連續流動的方式，直接將試劑與樣品混合，不需要閥，但會在流路中引入大量氣泡； 獨特的流通池結構設計可避免流路中氣泡對檢測信號的影響，已成功應用于亞硝酸鹽、磷酸鹽和硅酸鹽的測定。但對于采用銅鎘還原柱還原硝酸鹽的測定，進入還原柱的氣泡會使得鍍在鎘表面的銅發生氧化，大大影響硝酸鹽的還原效率。本研究對上述原先的系統進行改進，在還原柱的前端增加一個除氣泡裝置，可有效去除切換樣品時產生的氣泡，避免氣泡進入還原柱。改進后的系統成功用于廈門西港海水樣品中硝酸鹽的測定以及九龍江河口區的硝酸鹽走航式監測。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

USB 2000+光纖光譜儀和LS1LL鹵鎢燈光源（美國Ocean Optics公司）； BT1001L型六通道蠕動泵、內徑 0.5 mm和2.0 mm硅橡膠蠕動泵泵管（保定蘭格恒流泵有限公司）； 流路管道為內徑1.0 mm的聚四氟乙烯管（Polytetrafluoroethylene， PTFE）； 數據采集軟件使用Labview 8.2（美國National Instruments公司）編寫； 實驗室自制流通池（光程1.2 cm）。

實驗用水為超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm， MilliQ Element系統， 美國Millipore公司）。如無特別說明，所用試劑均為國藥集團化學試劑有限公司生產的分析純試劑。100 mmol/L硝酸鹽貯備液：稱取1.0100 g經110℃干燥2 h 的KNO3，溶解并定容至100 mL，于4℃保存，標準工作溶液由此貯備液經適當稀釋得到。混合顯色試劑：2.5 g磺胺（Sulfonamide， SAM）溶于450 mL 5%（V/V）HCl（優級純）中，加入0.25 g鹽酸萘乙二胺（N（1Naphthyl） ethylenediamine dihydrochloride， NED），以5%（V/V）HCl定容至500 mL。人工海水（鹽度35）：稱取31 g NaCl和10 g Mg2SO4，溶于超純水中，并稀釋至1 L，貯存于聚乙烯瓶中，其它鹽度的人工海水由此稀釋得到。NH4ClNaOH緩沖溶液（2.5%， m/V）用5 mol/L NaOH溶液調節至pH 8.3。

2.2實驗方法

無閥連續流動分析系統的流路如圖1所示，主要由兩個蠕動泵組成。蠕動泵1將樣品以較快流速輸送到除氣泡裝置中，完成一次進樣后手動切換至超純水，進行清洗，切換過程因蠕動泵1持續運轉而在管道中引入的氣泡在除氣泡裝置中被除去。除氣泡裝置中存留的樣品溶液由流速較慢的蠕動泵2吸取，多余的樣品經蠕動泵1吸取排出。蠕動泵2吸取的樣品溶液與緩沖溶液混合后進入銅鎘還原柱，將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。 實驗中使用的流通池為實驗室自行研制[11]， 容積較大，需保證適量試樣充滿流通池進行檢測。但是，若將大量試樣直接通過銅鎘還原柱，會降低還原柱的使用壽命?？紤]到江河及近岸海域的硝酸鹽濃度通常較高，對樣品進行適當稀釋后仍可準確定量，因此，將少量還原后的樣品與超純水混合，稀釋后再與混合顯色劑混合，進入置于水浴鍋中的反應盤管，最后流入流通池測定。

2.3樣品采集

廈門西港表層海水樣品于2015年12月26日用PVC采樣桶采集，裝于250 mL聚乙烯瓶并冷藏保存，24 h內測定。

九龍江河口區域的走航式監測，于2016年4月9日在廈門大學“海洋2號”科考船上執行，用船上配備的海水采集設備將表層海水抽至甲板上的自制過濾裝置中，經0.45 μm濾膜過濾后與本套裝置聯用。走航過程中，用100 mL聚乙烯瓶人工采集數個過濾后的樣品并冷藏保存，記錄采樣時間，用于實驗室比對分析。

3結果與討論

3.1實驗參數的優化

本裝置用蠕動泵作為輸液動力，使水樣通過銅鎘還原柱，將硝酸鹽定量還原為亞硝酸鹽，然后與顯色劑混合。在酸性介質中，亞硝酸鹽與顯色劑中的SAM進行重氮化反應，其產物再與NED偶合生成紅色偶氮染料，于543 nm波長下測定吸光值。通過計算，得到亞硝酸鹽氮的總量，扣除水樣中原有的亞硝酸鹽含量，得到硝酸鹽含量。本研究中亞硝酸鹽含量由另一通道（不含銅鎘還原柱）測定得到。實際環境監測中，硝酸鹽含量和亞硝酸鹽含量是同時獲得的。

在前期研究[11]中，已對亞硝酸鹽測定的各參數進行了優化，包括進樣時間、顯色試劑濃度、反應盤管長度、流速、反應溫度等，本實驗優化了進樣時間和顯色試劑濃度。反應盤管長度為2.5 m，反應溫度為50℃?？紤]到水樣過銅鎘柱時將產生一定柱壓及保證還原效率，流速調整為9.5 mL/min。 優化實驗以含20 μmol/L 硝酸鹽的純水加標試樣作為測試樣，所有樣品均測定至少3次，優化結果見圖2。

保持SAM濃度為5 g/L，NED濃度為0.5 g/L不變，對樣品進樣時間進行優化。進樣時間依次為5， 10， 15， 20， 25， 30， 35， 40和45 s，隨著進樣時間延長，硝酸鹽的信號吸光值增加，并在35 s后峰高基本保持穩定，如圖2A所示。綜合考慮分析速度和峰形等因素，最佳進樣時間選擇為35 s，此時樣品通過銅鎘柱的體積為4.0 mL。保持進樣時間為35 s不變，考察顯色試劑濃度對硝酸鹽的信號吸光值的影響。隨著試劑濃度增加，信號吸光值增加，當試劑濃度達到一定量時，吸光值基本穩定。最終選擇顯色試劑濃度分別為： 5 g/L SAM， 0.5 g/L NED（圖2B和2C）。

3.3鹽度的影響

樣品的鹽度越大則離子強度越高，而高離子強度會影響化學反應速率，從而影響方法靈敏度。為了考察鹽度對本方法的影響，取鹽度為35的人工海水，用超純水稀釋后得到鹽度分別為0， 7， 14， 21， 28和35的人工海水。以這些不同鹽度的人工海水作為基底，分別配制工作曲線溶液，繪制相應的工作曲線。6條工作曲線線性相關系數R2在0.9979～0.9995之間，斜率的RSD在±2.5%之內，表明鹽度對本方法的影響可以忽略的，本方法適用于河口及近岸鹽度變化大的區域，也可用于江、河、湖等地表水中硝酸鹽的分析。

3.4記憶效應的影響

在流動分析系統中，高濃度樣品的顯色產物若清洗不完全，可能會對下一個樣品的測定產生影響，故記憶效應值得關注。參照文獻[13]的方法，考察了記憶效應對本方法的影響。取80 μmol/L硝酸鹽為高濃度試樣，連續測定3次，平均吸光值為0.4881±0.0031（RSD=0.6%）； 隨后，取10 μmol/L硝酸鹽為低濃度試樣，連續測定4次，平均吸光值為0.0538±0.0002（RSD=0.7%）； 再次測定高濃度試樣，平均吸光值為0.4879±0.0049（RSD=1.0%）； 最后測定低濃度試樣，平均吸光值為0.0531±0.0005（RSD=1.6%）。實驗結果表明，80 μmol/L硝酸鹽前后多次測定的吸光值為0.4880±0.0036（RSD=0.8%），10 μmol/L硝酸鹽前后多次測定的吸光值為0.0534±0.0007（RSD=1.3%）?？梢姡邼舛仍嚇踊静粫ο乱粋€較低濃度試樣的測定產生影響，記憶效應可以忽略。

3.5方法的驗證與比對

用本方法測定各種實際水樣中的硝酸鹽，并進行基底加標，考察基底加標回收率，結果見表1。 加標回收率在99.4%±3.4%～106.1%±0.2%之間，說明本方法適合用于不同基底樣品的分析，再次證明方法的廣泛適用性。

3.6方法的應用

用本方法測定采自廈門西港的表層海水樣品，測定結果見表2。調查海域的表層海水中，高潮時硝酸鹽濃度在59.84～103.2 μmol/L之間，低潮時硝酸鹽濃度在86.74～177.3 μmol/L之間，低潮時受九龍江水帶來的陸源營養鹽的影響，硝酸鹽的濃度較高。

2016年4月9日，應用本方法與本課題組前期研發的其它營養鹽測定方法[11]，對九龍江河口及廈門近岸海域中的硝酸鹽進行了走航式監測。走航中同時采集數個水樣，帶回實驗室進行比對測試。

此次走航式監測同時獲得了硝酸鹽、亞硝酸鹽、活性磷酸鹽、活性硅酸鹽的高分辨率濃度數據，見圖5。監測數據表明，各營養鹽濃度與鹽度具有良好的相關性，且各營養鹽濃度的變化規律也較為一致。實驗室分析人工采集的樣品，得到的數據與現場測定值基本吻合，結果見圖5。

4結 論

建立了無閥連續分析海水中硝酸鹽的方法，簡單、快速、實用，且不受海水鹽度的影響。在優化條件下，本方法檢出限為0.27 μmol/L，平行性良好，與流動注射法相比，測定結果無顯著性差異，但成本更低，操作更簡便。

本方法已成功用于離散樣品測定以及走航式在線連續監測，證明其實用性強，可在普通實驗室推廣使用，有望發展成為現場監測儀器。

AbstractA valvefree continuous flow method and instrument were established， with only a multichannel pump for delivering the sample and reagent， and without any injection or solenoid valves and sample loop for selecting and adding the sample or reagent. Nitrate was reduced to nitrite with CuCd reductant column， and then detected with spectrophotometric detector. The proposed method was suitable for determination of nitrate at normal level in most of estuary and coastal seawaters. With the optimum parameters， the linear range and detection limit were 5-180 μmol/L and 0.27 μmol/L， respectively. The samples of 10 and 80 μmol/L nitrate were continually measured for 11 times， and the relative standard deviations were 1.4% and 1.3%， respectively. The recovery of real samples at different salinity ranged between 99.4% and 106.1%. There was no significant difference in the analytical results between the proposed method and the flow injection analysis （FIA）. In comparison with FIA， the method and instrument were less cost and easy to operate， and was suitable to be applied in general laboratories and field for continuous monitoring. The method was successfully used to measure the nitrate in seawater samples in Xiamen's Western Harbor and monitor nitrate in Jiulongjiang estuary.

KeywordsValvefree； Continuous flow analysis； Seawater； Nitrate