北方旱寒區冬油菜抗寒性相關指標的QTL定位

武軍艷，孔德晶，方彥，孫萬倉，劉海卿，劉自剛，李學才

（甘肅農業大學農學院，甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室，甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅蘭州730070）

北方旱寒區冬油菜抗寒性相關指標的QTL定位

武軍艷，孔德晶，方彥，孫萬倉，劉海卿，劉自剛，李學才

（甘肅農業大學農學院，甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室，甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅蘭州730070）

以抗寒性不同的白菜型冬油菜品種隴油7號與隴油9號為親本構建的F2群體為材料，對白菜型冬油菜抗寒性相關的生理指標進行了QTL定位分析。在白菜型油菜的10條染色體上定位了SOD活性、POD活性、CAT活性、MDA含量、游離脯氨酸含量和可溶性蛋白含量共6個性狀的24個QTL位點，可解釋表型變異為11.1783%～81.1753%；10個顯性效應表現為顯性正效應，LOD值在3.2787～163.7958之間。染色體2A的BrID90127－BrID10421區、BrID10421－BrID10709區及BrID10709－BrID101165區，5A的BRMS034（R5）－Ra3－H10區、6A的Ra1－F06－Ra2－D04區、8A的BrID10839－Ra2－E12區和10A的BrID90115－Ra2－E07區是多個性狀QTL共享的標記區間。研究結果對冬油菜抗寒性基因精確定位具有一定價值。

白菜型冬油菜；抗寒性；QTL；北方旱寒區

低溫是影響北方旱寒區冬油菜安全越冬的主要因素之一［1－3］。由于白菜型冬油菜抗寒性顯著強于甘藍型冬油菜［4］，因此，對白菜型冬油菜抗寒性的研究是北方旱寒區冬油菜遺傳育種研究的主要方向。目前對白菜型冬油菜的研究主要集中在品種的適應性、生長發育特性、產量及經濟特性［5－7］、相關抗寒基因克隆及表達分析等方面［8］。此外也有對構建白菜型油菜連鎖圖譜和白菜型油菜幼苗絨霉病的基因定位研究，如Wei Li等［9］利用分子標記技術對白菜型油菜連鎖圖譜的構建，為白菜型油菜基因序列和遺傳信息的研究提供依據；Yu SC等［10］利用分子標記技術對白菜型油菜幼苗絨霉病進行QTL定位的研究。而對白菜型冬油菜抗寒性相關分析及抗寒性遺傳的研究鮮見報道。

本研究以超強抗寒性品種隴油7號和冬油菜品種隴油9號為親本組配的F2群體為試驗材料，利用SSR和InDel標記來繪制分子標記的遺傳圖譜，并利用QTL IciMapping V3.3軟件對白菜型冬油菜抗寒性的相關性狀進行QTL定位，分析QTL的效應，揭示白菜型冬油菜抗寒性相關性狀的分子機制，為白菜型冬油菜后期抗寒性基因的精確定位、基因克隆及分子標記輔助選擇等研究工作奠定基礎。同時，油菜在整個生育期內，會受到冬前與冬后兩重低溫的影響，研究油菜的抗寒性，不僅對于我國北方旱寒區冬油菜抗寒性具有重要應用價值，同時對提高我國其他冬油菜品種類型的抗寒性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為白菜型冬油菜，隴油7號與隴油9號組配雜交組合，構建F2群體，得到103個單株，母本隴油7號為超強抗寒性品種，父本隴油9號為中抗寒性品種。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取取油菜3葉期幼嫩葉片，用CTAB法對基因組DNA進行提取［11］。

1.2.2 F2群體抗寒性鑒定對F2群體的抗寒性鑒定主要依據越冬率（冬后存活情況）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、游離脯氨酸和可溶性蛋白等生理生化指標。其具體鑒定方法及結果已于2014年報道，詳見文獻［12］。

1.2.3 分子標記分析根據www.UK crop.net發表的油菜微衛星引物序列以及Brassica Database網站上選出均勻分布于白菜型冬油菜10對染色體上的51對SSR引物和264對InDel引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成。用315對引物在親本材料中進行多態性篩選，篩選結果用6%變性或非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色，讀取條帶。

1.2.4 遺傳圖譜繪制和QTL作圖用篩選出的在親本有多態性的引物對F2群體進行掃描，與親本隴油7號相同帶型記為“A”，與親本隴油9號相同帶型記為“B”，雜合體記為“H”，缺失的帶型記為“－”。分子標記的遺傳圖譜構建和QTL分析，采用QTL IciMapping V3.3軟件進行。

1.2.5 QTL命名方法按照“QTL＋性狀＋單位（機構）＋染色體”命名。其中，QTL以“Q”表示，性狀和單位以英文縮寫表示，染色體以白菜型冬油菜染色體的名稱表示，性狀與單位間加“.”，性狀和染色體之間加“－”。如Qsod.gsau－1A表示位于1A染色體上SOD活性（SOD activity）的QTL，gsau為Gansu Agricultural University的縮寫。

2 結果與分析

2.1 分子標記在親本及F2群體中的多態性篩選

用264對引物在親本隴油7號和隴油9號中篩選，選出39對在親本間表現出明顯多態性的引物（表1，圖2）。篩選到的引物對F2群體的單株分別進行PCR擴增（圖2），均能擴增出差異性條帶。

表1 39個標記在染色體上的分布Table 1 Distribution of39markers on the chromosomes

2.2 白菜型冬油菜抗寒性相關性狀QTL分析

結合抗性鑒定結果和分子標記結果，在白菜型冬油菜1A、2A、3A、5A、6A、7A、8A及10A等8條染色體上共檢測到SOD活性、POD活性、CAT活性、MDA含量、游離脯氨酸和可溶性蛋白含量共6個性狀的24個QTL（表2）。10個顯性效應表現為顯性正效應，LOD值在3.2787～163.7958之間。24個QTL中，Qsod.gsau－6A－2可解釋的表型值為最高，達到81.1753%，Qmda.gsau－8A的表型效應值最低，為11.1783%。2A、6A的染色體上所檢測到的QTL相對較多。在6個性狀中，所檢測到控制SOD的QTL數量最多，有12個QTL，可解釋表型變異率的12.0537%～81.1753%。其次是CAT、游離脯氨酸和可溶性蛋白，它們均檢測到3個QTL，表型效應值的解釋率分別為37.3135%～39.2403%、52.2419%～61.4756%、12.4599%～21.9624%（圖3）。

圖1 部分引物在親本間篩選結果Fig.1 Screening for primers for cross parents

圖2 引物BrID101147在F2作圖群體中的檢測結果Fig.2 InDel amplification of primer BrID101147

控制白菜型油菜抗寒性相關性狀QTL在染色體上分布不均勻，在有些染色體的某些區段上，形成了QTL的熱點區域。有些抗寒性相關的QTL在2A、5A、6A和10A上存在一些共享的標記區間。如控制SOD活性、CAT活性和可溶性蛋白的QTL，它們共享2A染色體的BrID90127－BrID10421區域，2A染色體的BrID10421－BrID10709區域，同時控制著SOD活性和CAT活性的QTL，SOD活性、游離脯氨酸和可溶性蛋白的QTL，它們共享2A染色體的BrID10709－BrID101165區域；5A的BRMS034（R5）－Ra3－H10區域同時控制SOD活性的2個QTL；同時，在6A染色體上，亦有2個SOD活性的QTL被Ra1－F06－Ra2－D04區域同時控制；MDA和可溶性蛋白的QTL共享了染色體8A的BrID10839－Ra2－E12區間；10A的BrID90115－Ra2－E07區域同時在控制SOD活性和POD活性的QTL。

3 討論

Song等［13］用F2群體構建了第一張白菜的RFLP遺傳圖譜，含有280個標記，總遺傳圖距為1 850 cm，這項研究使白菜及白菜型油菜的各數量性狀的QTL成為可能。在抗逆性研究方面，主要集中在油菜抗病性的QTL研究上，并且報道的大多數是甘藍型油菜；如甘藍型油菜抗根腫病［14］、抗黑脛病［15］、抗菌核病［16］的QTL定位。對白菜型油菜的QTL定位研究報道很少，對白菜型油菜抗寒性的QTL定位研究目前未見報道。

圖3 各指標相關QTLs在染色體上的位置Fig.3 The location of QTLs on the chromosomes

表2 白菜型冬油菜抗寒性相關性狀的QTLTable 2 QTLs associated with cold resistance in winter rapeseed

本研究以超強抗寒品種隴油7號和中抗寒品種隴油9號為親本，構建得到一個含有103個株系的F2群體。對F2群體的單株進行統計分析，共檢測到關于SOD活性、POD活性、CAT活性、MDA含量、游離脯氨酸含量和可溶性蛋白含量共6個性狀的24個QTL，涉及1A、2A、3A、5A、6A、7A、8A和10A等8條染色體，這表明本研究中抗寒相關的位點可能位于這些染色體上，這與張學賢［17］的研究結果部分相似。在24個QTL中，表現為加性正效應的有17個，說明來自母本隴油7號等位基因的貢獻較大。同時，在白菜型油菜2A、5A、6A、8A和10A的染色體上存在一些共享標記區間。染色體上檢測的7個區間是不同抗寒性相關性狀QTL的共享區域。

由于植物的抗寒性是一個由多基因控制表達的性狀［18－20］，目前對植物抗寒性QTL相關方面的研究較少。巨偉等［21］通過對冬小麥苗期抗寒性狀的QTL分析研究，將冬小麥的抗寒性基因定位到了5B染色體的某一段區間內；丁成龍等［22］通過對結縷草抗寒性狀相關的QTL研究，檢測到了3個與抗寒性相關的QTL。但是這些研究結果都還未將抗寒性基因精確定位。本研究共檢測到24個QTL位點，且分別分布于白菜型冬油菜的8條染色體上，抗寒性基因具體位于哪條染色體的哪些區段，還有待于進一步研究證實。

另外，本試驗結果為一年在一個點的試驗結果。為了保證QTL定位的準確性，還需嚴格地對影響性狀的環境進行控制，因此應進行多年、多點試驗來相互驗證。本試驗進一步的工作可以通過擴大分析群體，增加相對電導率的分析，增加不同年份與不同生態壞境的抗寒性分析，提高遺傳圖譜密度，進行精細定位研究。

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QTL analysis of cold tolerance for physiological traits of w inter rapeseed in northern arid-cold area

WU Jun-yan，KONG De-jing，FANG Yan，SUNWan-cang，LIU Hai-qing，LIU Zi-gang，LIXue-cai
（College of Agronomy，Gɑnsu Agriculturɑl University，Gɑnsu Key Lɑb of Crop Improvementɑnd Germplɑsm Enhɑncement，Gɑnsu Provinciɑl Key Lɑborɑtory of Aridlɑnd Crop Science，Lɑnzhou，Gɑnsu 730070，Chinɑ）

The superior cold resistance B.rapa variety“Longyou 7”and general cold variety“Longyou 9”were used as parents and a F2mapping population was constructed.The results showed that39 primerswere selected for further analysis of F2population.Based onmolecularmarker geneticmap and QTL software，a totalof24QTLswere detected for SOD activity，POD activity，CAT activity，MDA content，free proline content and soluble protein content from 10 chromosomes.Those QTLswere able to explain 11.1783%～81.1753%of phenotypic variation.The dominanteffectsof 10 QTLs were positive effects，LOD values were between 3.2787～163.7958.The data showed that the regions BrID90127－BrID10421，BrID10421－BrID10709 and BrID10709－BrID101165 on 2A，BRMS034（R5）－Ra3－H10 on 5A，Ra1－F06－Ra2－D04 on 6A，BrID10839－Ra2－E12 on 8A，BrID90115－Ra2－E07 on 10A were common regions shared bymulti-traits.The result of present study is useful for the accurate position ofwinter rapa.

winter rapeseed（BrɑssicɑrɑpɑL.）；cold resistance；QTL；northern arid-cold area

S565.4

：A

1000-7601（2017）01-0205-06

10.7606／j.issn.1000-7601.2017.01.31

2016-01-06

甘肅省青年科技基金計劃（145RJYA253）；農業部產業技術體系建設資金項目（CARS－13）；甘肅省自然科學基金項目（145RJZG050）

武軍艷（1981—），女，甘肅平川人，講師，在讀博士，主要從事油菜的育種工作。E-mail：wujuny＠gsau.edu.cn。

孫萬倉（1957—），男，教授，博士，主要從事油菜的育種工作。E-mail：18293121851＠163.com.cn。