麻風樹脂肪酸去飽和酶7基因的克隆及生物信息學分析

王海波， 郭俊云， 劉 潮， 高 永

(1.曲靖師范學院云南高原生物資源保護與利用研究中心，云南曲靖 655011； 2.曲靖師范學院生物資源與食品工程學院，云南曲靖 655011；3.云南省高校云貴高原動植物多樣性及生態適應性進化重點實驗室，云南曲靖 655011)

麻風樹脂肪酸去飽和酶7基因的克隆及生物信息學分析

王海波1，2，3， 郭俊云2， 劉 潮1，2，3， 高 永1，2，3

(1.曲靖師范學院云南高原生物資源保護與利用研究中心，云南曲靖 655011； 2.曲靖師范學院生物資源與食品工程學院，云南曲靖 655011；3.云南省高校云貴高原動植物多樣性及生態適應性進化重點實驗室，云南曲靖 655011)

質體型ω-3(Δ15)脂肪酸去飽和酶(FAD7)是多不飽和脂肪酸合成途徑中催化亞油酸(Δ9，12-C18 ∶2)形成α-亞麻酸(Δ9，12，15-C18 ∶3，ALA)的關鍵酶。基于麻風樹低溫鍛煉轉錄組數據，通過逆轉錄PCR(RT-PCR)技術克隆到麻風樹FAD7基因的全長cDNA，命名為JcFAD7。結果表明，該cDNA序列全長1 796 bp，完整開放閱讀框1 341 bp，編碼446個氨基酸，理論分子量為51.1 ku，等電點為8.92。序列分析表明，JcFAD7編碼蛋白包含膜結合FAD蛋白的4個跨膜區、2個膜嵌合區、1個亞鐵血紅素結合基序及3個組氨酸簇等特征區域。構建系統進化樹顯示，麻風樹 JcFAD7 蛋白與芍藥(Paeonialactiflora)的親緣關系最近。

麻風樹；脂肪酸去飽和酶7(FAD7)；基因克隆；生物信息學分析

麻風樹(JatrophacurcasL.)為喜溫植物，原產于熱帶及亞熱帶地區[1-2]，可形成優勢種群落，現廣布于25°N～25°S之間，在我國云南、廣西、四川、廣東、海南等省(區)多有野生種分布[2-3]。因其種子具有含油量高、油質好、可生產生物柴油等優點，成為具有巨大開發潛力的能源樹種。溫度是影響麻風樹地域分布的主要限制因素，10 ℃以下低溫對麻風樹有致命的傷害[4-5]，可嚴重影響麻風樹的產量、分布及其產業的發展。因此，弄清麻風樹低溫冷害與抗冷性機制，進而培育抗冷新品種，對于麻風樹的基礎與應用研究都有重要意義。

細胞膜的流動性和穩定性是細胞乃至整個植物體賴以生存的基礎[6]，細胞膜不僅是植物低溫傷害的原初部位，也是植物細胞感受低溫的首要結構元件。大量研究證實，膜系中脂肪酸的不飽和度或膜流動性與植物抗冷性密切相關。膜脂的不飽和脂肪酸比例越大，膜流動性越強，植物的相變溫度越低，抗冷性越強[7-8]。高等植物不飽和脂肪酸生物合成始于質體基質中的棕櫚酰-ACP(palmitoyl-ACP，C16 ∶0)和硬脂酰-ACP(stearic-ACP，C18 ∶0)，硬脂酰-ACP被質體中可溶性硬脂酰-ACP去飽和酶(stearic-ACP desaturase，簡稱SAD或FAD1)催化形成油酰-ACP(oleic-ACP，Δ9-C18 ∶1)[9]。棕櫚酰-ACP與油酰-ACP隨后繼續在質體內或被運往內質網形成甘油酯，而棕櫚酰-ACP被定位于質體膜上的棕櫚酰-ACP去飽和酶(palmitoyl-ACP desaturase，簡稱FAD4或FAD5，屬ω-6系列的膜整合蛋白)催化形成棕櫚油酰-ACP(palmitoleoyl-ACP，Δ9-C16 ∶1)。單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid，簡稱MUFA)分別由與內質網或質體膜結合的ω-6(Δ12)、ω-3(Δ15)脂肪酸去飽和酶(fatty acid desaturase，簡稱FAD)作用進一步去飽和，生成多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，簡稱PUFA)的甘油酯[10]。催化多不飽和脂肪酸生成的脂肪酸去飽和酶主要有5種：FAD2、FAD3、FAD6、FAD7和FAD8，它們都屬于膜整合蛋白(FAD2、FAD3定位于內質網膜，FAD6、FAD7和FAD8定位于質體膜)，可分為ω-6型(也稱為Δ12型)(包括FAD2、FAD6)、ω-3 型(也稱為Δ15型)(包括FAD3、FAD7、FAD8)兩大類[11-12]。FAD7以NADPH-鐵氧還蛋白為電子供體，催化亞油酸(Δ9，12-C18 ∶2)形成α-亞麻酸(Δ9，12，15-C18 ∶3，簡稱ALA)[13]。本研究利用GenBank中麻風樹低溫鍛煉轉錄組數據[14-15]，篩選并克隆到麻風樹FAD7基因(JcFAD7)，并對其進行生物信息學分析，為進一步研究JcFAD7基因的結構與功能及該基因在麻風樹三烯脂肪酸形成中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試麻風樹種子采自云南省楚雄州元謀縣。選取飽滿的麻風樹種子，先用1.5% CuSO4消毒20 min，再用無菌水漂洗5次，于26 ℃恒溫培養箱中吸漲24 h[16]。將吸漲的種子在無菌水中漂洗3次，播于墊有5層用無菌水濕潤的濾紙的白瓷盤(24 cm×16 cm)中，于相對濕度75%、晝—夜溫度26 ℃—20 ℃、光—暗周期16 h—8 h的恒溫培養箱中萌發5 d。之后將發芽的種子播于消毒的培養土中并于同樣恒溫培養箱中培養15 d至第2張真葉展開。取第2張真葉材料，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中用于RNA的提取。

1.2 菌株與主要試劑

大腸桿菌Trans1-T1(DH5α)菌株，由筆者所在實驗室保存；TransZol Up、DNase I、TransStartTaqDNA聚合酶、氨芐青霉素(Amp)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、2×EasyTaqPCR SuperMix(+dye，即已加6×loading buffer，PCR產物可直接上樣電泳)、TransScript Two-Step RT-PCR SuperMix、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit、pEASY-T1 Cloning Kit、Trans 2K Plus II DNA Marker，購自北京全式金生物技術有限公司；引物合成和測序由深圳華大基因有限公司完成。

1.3 試驗方法

1.3.1 總RNA的提取及第1鏈cDNA的合成 取0.2 g麻風樹葉片材料，按照王海波等的方法[13]，利用TransZol Up試劑提取并純化總RNA。以Anchored Oligo(dT)18為逆轉錄引物，利用TransScript Two-Step RT-PCR SuperMix合成第1鏈cDNA。

1.3.2 麻風樹JcFAD7基因全長cDNA的克隆 以與麻風樹同科的植物蓖麻(Ricinuscommunis)FAD7全長mRNA序列(L25897.1)為種子序列，對GenBank中麻風樹低溫鍛煉轉錄組數據(GenBank登錄號：GAHK00000000.1)的45 171條Unigenes序列進行本地BLAST，得到麻風樹JcFAD7基因的序列CL1490.Contig2_JC-CK_1A(GAHK01004476.1，2 035 bp)。分析表明，該序列包含全長開放閱讀框(ORF)(1 341 bp)。以此序列為基礎設計全長cDNA克隆引物，并送深圳華大基因有限公司合成。引物序列：上游F，5′-CTACAGACGATAGAGAAC-3′；下游R，5′-GAACAAATGATAGGATAC-3′。以“1.3.1”節中的反轉錄cDNA為模板，使用TransStartTaqDNA 聚合酶進行PCR擴增，擴增條件：94 ℃ 5 min→(94 ℃ 30 s，48.8 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，35個循環)→72 ℃ 20 min。擴增完成后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，利用EasyPure Quick Gel Extraction Kit從瓊脂糖凝膠中回收目的基因片段(1 796 bp)，并與克隆載體pEASY-T1連接，轉化大腸桿菌Trans1-T1感受態細胞，涂LB抗性平板(LB-Amp++IPTG+X-gal)，過夜生長，挑取白斑菌落進行菌落PCR鑒定。陽性克隆取名為pEASY-T1-JcFAD7，并送深圳華大基因有限公司，利用pEASY-T1質粒上的M13F、M13R通用引物進行雙向測序。

1.3.3 麻風樹JcFAD7基因的生物信息學分析 利用 BioEdit 軟件將JcFAD7 cDNA序列翻譯成氨基酸序列，利用在線工具ProtParam計算蛋白質的理論分子量、等電點等基本參數。利用在線工具TMHMM與Proscale檢測其跨膜結構與親/疏水特性。從GenBank下載其他物種FAD7氨基酸序列，利用ClustalX進行序列相似性比對，然后用MEGA軟件通過鄰接法(neighbour-joining，簡稱NJ)構建系統進化樹，并采用自展法(Bootstrap method)進行檢驗。

2 結果與分析

2.1 麻風樹JcFAD7基因全長cDNA的克隆

以麻風樹葉片cDNA為模板，擴增JcFAD7基因cDNA的全長序列，結果表明，擴增得到的產物長度約 1.8 kbp(圖1-A)。將目的條帶切膠回收后與T/A克隆載體pEASY-T1連接，轉化大腸桿菌，通過菌落PCR驗證陽性克隆(圖1-B)。挑取陽性克隆過夜搖菌，并用M13通用引物進行測序。

2.2 麻風樹JcFAD7基因的生物信息學分析

經測序分析，本研究克隆的麻風樹JcFAD7基因的cDNA序列全長1 796 bp，包含1個完整的開放閱讀框(1 341 bp)，編碼446個氨基酸(圖2)。將JcFAD7編碼框與其基因組序列進行比對，發現JcFAD7基因包含8個外顯子、7個內含子。ProtParam分析結果顯示，JcFAD7編碼的蛋白質分子量為 51.1 ku，理論等電點為8.92。TMHMM與Proscale分析表明，JcFAD7蛋白存在6段明顯的疏水區域，與4段跨膜α-螺旋區、2段膜嵌合α-螺旋區相對應(圖3)。另外研究表明，該蛋白質在N端、C端都不含信號肽，但N端存在1個亞鐵血紅素結合基序。

將克隆的麻風樹JcFAD7基因翻譯的氨基酸序列與 GenBank 下載的其他高等植物的FAD7進行序列相似性比對，用鄰接法構建系統進化樹(圖4)。FAD7蛋白的物種名稱及GenBank登錄號：擬南芥(Arabidopsisthaliana)，NM_111953.2；垂枝樺(Betulapendula)，AY135565.1；二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)，XM_003558109.2；歐洲油菜(Brassicanapus)，FJ985690.1；亞麻薺(Camelinasativa)，XM_010466516.1；茶(Camelliasinensis)，KC847167.1；黃瓜(Cucumissativus)，NM_001287475.1；播娘蒿(Descurainiasophia)，EF105163.1；油棕(Elaeisguineensis)，XM_010939556.1；美洲油棕(Elaeisoleifera)，EU057620.1；猴面花(Erythrantheguttata)，XM_012994633.1；巨尾桉(Eucalyptusgrandis)，XM_010032901.1；大豆(Glycinemax)，GQ144962.1；野大豆(Glycinesoja)，L22965.1；草棉(Gossypiumherbaceum)，KF460118.1；陸地棉(Gossypiumhirsutum)，KF460144.1；雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)，NM_001309351.1；向日葵(Helianthus annuus)，AY254858.1；蘋果(Malus domestica)，NM_001293987.1；蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)，XM_003604610.1；川桑(Morus notabilis)，XM_010103126.1；蓮(Nelumbo nucifera)，XM_010266313.1；美花煙草(Nicotiana sylvestris)，XM_009799172.1；煙草(Nicotiana tabacum)，D79979.1；茸毛煙草(Nicotiana tomentosiformis)，XM_009596074.1；橄欖(Olea europaea)，DQ788674.1；芍藥(Paeonia lactiflora)，KP271031.1；胡楊(Populus euphratica)，XM_011006458.1；馬齒莧(Portulaca oleracea)，DQ991249.1；蓖麻(Ricinus communis)，L25897.1；芝麻(Sesamum indicum)，U25817.1；油桐(Vernicia fordii)，AF200717.1；豇豆(Vigna unguiculata)，EU180596.1；葡萄(Vitis vinifera)，XM_002273738.2；玉米(Zea mays)，NM_001279611.1；麻風樹(Jatropha curcas，登錄號暫缺)。結果顯示，單子葉植物如二穗短柄草與雙子葉植物明顯聚類為2支，說明兩者的FAD7基因在進化上親緣關系較遠。在雙子葉植物中，不同科的植物分別聚類為單獨1支，如豆科(Leguminosae)的大豆、蒺藜苜蓿等，茄科(Solanaceae)的煙草、美花煙草等，大戟科(Euphorbiaceae)的油桐、蓖麻等，十字花科(Brassicaceae)的擬南芥、油菜、播娘蒿等。大戟科的麻風樹未與近科物種蓖麻聚類在一起，而與芍藥的親緣關系更近，序列相似性為 74.6%。

3 討論

決定高等植物抗冷性強弱的主要是三烯脂肪酸(簡稱TA，即C18 ∶3、C16 ∶3)的含量。目前，催化三烯脂肪酸合成的關鍵ω-3去飽和酶FAD3、FAD7、FAD8的研究也在逐漸深入。根據電子供體不同可將ω-3脂肪酸去飽和酶分為2類：一類為FAD3，定位于植物細胞的內質網，以細胞色素b為電子供體，作用于磷脂酰甘油(PG)或其他磷脂；另一類為FAD7、FAD8，定位于植物細胞的質體，以鐵氧還蛋白為電子供體，作用于磷脂酰甘油、硫脂和半乳糖脂。FAD3、FAD7、FAD8都具有相似的蛋白序列結構特征，氨基端與羧基端位于膜的外側，保守性低，中間部位相對保守，包含4個跨膜區域及2段膜嵌合區，在細胞質一側存在3個極度保守的組氨酸簇(HX3/4HH、HX2/3HH、HX2/3HH)與Fe2+形成酶的催化活性中心[17](圖5)。

FAD3基因編碼內質網型ω-3脂肪酸去飽和酶，負責質體內膜膜脂之外所有不飽和甘油酯的合成。目前已經從擬南芥、油菜、大豆、紅花菜豆(PhaseoluseoccineusL.)、芝麻、甘藍(Brassicaoleracea)、亞麻(Linumusitatissimum)、菠菜(Spinaciaoleracea)、番茄(Lycopersiconesculentum)、歐洲白樺(BetulapendulaRot)、白蘇[Perillafrutescens(L.) Britt]、紫蘇[Perillafrutescens(L.) Britton.]、云杉(PiceaasperataMast)、油桐[Verniciafordii(Hemsl.) Airy Shaw]、野毛豆(GlycinesojaSieb. Et Zucc.)、挪威云杉[Piceaabies(L.) Karst.]、麻風樹(JatrophacurcasL.)、油橄欖等植物中分離到FAD3基因。Kodama等研究表明，隨著溫度的降低，植物體內FAD3 mRNA含量增加，進而亞麻酸的比例提高，而且FAD3基因的響應可能依賴于翻譯后水平的調控，涉及蛋白質的磷酸化共價修飾調節作用[18]。Yu等在番茄中過表達FAD3基因，經過4 ℃低溫處理后，轉基因番茄葉片中亞麻酸含量增加，植株地上部分生物量高于對照植株，葉片中葉綠體膜系統超微結構和所有亞細胞器的完整性均高于對照植株[19]。FAD7、FAD8為FAD3的質體型同工酶。FAD7基因的表達不受溫度的調控，而FAD8基因則屬于溫度敏感型表達，在轉錄、轉錄后水平都受到調控，而酶活性的調控區域主要在FAD8的羧基末端。目前已從擬南芥、油菜、甘藍、向日葵、玉米、歐芹(Petroselinumcrispum)、蓖麻、白樺(BetulaplatyphyllaSuk.)、新疆野蘋果[Malussieversii(Ledeb.) Roem.]、大豆、芥菜、萊茵衣藻(ChlamydomonasreinhardtiiD.)、播娘蒿、黃瓜、洋桔梗(EustomagrandiflorumShinn.)、芝麻、仙客來(CyclamenpersicumMill.)等植物中分離到FAD7基因。Kodama等將從擬南芥中克隆的葉綠體ω-3脂肪酸去飽和酶基因(FAD7基因)導入煙草中進行表達，發現轉基因煙草中十六碳三烯酸、十八碳三烯酸含量提高，其前體物質含量相應減少，在1 ℃低溫下表現出明顯的抗寒性。表明FAD7基因在葉綠體中主要負責葉組織中三烯脂肪酸的形成，同時也有力地證明了三烯脂肪酸水平的提高對植物耐寒性有非常重要的作用[20]，這與Dominguez等研究發現轉FAD7基因番茄植株的抗寒性提高的結果一致[21]。1994年，Gibson等首次分離到FAD8基因，并進一步分析了FAD8、FAD7基因的結構和功能特點，結果表明，與其他已知去飽和酶基因及FAD7相比，在正常條件下，FAD8 mRNA表達水平較穩定，但在低溫條件下，其表達水平會顯著升高，證明FAD8基因屬于低溫誘導基因，與植物的抗冷性直接相關[22]。目前，已經從擬南芥、玉米、秈稻(OryzasativaL. ssp.indicaKato)、白樺、豇豆、油菜、馬齒莧、播娘蒿等植物中分離到FAD8基因。Wang等將FAD8基因在水稻中過表達，發現轉基因品系中十六碳三烯脂肪酸和亞麻酸含量均增加，2 ℃處理7 d后，轉基因植株受損傷程度明顯低于對照植株[23]。

研究發現，植物組織中不飽和脂肪酸含量一般占脂肪酸總量的75%以上，而植物組織的不飽和脂肪酸組成在很大程度上受脂肪酸去飽和酶種類和數量的調控，深入了解脂肪酸去飽和酶的種類、數量及其編碼基因的各種性質對于定向改變植物的脂肪酸組成具有重要的理論和實際意義。本研究首次克隆到能源植物麻風樹的FAD7基因，該基因為控制α-亞麻酸系列多不飽和脂肪酸合成的關鍵酶基因，深入研究該基因的結構特征、表達方式對于闡明麻風樹不飽和脂肪酸與抗冷性的關系具有較好的指導作用。

[1]林 娟，周選圍，唐克軒，等. 麻瘋樹植物資源研究概況[J]. 熱帶亞熱帶植物學報，2004，12(3)：285-290.

[2]何 璐，虞 泓，范源洪，等. 麻瘋樹(JatrophacurcasL.)植物學研究進展[J]. 長江流域資源與環境，2010，19(增刊1)：120-127.

[3]王海燕，文明富，劉石生，等. 麻瘋樹生物學研究進展及其開發利用[J]. 熱帶作物學報，2010，31(4)：670-675.

[4]Johnson T S，Eswaran N，Sujatha M. Molecular approaches to improvement ofJatrophacurcasLinn. as a sustainable energy crop[J]. Plant Cell Reports，2011，30(9)：1573-1591.

[5]Carels N.Jatrophacurcas：a review[J]. Advances in Botanical Research，2009，50：39-86.

[6]Lee D H，Lee C B. Chilling stress-induced changes of antioxidant enzymes in the leaves of cucumber：in gel enzyme activity assays[J]. Plant Science，2000，159(1)：75-85.

[7]孫中海，章文才，區勝祥，等. 柑橘抗寒性與膜脂肪酸組分的關系研究[J]. 武漢植物學研究，1990，8(1)：79-85.

[8]沈 漫，王明庥，黃敏仁. 植物抗寒機理研究進展[J]. 植物學通報，1997，14(2)：1-8.

[9]Heilmann I，Mekhedov S，King B，et al. Identification of theArabidopsispalmitoyl-monogalactosyldiacylglycerol Δ7-desaturase geneFAD5，and effects of plastidial retargeting ofArabidopsisdesaturases on thefad5 mutant phenotype[J]. Plant Physiology，2004，136(4)：4327-4345.

[10]Mekhedov S，de Ilárduya O M，Ohlrogge J. Toward a functional catalog of the plant genome. A survey of genes for lipid biosynthesis[J]. Plant Physiology，2000，122(2)：389-402.

[11]Ohlrogge J B，Browse J A. Lipid biosynthesis[J]. Plant Cell，1995，7(7)：957-970.

[12]Zhuang H，Hamilton-Kemp T R，Andersen R A，et al. The impact of alteration of polyunsaturated fatty acid levels on C6-aldehyde formation ofArabidopsisthalianaleaves[J]. Plant Physiology，1996，111(3)：805-812.

[13]王海波，鄒竹榮，龔 明. 基于RNA-Seq數據篩選的小桐子抗冷相關基因的表達模式及其聚類分析[J]. 基因組學與應用生物學，2014，33(6)：1196-1205.

[14]Wang H B，Zou Z R，Wang S S，et al. Global analysis of transcriptome responses and gene expression profiles to cold stress ofJatrophacurcasL.[J]. PLoS One，2013，8(12)：e82817.

[15]Wang H B，Zou Z R，Wang S S，et al. Deep sequencing-based transcriptome analysis of the oil-bearing plant Physic Nut(JatrophacurcasL.)under cold stress[J]. Plant Omics，2014，7(3)：178-187.

[16]李忠光，龔 明. 不同化學消毒劑對小桐子種子萌發和幼苗生長的影響[J]. 種子，2011，30(2)：4-7，12.

[17]朱 敏，余龍江. 脂酰脫飽和酶[J]. 生命的化學，2001，21(6)：478-480.

[18]Kodama H，Nishiuchi T，Seo S，et al. Possible involvement of protein phosphorylation in the wound-responsive expression ofArabidopsisplastid omega-3 fatty acid desaturase gene[J]. Plant Science，2000，155(2)：153-160.

[19]Yu C，Wang H S，Yang S，et al. Overexpression of endoplasmic reticulum omega-3 fatty acid desaturase gene improves chilling tolerance in tomato[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2009，47(11/12)：1102-1112.

[20]Kodama H，Hamada T，Horiguehi G，et al. Genetic enhance-merit of cold tolerance by expression of a gene for chloroplastω-3 fatty acid desaturase in transgenic tobacco[J]. Plant Physiology and Biochemistry，1994，105(2)：601-605.

[21]Dominguez T，Luisa Hernandez M，Pennycooke J C，et al. Increasing omega-3 desaturase expression in tomato results in altered aroma profile and enhanced resistance to cold stress[J]. Plant Physiology，2010，153(2)：655-665.

[22]Gibson S，Arondel V，Iba K，et al. Cloning of a temperature-regulated gene encoding a chloroplast omega-3 desaturase fromArabidopsisthaliana[J]. Plant Physiology，1994，106(4)：1615-1621.

[23]Wang J，Ming F，Pittman J，et al. Characterization of a rice (OryzasativaL.) gene encoding a temperature-dependent chloroplastω-3 fatty acid desaturase[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，340(4)：1209-1216.

10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.008

2015-11-23

國家自然科學基金(編號：31460179)。

王海波(1980—)，男，山西長治人，博士，副教授，碩士生導師，主要從事植物逆境分子生物學研究。Tel：(0874)8987890；E-mail：bocai0406@163.com。

Q785

A

1002-1302(2017)02-0031-05

王海波，郭俊云，劉 潮，等. 麻風樹脂肪酸去飽和酶7基因的克隆及生物信息學分析[J]. 江蘇農業科學，2017，45(2)：31-35.