一步PCR法融合狗頭棗ACOⅠ基因片段

陳國梁， 田瑞康， 趙 康， 楊成成， 安 鵬， 張向前

(延安大學生命科學學院/陜西省紅棗重點實驗室，陜西延安 716000)

一步PCR法融合狗頭棗ACOⅠ基因片段

陳國梁， 田瑞康， 趙 康， 楊成成， 安 鵬， 張向前

(延安大學生命科學學院/陜西省紅棗重點實驗室，陜西延安 716000)

以狗頭棗ACOⅠ基因外顯子Ⅲ和Ⅳ的部分序列為靶標序列，采用一步PCR法對其進行融合擴增。經與T載體連接、測序。結果表明：經一步PCR法擴增到大小為589 bp的融合基因片段，經序列比對，其與ACOⅠ外顯子Ⅲ和Ⅳ序列一致性為100%。表明在一個PCR反應體系中通過4引物一次性擴增可獲得融合基因，該方法是一種簡便、經濟、有效的融合基因構建方法。

狗頭棗；ACOⅠ基因；一步PCR法

乙烯是植物主要內源激素之一，對植物的生長發育特別是果實成熟和衰老過程的調節有重要作用，是公認的果實成熟激素[1-6]。在果實的成熟過程中，乙烯的大量生成會提高與果實成熟有關酶的活性，進而促進果實的成熟[5-14]。ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid oxidase，ACO)是植物中乙烯生物合成途徑的關鍵酶之一，可直接催化ACC轉變為乙烯[3，5]。鑒于乙烯生物合成相關基因在調控果品成熟及衰老方面的重要作用，采用生物技術對該基因調控，以便在基因水平上控制ACO的表達，則有可能從根本上解決果實延熟、抗衰老等問題。該研究選擇了狗頭棗ACOⅠ基因外顯子Ⅲ及Ⅳ的部分基因片段[15]，通過一步PCR法將其融合，用于RNAi的植物表達載體的構建，為調控紅棗ACOⅠ 基因的表達來延緩棗果的成熟，為延熟、耐儲紅棗新品種的培育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒及試劑

菌株E.coliDH5α、質粒pGM-TACC Ⅰ(含ACOⅠ基因)均為筆者所在課題組保存，DNA回收試劑盒、TaqDNA Polymerase、限制性內切酶等購自TaKaRa公司，DNA Marker購自天為時代公司，其他試劑均為進口或國產分析純，PCR引物合成和DNA測序由上海生工生物技術有限公司完成。

1.2 引物設計

以狗頭棗ACOⅠ基因序列(登錄號：JF812966.1)為依據，考慮到采用PCR拼接2個基因片段(294 bp)、1 096～1 359 bp 之間的片段(264 bp)，分別稱為：F1、F2。用于擴增ACOⅠ基因片段的引物采用Oligo 7.0分析軟件設計，依次為命名為3U、3RL、4RU、4L，4條引物組成如下：

3U：5′-GCGGATCCCTCGAGATGAATTGGAGACACTAG

CTGAGG-3′；

3RL 構成(含F1片段非編碼鏈5′端23 bp和F2片段非編碼鏈3′端22 bp)：5′-CTCTTGTATTTCCCATTTGTTATAAGGTTGACTACAA TGGAGTGG-3′；

4RU 構成(含F1片段編碼鏈3′端22 bp和F2片段編碼鏈5′端23 bp)：5′-CCACTCCATTGTAGTCAACCTTATAACAAATGG GAAATACAAGAG-3′；

4L 引物構成(F2片段非編碼鏈5′端22 bp)：5′-GCATCGATGAATTCAACATTAGTTTCCACTGCTTTC-3′。

以上引物中，分別在3U、4L引物中引入17、14 bp酶切位點堿基序列(見引物中下劃線部分序列)，為后續試驗作準備。

1.3 一步PCR法構建融合基因

以質粒pGM-TACC Ⅰ(含融合基因F1、F2片段)DNA為模板，加入Taq酶、dNTPs、目的基因F1與F2片段的上下游引物3U、3RL、4RU、4 L各1 μL配成25 μL的反應體系。在 94 ℃ 4 min、95 ℃ 40 s、53.5 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s的反應參數下進行5個循環后，將退火溫度改為51.5 ℃、其他擴增參數不變進行5個循環，72 ℃ 3 min。再將退火溫度改為53 ℃、其他擴增參數不變進行10個循環，72 ℃ 3 min。然后將 25 μL 的反應液(含Taq酶、dNTPs、 MgCl2、所設計融合基因的上、下游引物，即3U、4 L各1 μL，濃度為10 μmol/L)加入上述反應體系中；在94 ℃ 4 min、95 ℃ 40 s、54.7 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min條件下擴增30個循環，72 ℃ 10 min，4 ℃冷卻后取5.0 μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 融合基因片段與T載體的連接及測序

將經電泳檢測大小合適的PCR產物進行回收并與T載體連接、轉化、篩選、鑒定。酶切和PCR鑒定后將所得陽性克隆子(命名為pGEM-TF)委托上海生物技術有限責任公司測序。

2 結果與分析

2.1 一步PCR法構建融合基因的原理

一步PCR法構建融合基因的原理如圖1所示。以質粒pGM-TACC Ⅰ為模板起初2次5個循環擴增是分別擴增出F1、F2基因片段；第3次10個循環的擴增是將已擴出來的F1、F2片段互為模板和引物進行基因融合，第4次30個循環是以形成的融合基因為模板，融合基因的上下游引物即3U與4 L為引物，獲得融合基因全長序列。

2.2 F1與F2片段的一步PCR融合擴增結果

將上述擴增得到的PCR產物取5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，結果(圖2)獲得大小約590 bp的特異條帶，與預期片段大小符合。初步表明2片段已按設計融合在一起。

2.3 基因融合產物的酶切與測序結果

將經篩選獲得的重組質粒pGEM-TF，經PCR和雙酶切進行鑒定，結果(圖3、圖4)表明，PCR擴增及酶切片段的大小均為590 bp，與預期大小一致，說明融合基因片段已連至載體。經測序及序列比對，結果與GenBank中的序列完全一致。進一步確定以含目的基因的質粒pGM-TACC Ⅰ為模板，通過一步PCR法成功獲得了狗頭棗ACOⅠ基因序列中F1和F2片段的融合基因。

3 結論與討論

重疊延伸PCR技術是采用具有互補末端的引物，使PCR產物形成重疊鏈并在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段拼接起來。利用該技術不需要內切酶消化和連接酶處理即可進行有效的基因重組，能較快獲得依靠限制性內切酶消化的方法難以得到的產物。通過精心設計引物，利用該技術可將2條以上的基因構建成為融合基因，如Shevchuk等利用重疊延伸PCR技術成功地將多個DNA片段連接在一起[16-19]。此外重疊延伸PCR在基因的定點突變、長片段基因的合成、構建重組質粒和載體、基因敲除以及目的基因的擴增等方面有其廣泛而獨特的應用[20-26]。

一步PCR法融合ACOⅠ基因外顯子Ⅲ及Ⅳ的部分基因片段也屬于重疊延伸PCR法，但其優點是不需要將單個PCR產物回收再融合即只需要構建1個PCR反應就可以得到融合基因。在達到融合目的的同時，縮短了試驗周期，節約了成本，減少了操作環節，為重疊延伸PCR法的應用提供了新的選擇。

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10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.007

2015-12-11

陜西省重點實驗室項目(編號：15JS123)；延安市農業攻關項目(編號：2011kn-09)；延安大學高水平大學建設項目(編號：2012SXTS06)；延安大學校級科研項目(編號：YDZ2012-12、YD2014-01)；地方高校國家級大學生創新訓練計劃(編號：201410719041)。

陳國梁(1974—)，男，陜西定邊人，副教授，碩士生導師，研究方向為植物生物技術。E-mail：glc9359@163.com。

Q786

A

1002-1302(2017)02-0028-03

陳國梁，田瑞康，趙 康，等. 一步PCR法融合狗頭棗ACOⅠ基因片段[J]. 江蘇農業科學，2017，45(2)：28-30.