聯合應用Wee1抑制劑和阿霉素對急性白血病細胞株HL—60作用的研究

張西凱+于廣晴+倪蕾

【摘要】 目的：通過聯合應用PD0166285和阿霉素，觀察其對急性白血病細胞HL-60的作用，探討其可能的作用機制。方法：通過MTT法檢測藥物對HL-60的生長抑制作用，流式細胞術檢測其凋亡作用，Western bolt檢測凋亡相關蛋白caspase-3和PARP的表達情況。結果：PD0166285聯合阿霉素對HL-60細胞的抑制作用和促凋亡作用明顯增強，同時凋亡相關蛋白caspase-3和PARP的剪切增加。結論：PD0166285能夠增強阿霉素對HL-60細胞的生長抑制并促進其凋亡，可能通過caspase依賴性凋亡途徑發揮作用。

【關鍵詞】 PD0166285； ADM； HL-60； 凋亡

【Abstract】 Objective：Through the combined use of PD0166285 and adriamycin，to observe its effect on acute leukemia cells HL-60，and to explore its possible mechanism.Method：MTT method was used to detect the inhibitory effect of drugs on the growth of HL-60，flow cytometry was used to detect the apoptosis，Western bolt was used to detect the expression of apoptosis related protein caspase-3 and PARP.Result：The inhibitory effect and apoptosis of PD0166285 combined with adriamycin on HL-60 cells was significantly enhanced，and the shear of apoptosis related protein caspase-3 and PARP increased.Conclusion：PD0166285 can enhance the growth inhibition and apoptosis of HL-60 cells，which may play a role in caspase dependent apoptosis pathway.

【Key words】 PD0166285； ADM； HL-60； Apoptosis

First-authors address：The First Hospital Affiliated to Jiamusi University，Jiamusi 154003，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.36.005

急性白血病（AL）是一種造血干祖細胞的惡性克隆性疾病[1]，其治療包括聯合化療、促分化、促凋亡治療和造血干細胞移植，其中聯合化療是主要方法[2]。阿霉素（ADM）作為一種蒽環類抗腫瘤藥物[3]，在白血病的治療中應用已久，但由于其心臟毒性、骨髓抑制等不良反應較多且易產生多藥耐藥，限制了其作為抗腫瘤藥物的進一步應用[4]。目前許多研究表明，一些參與細胞周期調控的分子已成為治療腫瘤的重要靶點[5-6]。Wee1蛋白激酶作為一種細胞周期檢查點激酶，是調控細胞從G2期到M期的關鍵靶點[7-8]。新近研究發現抑制Wee1可以導致細胞周期相關激酶活性的上調，促使受損傷細胞跨過G2/M期檢查點，損傷的DNA無法完成修復便直接進入有絲分裂期，導致細胞有絲分裂災難和細胞凋亡甚至死亡等事件的發生，表現出抗腫瘤的生物活性[9-10]。目前已有研究發現，PD0166285作為一種Wee1蛋白激酶抑制劑可協同化療或放療更好起到抗腫瘤作用[11]。筆者希望通過體外聯合使用PD0166285與ADM，觀察其對急性白血病細胞HL-60的作用，進而探討PD0166285聯合ADM抗HL-60細胞的可能機制，為臨床聯合使用PD0166285與ADM提供實驗基礎和理論依據，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑 急性白血病細胞HL-60（上海子實生物公司），PD0166285（美國Selleck公司），阿霉素（美國Sigma公司），MTT（上海碧云天生物公司），兔抗人PARP、兔抗人caspase-3、兔抗人β-actin單克隆抗體、HRP標記抗兔二抗（北京中杉公司）；其余試劑均為分析純。流式細胞儀（美國Becton Dikison公司），Annexin-V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒（北京嘉美紐諾生物公司）。

1.2 MTT法測定PD0166285及ADM單用/聯用對HL-60細胞的抑制作用 取對數生長期的HL-60細胞，按照2.0×105個/mL的細胞密度鋪于96孔板中，每孔100 ?L細胞懸液，加入不同濃度的PD0166285和/或ADM。每個濃度設置三個復孔，同時用RPMI1640替代藥物作為對照孔。將鋪好的96孔板于細胞培養箱中孵育48 h后向每孔加入10 ?L的MTT溶液，繼續孵育1 h后離心棄上清液，加入50 ?L DMSO，振蕩溶解結晶后置酶標儀上490 nm波長測吸光度值（OD值），計算抑制率，抑制率（%）=（1-藥物組OD值/對照組OD值）×100%。

1.3 Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒法檢測細胞調亡 收集藥物處理后的細胞，PBS洗二次，4 ℃離心去上清液。加入50 ?L的結合緩沖液，再加入5 ?L Annexin V-FITC，混勻后室溫避光孵育15 min。再加入10 ?L PI，孵育5 min后迅速上機完成凋亡檢測。細胞凋亡率為Annexin V-FITC+/PI-及Annexin V-FITC+/PI+的百分比之和。endprint

1.4 Western bolt檢測caspase-3和PARP的表達 收集不同濃度藥物作用后的細胞，細胞裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，按50 μg體系加樣，垂直電泳，100 V電泳轉膜2 h，封閉1 h，加入一抗孵育24 h，二抗孵育1 h，加入ECL發光液，Tanon 5200采集圖像，對結果進行灰度掃描。

1.5 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT法測定PD0166285及ADM單用/聯用對HL-60細胞的抑制作用 將HL-60細胞培養在不同濃度PD0166285和/或ADM中，MTT法測定抑制率。單獨用藥結果顯示，PD0166285、ADM對HL-60細胞均有不同程度的抑制作用，并呈明顯的劑量—效應關系。PD0166285作用于HL-60細胞48 h的IC50為1 μm；ADM作用于HL-60細胞48 h的IC50為0.65 μm。聯合用藥結果顯示，PD0166285聯合ADM增強了對HL-60細胞的生長抑制作用，單用0.1、0.5、1.0 ?m的ADM作用于HL-60細胞48 h的抑制率分別為（31.23±0.75）%、（49.73±0.61）%、（62.66±0.07）%，而聯用0.50 ?m PD0166285后，抑制率增加為（48.56±0.05）%、（64.45±0.13）%、（79.73±0.18）%，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 PD0166285和/或ADM對HL-60細胞凋亡的影響 HL-60細胞處理后凋亡檢測結果顯示，單獨用ADM（0.1 ?m，48 h）作用于HL-60細胞凋亡率為（25.27±0.34）%，單獨用PD0166285（1 ?m，48 h）處理凋亡率為（23.15±1.03）%，當PD0166285（1 ?m）聯合ADM（0.1 ?m）作用時凋亡率則達到（56.21±1.64）%，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1。

2.3 PD0166285聯合ADM對HL-60細胞凋亡蛋白的影響 將HL-60細胞與不同濃度的ADM及PD0166285聯合作用48 h，提取蛋白，進行Western blot檢測相關蛋白的表達，第1～6條泳道分別代表空白對照組、ADM 0.1 ?m組、ADM 0.5 ?m組、PD0166285 0.5 ?m組、PD0166285+ADM 0.1 ?m組、PD0166285+ADM 0.5 ?m組，ADM作用于HL-60細胞48 h后，在藥物濃度0.5 ?m時caspase-3和PARP發生剪切，細胞發生凋亡，經PD0166285（0.5 ?m）和ADM聯合作用后，在ADM藥物濃度為0.1 ?m時caspase-3和PARP即發生剪切。見圖2。

3 討論

Wee1蛋白激酶是一種細胞周期檢查點激酶，在調控細胞從G2期到M期的過渡中發揮重要作用。當細胞DNA因各種原因受到損傷時，活化的Wee1磷酸化Cdc2的Tyr15位點而使其失活，阻止CDK1-cyclinB復合物結合活化，阻止細胞進入M期，從而延遲有絲分裂[12]，促進DNA損傷的修復以及保證細胞DNA復制的完成，以避免異常的DNA進入有絲分裂期導致有絲分裂災難甚至發生調亡[13]。目前在許多惡性腫瘤中都檢測到了Wee1的過表達，特別是在p53突變或缺失型的腫瘤中更明顯[14-15]，國內學者經實驗初步證明Wee1在急性白血病細胞株中存在高表達[16]。此外，Wang等[17]發現，在腫瘤細胞中Wee1的過表達能夠對抗DNA損傷后引起的凋亡，使受損傷細胞得到修復并對放化療不敏感[8]。

根據Wee1在細胞周期中的作用及其在一些腫瘤中過表達，提示可以通過抑制Wee1來抑制腫瘤的發生和發展[18]。科研人員在過去的十多年中研發出來了多種Wee1小分子抑制劑，如PD0166285、PD0407824及MK-1775等[19]，在不同的實驗中表現出了抗腫瘤作用[20]。本實驗表明當Wee1蛋白激酶抑制劑PD0166285聯合ADM應用時，能夠明顯增強ADM對急性白血病細胞HL-60的增殖抑制和促凋亡作用，筆者考慮當Wee1蛋白激酶受到抑制時，ADM造成的細胞DNA損傷無法得到修復，大量受損傷細胞未完成修復便進入M期，DNA損傷增加，進而出現有絲分裂災難，導致caspase-3的激活和PARP的裂解增加，通過caspase依賴性凋亡途徑誘導細胞凋亡。但是，由于caspase依賴性凋亡途徑又可分為由死亡受體介導的外源性途徑和由線粒體和內質網介導的內源性途徑[21]，并且是否涉及非caspase依賴途徑的參與尚不清楚，PD0166285增強ADM誘導HL-60細胞凋亡的具體機制有待進一步深入研究。由于Wee1激酶抑制劑充分發揮抗白血病細胞作用需要建立在細胞DNA受損傷的基礎上，因此Wee1激酶抑制劑與化療、放療等損傷細胞的治療方法聯合使用可能是比較理想的方案。

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（收稿日期：2016-10-14） （本文編輯：張爽）endprint