紫花苜蓿葉片受白粉病菌侵染后結(jié)構(gòu)的變化

張?jiān)伱?，馬暉玲，唐云智

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)研究測試中心，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

紫花苜蓿葉片受白粉病菌侵染后結(jié)構(gòu)的變化

張?jiān)伱?,2，馬暉玲2*，唐云智2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)研究測試中心，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

為了了解植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)與抗病性的關(guān)系。以豌豆白粉菌(Erysiphepisi)接種2個(gè)抗性不同的紫花苜蓿品種，對(duì)接種后0、3、7、10 d的葉片制作了石蠟切片，顯微觀察葉片細(xì)胞橫切結(jié)構(gòu)。本研究首次發(fā)現(xiàn)：病原菌侵染后，抗病品種慶陽苜蓿葉片柵欄細(xì)胞由長圓形變?yōu)槎鄠€(gè)近圓形細(xì)胞，細(xì)胞分布均勻，排列緊湊，葉肉細(xì)胞由侵染前的4～5層變?yōu)?～8層細(xì)胞；感病品種德寶苜蓿柵欄細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化向兩個(gè)方向發(fā)展：一是長圓形柵欄細(xì)胞變?yōu)槎鄠€(gè)卵圓形小細(xì)胞，但細(xì)胞分布不勻，部分細(xì)胞間出現(xiàn)較大間隙；二是葉片維管束之間的柵欄細(xì)胞由長圓形變?yōu)槁褕A形小細(xì)胞，而在維管束處的柵欄細(xì)胞仍為長圓形，緊靠維管束，排列在一起，細(xì)胞間隙小。

解剖結(jié)構(gòu)；柵欄組織；海綿組織；抗病性

苜蓿(Medicagosativa)是一種產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)、耐刈割的優(yōu)良豆科牧草，對(duì)于我國國民經(jīng)濟(jì)和畜牧業(yè)發(fā)展具有重要作用。其根系發(fā)達(dá)，具有根瘤菌，更是改良土壤和水土保持的重要植物[1-2]。由于苜蓿的大面積種植，粗放型經(jīng)營，為病害的猖獗創(chuàng)造了條件。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全國的苜蓿病害大約有數(shù)十種[3-4]，嚴(yán)重影響苜蓿的產(chǎn)量和飼用品質(zhì)(營養(yǎng)成分降低，有害物質(zhì)增加)，進(jìn)而影響家畜健康，降低畜產(chǎn)品質(zhì)量[5]。近年來，隨著我國草地畜牧業(yè)的發(fā)展和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，苜蓿種植面積進(jìn)一步擴(kuò)大，病害問題嚴(yán)重影響我國畜牧業(yè)和草產(chǎn)業(yè)的長足發(fā)展。

植物受到病原菌侵染后，其形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理生化特征常常發(fā)生改變，這些變化大多與植物的抗病性有關(guān)。小麥(Triticumaestivum)葉片受白粉菌侵染后，葉肉細(xì)胞中葉綠體的形狀由原來的橢圓形變成了圓球形，葉綠體的膜可能由于解體變得模糊[6]；杉苗葉片受炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)侵染后，在受害程度不同的寄主細(xì)胞中，葉綠體、線粒體、細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)、高爾基小泡和質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)、大小及內(nèi)含物有不同程度的變化[7]；甘薯(Dioscoreaesculenta)被薯瘟菌(Ralstoniasolanacearum)侵染后，感病品種‘勝利百號(hào)’葉片的細(xì)胞膜完整性被破壞，葉綠體數(shù)目減少、膨脹模糊、基粒片層松散解體以及淀粉粒變?。欢共∑贩N‘湘薯75-55’細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，葉綠體基粒片層排列整齊。近年來，人們對(duì)于病原微生物侵染對(duì)植物細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的研究較多[6,8-12]。其實(shí)，細(xì)胞才是植物應(yīng)對(duì)病原物侵染的基本單位。目前，對(duì)病原菌侵染植物后，植物細(xì)胞學(xué)變化的研究相對(duì)較少。有報(bào)道，黑腐病原菌YL-17 菌種侵染大白菜(Brassicacamperstris)后，幼苗葉肉細(xì)胞變大，細(xì)胞數(shù)目變少，尤其是柵欄組織細(xì)胞排列逐漸疏松，細(xì)胞內(nèi)葉綠體由原來的貼壁分布變?yōu)榛靵y分布，且數(shù)量逐漸變少[13]。

為了掌握植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化與抗病性的關(guān)系，及其在植物抵御病害侵染中的作用。依據(jù)李敏權(quán)等[14]和金娟等[15]對(duì)紫花苜蓿抗白粉病評(píng)價(jià)的研究成果，選擇德寶(Derby)作為高感品種(S)，慶陽(Qingyang)苜蓿作為高抗品種(R)，以葉部病害、活體營養(yǎng)型真菌-豌豆白粉菌(Erysiphepisi)接種，研究了白粉菌侵染抗病和感病紫花苜蓿品種后，葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化，對(duì)于明確苜蓿白粉病的侵染機(jī)理和過程，了解細(xì)胞變化在植物抗病性中的積極作用，培育和利用抗病品種防治苜蓿白粉病具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 材料的種植與取樣方法

紫花苜蓿材料“德寶”和“慶陽苜蓿”種子由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)曹致中教授饋贈(zèng)。

本研究試驗(yàn)材料于2015年7月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)東南角試驗(yàn)基地種植。選取籽粒飽滿的苜蓿種子播種于直徑30 cm的花盆中，澆透水，并覆以PE薄膜(0.01 mm)保濕。出苗后，于黃昏時(shí)去掉薄膜。待幼苗長至5 cm高時(shí)，進(jìn)行疏苗，每盆保留15株左右健壯幼苗。每個(gè)材料各種植15盆。

紫花苜蓿白粉菌病原采自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)蘭州牧草試驗(yàn)站。以水玻片法，光學(xué)顯微鏡觀察，螺旋測微尺湄時(shí)，觀察計(jì)測白粉菌病原的閉囊殼、子囊、子囊孢子、附屬絲、分生孢子等形態(tài)特征。根據(jù)鄭儒永等[16]、李敏權(quán)等[17]、Boesewinkel[18]及Hanson[19]的研究成果，通過形態(tài)學(xué)性狀比較，本白粉菌病原應(yīng)屬于豌豆白粉菌(Erysiphepisi)。鑒定后，在位于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)中部的牧草試驗(yàn)基地甘農(nóng)3號(hào)紫花苜蓿上隔離繁殖。

豌豆白粉菌采自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)蘭州牧草試驗(yàn)站，經(jīng)鑒別確定無誤后在位于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)中部的牧草與草坪草試驗(yàn)基地隔離生長的甘農(nóng)3號(hào)紫花苜蓿上繁殖。2015年8月25日收集新鮮菌絲體和分生孢子配制成懸浮液采用噴涂法進(jìn)行接種。接種后搭小拱棚并覆以PE膜保濕。

分別于接種后0、3、7、10 d取樣，取苜蓿小葉置5 mL離心管中加入卡諾液固定，觀察菌絲生長情況，并制作石蠟切片對(duì)葉片組織解剖學(xué)做顯微觀察。

1.2 菌絲生長觀察

紫花苜蓿小葉剪下后浸入卡諾固定液(乙醇∶冰乙酸=3∶1)中，葉綠素浸出后，更換卡諾固定液至葉片完全亮白，轉(zhuǎn)入70%乙醇中保存。系列復(fù)水，然后以0.05%錐蟲藍(lán)(乳酸∶甘油∶水=1∶1∶1)對(duì)菌絲體染色，觀察菌絲長度、分枝數(shù)和吸器。

1.3 石蠟切片制作

采用常規(guī)石蠟切片技術(shù)。將卡諾液固定的材料，經(jīng)酒精系列脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后，Leica RM2265旋轉(zhuǎn)切片機(jī)(德國)切片。切片厚度為5 μm，充分烤片后，進(jìn)行番紅-固綠雙染色。ZEISS Imager A2型顯微攝像生物顯微鏡(德國)下觀察。Axio Cam MRc5系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗病苜蓿

苜蓿葉片具有典型的異面葉結(jié)構(gòu)，由上、下表皮細(xì)胞和葉肉細(xì)胞組成(圖1)。接種E.pisi前，健康葉片的表皮細(xì)胞為單層細(xì)胞，呈圓形或長圓形，排列緊密，無細(xì)胞間隙(圖1 A1-A3)。上、下表皮細(xì)胞之間是結(jié)構(gòu)明顯不同的兩種葉肉細(xì)胞——長圓形的柵欄組織細(xì)胞和卵圓形的海綿組織細(xì)胞(圖1 A1-A3)。柵欄細(xì)胞1層或1～2層，排列整齊像一道籬笆位于葉片近軸面，細(xì)胞間隙??；遠(yuǎn)軸面的海綿細(xì)胞約3～4層，體積較小，分布均勻，排列較為疏松，有較大的細(xì)胞間隙(圖1 A1-A3)；葉肉細(xì)胞內(nèi)，沿細(xì)胞內(nèi)壁排列的藍(lán)綠色小點(diǎn)即為葉綠體(圖1)。

圖1 接種E. pisi后，慶陽苜蓿葉片結(jié)構(gòu)的變化Fig.1 The changes of leave structure in Qingyang alfalfa after inoculation with E. pisi A1～A3: 接種后0 d；B1～B3: 接種后3 d；C1～C3: 接種后7 d；ue, 上表皮; de, 下表皮;pt, 柵欄組織; st, 海綿組織; vb,維管束。A1-A3: 0-day after inoculation; B1-B3: 3-day leaves after inoculation; C1-C3: 7-day after inoculation; ue, upper-epidermis; de, down-epidermis; pt, palisade mesophyll cell; st, spongy mesophyll cell; vb, vascular bundle. 下同。The same below.

病原菌侵染3 d后，柵欄組織細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了巨變。細(xì)胞扭曲變形，細(xì)胞間隙增大(圖1 B1，B3)；有些柵欄細(xì)胞從中斷開形成新的細(xì)胞，使柵欄細(xì)胞由長圓形變?yōu)槎虉A形細(xì)胞(圖1 B2)。侵染7 d后，柵欄細(xì)胞由一個(gè)長圓形細(xì)胞變?yōu)槎鄠€(gè)偏圓形小細(xì)胞 (圖1 C1-C3)。葉肉細(xì)胞——柵欄組織細(xì)胞和海綿組織細(xì)胞——由侵染前的4～5層細(xì)胞變?yōu)?～8層細(xì)胞，卵圓形小細(xì)胞分布均勻，排列緊湊。葉肉細(xì)胞內(nèi)，葉綠體仍緊貼細(xì)胞內(nèi)壁分布在四周。

2.2 感病苜蓿

感病品種德寶苜蓿的健康葉片與抗病品種慶陽苜蓿葉片類似。無色(由于不含葉綠體)的上、下表皮細(xì)胞間是排列規(guī)范的葉肉細(xì)胞(圖2 D1-D3)，柵欄組織排列整齊緊密，其下是細(xì)胞間隙疏松的海綿組織。E.pisi侵染葉片后，柵欄細(xì)胞變得細(xì)長，細(xì)胞間隙變大(圖2 E1，E3)；有些柵欄細(xì)胞變形，致使氣孔細(xì)胞下腔出現(xiàn)大的空隙(圖2 E2)。隨著病原菌絲的擴(kuò)展，柵欄細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化向兩個(gè)方向發(fā)展：一是長圓形柵欄細(xì)胞變?yōu)槎鄠€(gè)卵圓形小細(xì)胞(圖2 F1-F3)，且細(xì)胞分布不勻，部分細(xì)胞間出現(xiàn)較大間隙；二是葉片維管束之間的柵欄細(xì)胞由長圓形變?yōu)槁褕A形小細(xì)胞(圖2 G1，G3)，而在維管束處的柵欄細(xì)胞仍為長圓形，緊密地排列在一起，細(xì)胞間隙小(圖 2 G2)。葉肉細(xì)胞內(nèi)，葉綠體仍緊貼細(xì)胞內(nèi)壁分布在四周。

圖2 接種E. pisi后，德寶苜蓿葉片結(jié)構(gòu)的變化Fig.2 The changes of leave structure in Derby alfalfa after inoculation with E. pisi D1～D3: 接種后0 d；E1～E3: 接種后3 d；F1～F3: 接種后7 d；G1～G3: 接種后10 d。D1-D3: 0-day after inoculation; E1-E3: 3-day after inoculation; F1-F3: 7-day after inoculation; G1-G3: 10-day after inoculation.

2.3E.pisi菌絲體在苜蓿葉片表面的擴(kuò)展

圖3 E. pisi在紫花苜蓿葉片上的擴(kuò)展Fig.3 The invasion of E. pisi on alfalfa leaves

以錐蟲藍(lán)染色病原菌絲體，對(duì)E.pisi在紫花苜蓿葉片上的擴(kuò)展進(jìn)行觀察(圖3)。接種3 d，分生孢子產(chǎn)生吸器，尋找適宜的入侵點(diǎn)；德寶葉片上吸器發(fā)育迅速，菌絲伸長生長，有些菌絲出現(xiàn)分枝，分枝向外圍擴(kuò)展，進(jìn)而形成更多的吸器吸收營養(yǎng)(圖3, 3 d)；至7 d，菌絲伸長生長，分枝更多(圖3, 5 d)；觀察發(fā)現(xiàn)，植物細(xì)胞過敏反應(yīng)壞死處，菌絲擴(kuò)展受到較明顯的抑制(圖3 H，I)，其他部位隨著病原菌的進(jìn)一步擴(kuò)展、侵染，菌絲覆蓋至整個(gè)葉面，密結(jié)成網(wǎng)(圖3, 7 d)。

3 討論

楊若林等[6]報(bào)道白粉菌侵染小麥后，葉肉細(xì)胞排列變得比較松散，細(xì)胞及葉綠體的輪廓變得模糊不清，部分葉綠體還從細(xì)胞周邊遷移到細(xì)胞的中央；維管束鞘和維管束細(xì)胞的壁變厚，維管束鞘的細(xì)胞之間、維管束鞘與維管束的細(xì)胞之間以及維管束內(nèi)細(xì)胞之間的界限也變得模糊不清；維管束鞘內(nèi)層和外層的細(xì)胞萎縮或解體。白粉菌侵染使小麥葉片表皮細(xì)胞遭受破壞，對(duì)葉肉和維管束組織也產(chǎn)生了一定的影響。黑腐病原菌 YL-17 菌種侵染大白菜幼苗葉片后，大白菜幼苗葉肉細(xì)胞變大，細(xì)胞數(shù)目變少，細(xì)胞排列逐漸疏松，尤其是柵欄組織細(xì)胞；細(xì)胞內(nèi)葉綠體由原來的貼壁分布變?yōu)榛靵y分布，且數(shù)量逐漸變少[13]。李海英等[20]在對(duì)大豆(Glycinemax)灰斑病的研究中發(fā)現(xiàn)，抗病大豆品種葉片的柵欄組織層數(shù)相對(duì)較多，且排列整齊緊密，并且第一層?xùn)艡诮M織比感病品種顯著肥厚。馮麗貞等[21]在對(duì)桉樹(Eucalyptusrobusta)焦枯病的研究中發(fā)現(xiàn)，高抗桉樹品種的葉片柵欄組織細(xì)胞排列整齊、緊密，且層數(shù)相對(duì)較多，海綿組織細(xì)胞間隙小。前人的研究認(rèn)為柵欄組織可能在抵抗病害侵染中扮演著重要角色[22]，柵欄組織發(fā)達(dá)可能是植物抗逆性葉的結(jié)構(gòu)特征[23]。

本人研究結(jié)論不同于前人報(bào)道。首次發(fā)現(xiàn)，接種E.pisi后，紫花苜蓿葉片的柵欄組織細(xì)胞由一個(gè)長圓形細(xì)胞變?yōu)槎鄠€(gè)偏圓形小細(xì)胞，增加了進(jìn)行光合作用的葉肉細(xì)胞層數(shù)。結(jié)構(gòu)決定功能。這種變化或許可以解釋為E.pisi侵染后，苜蓿將營養(yǎng)物質(zhì)和光合作用功能局域化，光合單位最小化，這可能是苜蓿抵御病原菌侵染的策略之一。柵欄組織細(xì)胞含有大量的葉綠體，是植物光合作用的重要場所，其體積大，在上表皮細(xì)胞下只有1層或1～2層。一旦病原菌侵染成功，損害柵欄組織細(xì)胞的光合作用功能，可能對(duì)植物造成巨大傷害。苜蓿葉片柵欄組織細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變可能規(guī)避這種風(fēng)險(xiǎn)，將病原菌對(duì)植物葉片光合作用的損害降低到最小，將功能發(fā)揮到最大。

一般認(rèn)為，寄主植物的抗病性是植株在形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化等方面所表現(xiàn)的綜合結(jié)果。前者主要通過寄主形態(tài)結(jié)構(gòu)的差異產(chǎn)生物理上的阻礙，或通過誘導(dǎo)寄主形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而機(jī)械地阻礙病原菌的侵染；后者則主要是當(dāng)病菌侵入寄主時(shí)或侵入后，誘導(dǎo)寄主的生理生化過程發(fā)生改變而抵抗病原物的侵染。本文的研究或許可以補(bǔ)充這一結(jié)論，寄主植株在形態(tài)結(jié)構(gòu)方面的變化不僅僅增加了病原菌入侵的機(jī)械阻礙，而且通過保持細(xì)胞的基本功能正常運(yùn)轉(zhuǎn)來減輕病原菌的傷害。

4 結(jié)論

紫花苜蓿受白粉菌侵染后，無論抗性強(qiáng)弱，葉片葉肉細(xì)胞，尤其是柵欄組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。這種葉片內(nèi)葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)的變化可能對(duì)植物抗病性具有積極作用。

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Structural changes in leaves inMedicagosativainfected withErysiphepisi

ZHANG Yong-Mei1,2, MA Hui-Ling2*, TANG Yun-Zhi2

1.InstrumentalResearch&AnalysisCenter,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China; 2.PrataculturalCollege,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China

To explore the relationship between plant cell structure and disease resistance, two alfalfa (Medicagosativa) cultivars with different levels of resistance were analyzed after inoculation with the powdery mildew fungus,Erysiphepisi. Leaves were harvested at 0, 3, 7, and 10 days after inoculation, embedded in paraffin, and cut into sections to observe cell structural changes. The cellular structure of palisade tissue changed after infection withE.pisi. Palisade cells of the resistant alfalfa line changed from a single long cylindrical cell into several subrotund cells that were distributed evenly and arranged compactly. The mesophyll cell layer increased from 4-5-cells thick before infection to 7-8-cells thick after infection. There were two notable changes in the palisade cell structure of susceptible alfalfa. One was that long cylindrical palisade cells changed into several subrotund cells with a non-uniform distribution and more space between cells. The other was that palisade cells near vascular bundles retained their long cylindrical shape and stayed in a compact arrangement with only small spaces between cells.

anatomical structure; palisade tissue; spongy tissue; disease resistance

10.11686/cyxb2016123

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-03-23；改回日期：2016-05-11

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)盛彤笙科技創(chuàng)新基金(GSAU-STS-1343)和“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃專題(2012BAD12B02-4)資助。

張?jiān)伱?1974-)，女，甘肅武威人，副研究員，博士。E-mail:zym824@sina.com

*通信作者Corresponding author. E-mail:mahl@gsau.edu.cn

張?jiān)伱? 馬暉玲, 唐云智. 紫花苜蓿葉片受白粉病菌侵染后結(jié)構(gòu)的變化. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(2): 88-94.

ZHANG Yong-Mei, MA Hui-Ling, TANG Yun-Zhi. Structural changes in leaves inMedicagosativainfected withErysiphepisi. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(2): 88-94.