紫花苜蓿根腐病原
——厚垣鐮刀菌的鑒定及其拮抗菌的篩選

柏玉晶，姚玉玲，張振粉，楊成德，薛莉

(甘肅農業大學植物保護學院，草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅省草業工程實驗室，中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州730070)

紫花苜蓿根腐病原
——厚垣鐮刀菌的鑒定及其拮抗菌的篩選

柏玉晶，姚玉玲，張振粉，楊成德*，薛莉

(甘肅農業大學植物保護學院，草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅省草業工程實驗室，中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州730070)

采用常規組織分離法，對甘肅省武威市紫花苜蓿根腐病菌進行分離和致病性測定，并通過形態學特征和分子鑒定方法對致病性最強的菌株進行鑒定。結果表明，MXGF7可造成紫花苜蓿嚴重根腐，該病原菌大型分生孢子多紡錘形或鐮刀形，大小為3.3～4.7 μm×14.8～32.0 μm；小型分生孢子少，紡錘形或啞鈴形，大小2.9～4.2 μm×8.4～18.2 μm；ITS序列及鐮孢菌Fu3/Fu4區基因序列分析表明，病原菌均與Fusariumchlamydosporum的相似度達99%，結合形態學特征將該病原菌鑒定為厚垣鐮孢菌F.chlamydosporum。采用平板對峙法，從分離自東祁連山高寒草地牧草的123株內生細菌中篩選出61株菌株對F.chlamydosporum有拮抗效果，且抑菌率均在55%，并利用形態特征和16S rDNA基因序列分析將具有穩定拮抗作用265ZY3菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens。

苜蓿根腐??；厚垣鐮孢菌；內生細菌；鑒定

紫花苜蓿(Medicagosativa)為優良的多年生豆科牧草，利用年限長，產草量高，營養好，再生性強，是畜牧業首選青飼料，有“牧草之王”的稱號，在世界各國廣泛種植[1]。但是，隨著利用年限的增長，苜蓿根腐病發生日趨嚴重，已成為苜蓿栽培中的重要限制因素之一，其在美國、加拿大、澳大利亞、俄羅斯、日本和阿根廷等國家[2-4]及國內新疆、甘肅、青海和內蒙古等地均嚴重發生[5-8]。該病害為害苜蓿全生育期，使其固氮能力降低，植株衰弱，單產和品質下降；據估計每年全世界造成的產量損失在20%左右，嚴重發生的地塊達到40%[9]。苜蓿根腐病的病原研究報道較多，但均主要認為由鐮孢菌屬真菌引起，如李敏權等[10]報道甘肅省中部干旱地區主要病原為尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum)、銳頂鐮孢(F.acuminatum)和半裸鐮孢(F.semitectum)；王多成等[11]報道，甘肅省張掖市引起苜蓿根腐病的病原是茄鐮孢(F.solani)、串珠鐮孢(F.moniliforme)和尖孢鐮孢；潘龍其等[12]報道內蒙古赤峰市主要病原為擬枝孢鐮孢菌(F.sporotrichioide)。鐮孢屬厚垣鐮孢(F.chlamydosporum)可引起多種植物病害，如其可造成木耳的“白毛菌”病，導致木耳耳片霉爛[13]，還可以引起大豆根腐病[14]、阿爾及利亞地中海油松幼苗腐爛病[15]及番石榴的枯萎病[16]等，但該病原菌引起苜蓿根腐病的報道未見。本試驗從甘肅省武威市苜蓿根腐病標本中分離獲得一株致病鐮孢菌，其形態與厚垣鐮孢相似。因此，本試驗利用形態學特征和分子方法對其進行了鑒定，并對其拮抗內生細菌進行了篩選和鑒定，以期為該病害的診斷和綜合防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 病原的分離與純化

供試苜蓿根腐病樣于2013年采自甘肅省武威市黃羊鎮，實驗室常規組織分離法分離病原菌，在PDA培養基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂17 g，蒸餾水1000 mL)上進行培養與純化，待純化的菌株產孢后進行單孢分離，進一步純化后移入PDA斜面培養保存備用[17]。

1.2 致病性測定

離體試驗：采用致傷接種法。將苜蓿播種于直徑12 cm的塑料花盆中，在溫度為20～30 ℃的室內培育植株至40 d苗齡時，選取健康的苜蓿，將分離物在PDA培養基上培養5 d后打成直徑6 mm的菌餅接于傷口處，以無菌PDA培養基為對照，保濕48 h，25 ℃培養，3次重復，連續觀察根部發病情況并記錄數據，計算發病率。發病率(%)=總發病株數/總調查數×100。

浸根接種法：將苜蓿播種于直徑12 cm的塑料花盆中，在溫度為20～30 ℃的室內培育植株至40 d苗齡時，將根部稍加損傷，用濃度為106cfu/mL的孢子懸浮液浸根15 min，用無菌水浸根做對照，后移至花盆繼續生長，3次重復，連續觀察根部發病情況并記錄數據，計算發病率。

形成典型癥狀后對發病植株進行再分離，按柯赫氏法則[17]確定致病菌。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 形態學鑒定 將菌株接于PSA培養基25 ℃培養待產孢后，在顯微鏡下觀察分生孢子、分生孢子梗及產孢細胞的形態特征；在40倍鏡下分別測定大、小分生孢子、厚垣孢子大小(50個)，并在顯微鏡下拍照。根據病原菌形態特征，參照《真菌鑒定手冊》[18]和《鐮刀菌屬》[19]等參考資料進行鑒定。

1.3.2 分子鑒定 DNA提?。簩⒕杲佑赑DA培養基于25 ℃下培養5～10 d后,刮取菌絲0.2 g于1.5 mL離心管中；加入混合均勻的螯合樹脂150 μL，用電動組織研磨器充分研磨至菌絲成糊狀、螯合樹脂內的固體顆粒消失；再加入螯合樹脂150 μL；沸水浴15～20 min；4 ℃,12000 r/min離心10 min，取上清液。經電泳檢測將具有特異性條帶的DNA提取物進行PCR擴增[20]。

利用ITS1(5′-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A -3′)、ITS4(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)及鐮孢菌特異性引物Fu3(5′-CCG AGT TTA CAA CTC CCA AA-3′)、Fu4(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)對病原菌基因組DNA進行PCR擴增[21]。兩種引物均由華大生物工程有限公司合成。其擴增體系均為：2×MasterMix 25 μL,引物各3 μL，DNA模板2 μL(以加2 μL雙蒸水為空白對照)，最后用雙蒸水定容到50 μL。擴增程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，具特異性條帶的產物送華大生物工程有限公司測序。將測序結果與GenBank中的相關序列進行同源性比較，明確其種類。

1.4 拮抗內生細菌的篩選及鑒定

1.4.1 拮抗內生細菌的篩選 采用平板對峙培養法[17]。以東祁連山高寒草地牧草的根、莖、葉部分離的126株內生細菌為供試拮抗菌(由甘肅農業大學草業學院微生物多樣性實驗室提供)，將病原真菌置于PDA培養基上活化培養5 d后打成直徑 6 mm的菌餅，接種在PDA培養基中央，內生拮抗菌經24 h活化培養后點接在距菌餅2.5 cm處，每平板4點，以點接無菌水為對照，25 ℃培養，3次重復，待對照病原真菌長滿培養皿后測量處理菌落直徑(cm)，以抑菌率表示內生細菌的抑菌能力。抑菌率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100。

1.4.2 形態學鑒定 將優良拮抗菌株于NA平板劃單菌落，28 ℃培養3 d后觀察并描述單菌落形態特征；在NA平板上培養24 h后進行革蘭氏染色，并測量菌體大小(30個)和顯微照相[17]。

1.4.3 16S rDNA序列分析 用細菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生物工程有限公司，Ezup柱式基因組細菌DNA抽提試劑盒)提取病原菌的基因組DNA。采用通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 1492r (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[22]擴增拮抗菌株的16S rDNA。其擴增體系為：10×buffer 5 μL，MgCl2(25 mol/L)3 μL，dNTP(5 mmol/L)1 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，引物1(10 μmol/L)1 μL，引物2(10 μmol/L)1 μL，模板DNA 1 μL(以加1 μL雙蒸水為空白對照)，最后用ddH2O定容到50 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，48 ℃退火30s，72 ℃延伸1 min，循環32次；72 ℃下延伸8 min。 PCR產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，具特異性條帶產物送華大生物工程有限公司進行測序，將測序結果與GenBank中的相關序列進行同源性比較，明確其種類。

2 結果與分析

2.1 田間癥狀

發病初期苜蓿根及根頸部產生褐色壞死斑，根部橫切發現維管束呈棕色，隨后病斑逐漸擴大，最后呈現嚴重腐爛變為深褐色及黑色，維管束腐爛呈中空；地上植株生長緩慢，葉片變黃枯萎,最后植株死亡(圖1)。

2.2 病原菌的分離及其致病性測定

從多個發病根部進行常規分離法、單孢純化，得到8個真菌分離物(圖2)，其培養性狀、菌絲形態、孢子形態各不相同，并將8個分離物依次編號為MXGF1、MXGF2、MXGF3、MXGF4、MXGF5、MXGF6、MXGF7和MXGF8。對其進行致病性測定發現離體接種8株菌株的苜蓿根部全部發??；浸根接種后MXGF2’、MXGF4’、MXGF6、MXGF7、MXGF8發病率100%，MXGF2發病率75%，MXGF4、MXGF5發病率50%。

離體致病性試驗表明，接種部位深褐色、腐爛，表面產生白色霉層，剖開發病部位，根部維管束向內變為褐色(圖3B)，與田間癥狀一致，對照無癥狀(圖3A)。將苗齡為40 d的苜蓿根用濃度為106cfu/mL的孢子懸浮液浸根15 min后移至花盆繼續培養，30 d后，葉片由外向內逐漸枯黃，后地上部分開始萎蔫；根部致傷部位先出現水漬狀壞死斑，后病斑擴大顏色變為褐色、深褐色(圖2)，發病嚴重的腐爛部位變為黑色且凹陷變空(圖2H)；根頸及根頸部分節處呈褐色、紅褐色至黑色腐爛病斑(圖3D)，對照無癥狀(圖2A、圖3C)。

2種方法從發病部位再分離均可得到與原接種真菌相同的分離物，根據柯赫氏法則，確定8株菌株均為苜蓿根腐病的致病菌。其中根據發病程度發現，MXGF7菌株的病斑明顯大，且發病嚴重于其他菌株(圖2H)，所以對MXGF7做了后續研究。

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 形態學鑒定 25 ℃培養5 d后，菌落長滿培養皿。菌落圓形，絨毛狀，初生菌絲奶白色，后略帶黃色，氣生菌絲發達(圖4A)，培養基背面由內向外呈黃棕色至淡黃色(圖4B)。7 d左右開始產生分生孢子。產孢細胞單瓶梗,大小2.3～7.0 μm×6.8～17.5 μm(圖4C)。

圖1 苜蓿根及根頸腐爛病癥狀Fig.1 Symptoms of alfalfa rot on crown and root

小型分生孢子少，紡錘形或啞鈴形，0～1隔，大小8.4～18.2 μm×2.9～4.2 μm。大型分生孢子多紡錘形或鐮刀形，兩端鈍、基部具足跟(圖4D)或細長、兩端逐漸變尖、基部具腳泡(圖4E)，多3～5隔，3隔孢子大小14.8～29.6 μm×3.3～4.5 μm，5隔孢子大小24.53～32.0 μm×3.8～4.7 μm。厚垣孢子圓形，間生或串生，直徑 7.2～29.3 μm(圖4F)。參考相關文獻[18-19]，根據形態特癥初步鑒定該菌株為厚垣鐮孢菌F.chlamydosporum。

圖2 浸根接種苜蓿根部發病情況Fig.2 The smptoms on alfalfa root by dipping root inoculation A:對照Contrast; B:MXGF2; C:MXDF2’; D:MXGF4; E:MXGF4’; F:MXGF5; G:MXGF6; H:MXGF7; I:MXGF8.

圖3 MXGF7致病性測定Fig.3 Pathogenicity test of the pathogen of MXGF7 A：根部橫切對照；B：根部橫切發病癥狀；C：根頸部對照；D：根頸部發病癥狀。A: The crosscutting control of root; B: The crosscutting symptoms of root; C: The control of root crown; D: The symptoms of root crown.

2.3.2 分子鑒定 利用引物ITS1、ITS4和Fu3、Fu4分別對病原菌基因組DNA進行PCR擴增，擴增產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以DNA Marker-DL2000為對照，具特異性條帶的擴增產物送往華大生物工程有限公司測序，將測序結果在GenBank中進行同源序列比較，下載相似性高的序列，并用Mega(5.0)軟件采用鄰接法構建系統發育樹。結果顯示，ITS基因擴增序列為528 bp，與F.chlamydosporum(KT211539.1)相似度達99%，在系統發育樹上聚在一起(圖5)；引物Fu3/Fu4擴增序列509 bp，在GenBank中經同源序列比較發現其與F.chlamydosporum(HQ654898.1)的同源性在99%以上，且在系統發育樹上與其聚在一起(圖6)，即二者親緣關系最近。結合形態特征，將該病原菌鑒定為厚垣鐮孢菌F.chlamydosporum。

2.4 拮抗內生細菌的篩選與鑒定

圖4 病原菌形態特征Fig.4 Morphological characters of the pathogens A：菌落正面；B：菌落背面；C：產孢細胞；D～E：大型分生孢子；F：厚垣孢子。A:Upper surface of the colony; B: Reserved surface of the colony; C: Conidiogenous cell; D-E: Macroconidia of the pathogen; F:Chlamydospore.

圖5 基于ITS基因序列的系統發育樹Fig.5 Phylogrnetic tree based on ITS gene sequence

2.4.1 拮抗內生細菌的篩選 經平板對峙培養表明，分離自高寒草地123株細菌中有61株對厚垣鐮孢菌有拮抗效果，且抑菌率均在55%以上，其中菌株263AG5′抑菌能力最強，抑菌率達69.93%，其次為菌株263ZY1、263XY1、261AY3，其抑菌率分別為69.35%、69.26%和69.23%(表1)。

圖6 基于鐮孢菌專用引物Fu3/Fu4擴增序列的系統發育樹Fig.6 Phylogrnetic tree based on the Fu3/Fu4 specificity sequence of pathogenic fungus表1 部分內生細菌對厚垣鐮孢菌的抑菌能力測定(抑菌率65%以上)Table 1 Inhibition rate of endophytic bacteria on Fusarium chlamydosporum(more than 65% antibacteria ratio)

拮抗菌株Antagonisticstrains處理菌落直徑Treatingcolonydiameter(cm)抑菌率Antifungalratio(%)拮抗菌株Antagonisticstrains處理菌落直徑Treatingcolonydiameter(cm)抑菌率Antifungalratio(%)CK18.17a0.00d262AY83.03bcd66.00ab263ZY23.22b64.57bc265ZG32.95cd67.11ab263ZY43.10c66.09bcCK57.65a0.00b263ZY12.85e69.35a261AG32.82bc67.60ab261ZG142.92d68.48ab261AG92.87bc66.90ab263ZG53.17bc65.22cASZ42.78bc68.07ab264ZY103.10c66.09bc針2Zhen22.95b65.73ab263ZG93.10c66.09bc263AG5'2.65e69.93aCK27.62a0.00a261AY72.93b65.97ab262XY6'2.87bc66.75b261AY3'2.77bc68.30ab262XY12.88b66.51b261MY62.83bc67.37ab265ZY62.80c67.68b262AG62.82bc67.60abCK37.98a0.00c264AY12.87cd66.90ab265XG73.12b65.03b261AY32.70de69.23a263XY12.80c69.26aXSG42.80cd67.83ab262XY2'3.05b65.92b線3Xian32.78bc68.07abCK47.95a0.00c針1Zhen12.80cd67.83ab262AY63.10b65.10abCK67.57a0.00b265XY43.10b65.10ab矮2Ai22.80b67.45a265AG133.03bc66.00b矮3Ai32.82b67.22a265ZY32.92cd67.56a矮4Ai42.88b66.28a265ZY22.97cd66.89ab264ZY72.8267.22a263XY32.90cd67.79a---

注：小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著。

Note: Lowercase letters is significantly atP<0.05 level.

2.4.2 內生拮抗細菌對病原菌菌絲及孢子的影響 厚垣鐮孢菌正常菌絲呈淡黃褐色，菌絲均勻光滑，銳角分支，有隔膜，分支和隔膜處均有隘縮(圖7,CK-2)；大型分生孢子鐮刀形，細胞壁均勻光滑，有明顯隔膜，隔膜處有隘縮。受拮抗細菌影響的菌絲顏色變深，菌絲或膨大變粗或變細，粗細不均勻，隔膜消失或變得不明顯(圖7,263XY1-2)，膈膜間膨大呈球形，菌絲呈念珠狀(圖7,263AG5’-2)，有的菌絲中間出現泡狀物(圖7,261AY3-2)；分生孢子隔膜消失，孢子體中間出現許多泡狀物，有的孢子壁變形不光滑呈波浪狀，有的孢子出現嚴重不規則變形。

2.4.3 形態學鑒定 經抑菌、溶磷、固氮和產吲哚乙酸能力綜合篩選，獲得功能性良好的菌株265ZY3，并對其進行鑒定。將265ZY3在NA培養基上28 ℃培養3 d，菌落大小為0.5～1.0 cm，不規則形，邊緣呈波狀，表面褶皺，干燥，中間向上隆起，圓形，奶白色(圖8A)；革蘭氏染色呈陽性，桿狀(圖8B)，菌體大小為0.36～0.77 μm×1.18～3.04 μm。

2.4.4 16S rDNA序列分析 經電泳檢測對具有特異性條帶的DNA樣品用引物27 f和1492 r進行PCR擴增，以DNA Marker-DL2000為對照，在1500 bp附近有一條明顯的擴增條帶。測序后所得rDNA-ITS序列為株265ZY3與GenBank中菌株B.amyloliquefaciens(KF831366.1)的相似性為100%，與其他菌株的相似性均在99%以上，下載相似性較高的序列，并用Mega(5.0)軟件采用鄰接法構建系統發育樹，該菌株與解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens(KF831366.1) 聚在一起(圖9)，即與其親緣關系最近，結合形態學特征，鑒定其為解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens。

圖7 3株拮抗細菌對病原菌菌絲的影響Fig.7 Effect of antagonistic strains to mycelium

1455 bp。經在GenBank中進行同源序列比較，表明菌

圖8 265ZY3單菌落(A)與革蘭氏染色(B)Fig.8 A single colony (A) and gram staining (B) of 265ZY3

圖9 265ZY3菌株的16S rDNA系統發育樹Fig.9 16S rDNA phylogenetic tree of strain 265ZY3

3 討論

3.1 苜蓿根腐病的研究

最早研究苜蓿根和根頸腐病的學者是 Cormack，他對加拿大他亞伯達Abert苜蓿根部寄生真菌進行了研究，明確了銳頂鐮孢，燕麥鐮孢菌(F.avenaceum)和立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)在苜蓿中的寄生情況[23]。苜蓿根腐病是一種典型的土傳病害，病原種類較多，先后報道的該病病原已達29種，其中鐮孢菌14種，細菌2種，線蟲1種，其他病原菌12種[24,12]。目前國內外已報道的鐮孢菌有：尖孢鐮孢、燕麥鐮孢菌(F.avenaceum)、茄鐮孢、銳頂鐮孢、黃色鐮孢菌(F.culmorum)、三線鐮孢菌(F.tricinctum)、接骨木鐮孢菌(F.sambucinum)、鏈狀鐮孢菌 (F.fusarioides)、木賊鐮孢菌(F.equisti)、半裸鐮孢、串珠鐮孢、大刀鐮孢菌(F.Culmorum)、梨孢鐮孢菌(F.poae)和擬枝孢鐮孢菌。2001年我國陳雅君等[25]對黑龍江省紫花苜蓿進行了根腐病研究，確定了優勢致病菌為鐮孢菌和絲核菌；李敏權等[10]和王多成等[11]報道甘肅省苜蓿根腐病的病原有尖孢鐮孢、銳頂鐮孢、半裸鐮孢、茄鐮孢和串珠鐮孢；王蘭英等[26]對苜蓿根腐病原菌茄鐮孢、尖孢鐮孢和燕麥鐮孢進行了生防放線菌的分離與篩選；丁守彥等[27]做了不同品種苜蓿對鐮孢菌的抗性鑒定研究。本試驗分離鑒定的厚垣鐮孢菌所致苜蓿根腐病是國內首次報道。

3.2 鐮孢菌的鑒定方法

大多數菌物種類多，形態特征復雜，其形態除了受遺傳物質的控制外，還受環境的影響，其部分形態特征和生理生化指標會隨著培養條件的變化而不穩定，因此物種鑒定還極大的依賴于研究者的經驗。本試驗觀察到F.chlamydosporum在PDA培養基上和PSA培養基上孢子大小存在明顯差異，PDA上的分生孢子較小。研究資料表明，依據真菌形態特征進行分類鑒定受多種因素的影響，例如鐮孢菌的產孢條件難以摸索[28]，并且菌物形態上的相似性和許多有性態的未知性，通過培養性狀及表型鑒定很難將其在種級水平上分類，所以菌物的準確鑒定還必須結合現代分子生物技術，提高試驗結果的準確性。長期以來所采用的rDNA-ITS鑒定在真菌分類和發育系統中廣泛應用，王曉英等[29]又結合鐮孢菌rDNA 18S、5.8S、28S及其區間ITS1和ITS2序列設計了鐮孢菌專用引物Fu3/Fu4，其區間序列表達和調控十分保守，可以較好的表現鐮孢菌在種一級的關系，近幾年在鐮孢菌的鑒定上得到了廣泛的應用。劉文波等[30]利用ITS區的不同引物對香蕉枯萎病菌的遺傳多態性進行了研究，也進一步證明了引物的特異性。所以，為了提高物種鑒定的準確性，應進一步擴大分子鑒定方法在菌物鑒定中的研究和應用，并綜合各方面的資料和研究者的經驗，以克服單一方法的局限性。

3.3 苜蓿根腐病的生物防治

苜蓿根腐病為土傳性病害，在苜蓿生長的各個時期只要條件適宜，土壤中的病原均可以侵染寄主，致防治困難。近年來植物內生細菌對病原菌的拮抗作用成為人們關注的熱點，對其做了廣泛的研究并取得了良好的效果。內生細菌廣泛存在于植物體內[31]，其中芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和腸桿菌屬(Eterobacter)內生細菌最為常見[32]。內生細菌可以通過誘發植物自身的抗病潛能而增強植物的抗病性，其自身還可以合成多種物質來促進植物生長，產生多種代謝產物來抑制植物病原菌生長，且其存在于宿主體內，可以長期發揮作用，相對于其他生防因子有獨特的優勢，可能會對防治困難的土傳根腐病有更好的防治作用。Bacon等[33]分離的玉米內生枯草芽孢桿菌與玉米病原真菌串珠鐮孢有相同的生態位，枯草芽孢桿菌能在玉米體內迅速定殖，可有效降低串珠鐮孢毒素的積累。郭榮君等[34]利用營養競爭平板篩選法，篩選到2株可完全抑制尖孢鐮孢和茄鐮孢菌絲生長的枯草芽孢桿菌，對真葉期大豆根腐病有很好的防治效果。本試驗從高寒草地牧草內生細菌中篩選了該病原菌的拮抗細菌并進行了鑒定，以期為其生物防治提供菌種資源，但該研究僅在室內進行了抑菌試驗，還需對其抑菌機制、拮抗細菌的定殖動態及其防效等進一步研究，為研制對苜蓿根腐病具有良好防治效果的生物菌肥制劑奠定基礎。

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Identification of alfalfa root rot caused byFusariumchlamydosporumand screening of antagonistic bacterial strains

BAI Yu-Jing, YAO Yu-Ling, ZHANG Zhen-Fen, YANG Cheng-De*, XUE Li

CollegeofPlantProtection,GansuAgriculturalUniversity,KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,PrataculturalofGansuProvince,Sino-U.S.CenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China

To identify the causal pathogens of alfalfa root rot with strong pathogenicity, pathogens were isolated from alfalfa (Medicagosativa) plants with alfalfa root rot growing in Wuwei City, Gansu Province. The pathogens were identified based on their morphology and by molecular methods. The results showed that the strain MXGF7 caused acute root rot of alfalfa. Most of its macroconidia were fusiform or sickle-shaped (3.3-4.7 μm×14.8-32.0 μm), and its microconidia were fusiform or dumbbell-shaped (2.9-4.2 μm×8.4-18.2 μm). The ITS sequence and the Fu3/Fu4 specificity gene sequence of the pathogenic fungus shared 99% similarity with those ofFusariumchlamydosporum, and so the pathogenic fungus was identified asF.chlamydosporum. We isolated 123 endophytic bacterial strains from alpine grassland in the Eastern Qilian Mountains, and evaluated their ability to antagonize the pathogenic strain ofF.chlamydosporum. Sixty-one of the bacterial strains showed an antifungal ratio greater than 55%. The most antagonistic bacterium, strain 265ZY3, was identified asBacillusamyloliquefaciensbased in its morphology and 16S rDNA gene sequence.

alfalfa root rot;Fusariumchlamydosporum; endophytic bacteria; identification

10.11686/cyxb2016111

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-03-14；改回日期：2016-04-19

國家自然科學基金(No.31460639),草業生態系統教育部重點實驗室(甘肅農業大學)開放課題項目(CYzs-2011011),甘肅省農牧廳科技支撐項目和甘肅省自然科學基金(145RJZA130)資助。

柏玉晶(1989-), 女, 甘肅白銀人, 碩士。E-mail: 1345491709@qq.com

*通信作者Corresponding author. E-mail:yangcd@gsau.edu.cn

柏玉晶, 姚玉玲, 張振粉, 楊成德, 薛莉. 紫花苜蓿根腐病原——厚垣鐮刀菌的鑒定及其拮抗菌的篩選. 草業學報, 2017, 26(2): 78-87.

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