白藜蘆醇誘導腫瘤細胞凋亡的機制

張麗娜 顧恪波 吳潔 孫岸弢 張晨 張明輝

·綜述與講座·

白藜蘆醇誘導腫瘤細胞凋亡的機制

張麗娜 顧恪波 吳潔 孫岸弢 張晨 張明輝

白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種天然可食用的多酚類化合物，主要來源于葡萄、漿果、花生以及虎杖等多種植物的塊根提取物，其中虎杖在我國具有悠久而重要的藥用歷史。近年大量報道表明，Res具有一定的抗氧化、抗炎和抗腫瘤作用。然而其誘導腫瘤細胞凋亡的分子機制尚未完全闡明。據近年來諸多研究結果，本文對白藜蘆醇誘導腫瘤細胞凋亡的分子機制作一簡單綜述，以供研究者參考。

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白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種天然可食用的多酚類化合物，主要來源于葡萄、漿果、花生以及虎杖等多種植物的塊根提取物，其中虎杖在我國具有悠久而重要的藥用歷史。近年大量報道表明，Res具有一定的抗氧化、抗炎和抗腫瘤作用。然而其誘導腫瘤細胞凋亡的分子機制尚未完全闡明。據近年來諸多研究結果，本文對白藜蘆醇誘導腫瘤細胞凋亡的分子機制作一簡單綜述，以供研究者們參考。

1 增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量，啟動內源性凋亡信號

近年來，大量研究證實ROS可通過多種途徑導致線粒體功能障礙，使線粒體通透性轉換通道(permeability transition pore，PTP)在病理狀態下開放，將細胞色素C(cytochromr C)和其他促凋亡因子釋放到胞質中，激活半胱氨酸蛋白酶3 (caspase-3)，從而引起瀑布效應，誘導細胞凋亡[1]。然而，腫瘤細胞通常顯示出高于正常水平的ROS含量，這不僅能促使腫瘤進展、侵襲，而且可使腫瘤細胞更容易受到進一步的ROS傷害[2]。事實上，目前許多抗腫瘤藥物正是通過誘導氧化應激殺死腫瘤細胞，盡管它們有時既針對腫瘤細胞，也作用于正常細胞。

但是作為一種天然可食用的、無毒無公害的植物提取物，Res及其類似物Pterostilbene(PTE)可通過增加ROS含量，強化氧化應激，降低線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)，在人肺腺癌A549、卵巢癌SKOV-3、多發骨髓瘤H929及彌漫大B淋巴瘤(DLBCL)細胞中啟動內源性凋亡途徑，誘導腫瘤細胞死亡[3-6]。且這種ROS含量的增加，可能是通過觸發細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2和JNK(c-Jun N-terminal kinase)等信號通路而實現的[5,6]。

2 參與對有絲分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族ERK，p38和JNK激酶的調節

有絲分裂原激活的MAPK信號通路涉及多種細胞過程，包括細胞的增殖、分化、凋亡，并參與免疫反應調節。最初被發現的MAPK成員是ERK1/2信號途徑，其磷酸化可啟動一系列底物，對細胞增殖、細胞周期進展、細胞分裂及分化進行調節。

相較于ERK1/2，p38和JNK激酶在MAP3K水平上具有較多的共有激活劑，一些MAP2K也能同時激活p38和JNK。而JNK和p38信號通路均參與應對一些應激性刺激，包括細胞因子、放射線照射、熱休克和滲透壓性休克等，并參與對應激、凋亡和細胞分化的調節。

不過，JNKs也有許多專門的底物，只有JNKs才能將之磷酸化；而p38s也有一些特有的底物，以確保兩者在應對應激性刺激時的各自需要。

Res可以激活MAPK家族的兩個成員p38和JNK激酶，同時抑制另一成員ERK1/2的活性，從而在人慢性骨髓源性白血病K562細胞系中誘導凋亡。它誘導位于Ser139的H2AX發生磷酸化，而H2AX的高表達可顯著增強Res誘導的K562細胞凋亡；突變的Ser139高表達(可以封閉H2AX的磷酸化)則可抑制Res誘導的K562細胞凋亡。這提示Res可能通過p38和JNK激酶調節的H2AX磷酸化誘導K562細胞的凋亡[7]。

3 上調過氧化物酶體增殖物啟動受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)水平

PPARγ屬于核受體超家族成員，是一個配體依賴性的轉錄因子，其激活在各種腫瘤細胞可導致生長周期停滯和(或)細胞凋亡。

有研究顯示，Res作用于結腸癌細胞，可激活PPARγ而抑制其增殖、促進其凋亡。而轉染顯性陰性的PPARγ突變體于相關結腸癌細胞，或治之以PPARγ拮抗劑，可反轉Res的抑制作用[8]。Res的同源合成物PTER-ITC作用于激素依賴性乳腺癌細胞MCF-7和非激素依賴性乳腺癌細胞MDA-MB-231后，均能調節PPARγ表達相關的基因，并增加PPARγ mRNA及其蛋白表達水平，運用PPARγ拮抗劑或PPARγ siRNA預處理則可抑制PTER-ITC誘導的細胞凋亡[9]。PTER-ITC是在PTER主體上添加一半異硫氰酸酯(isothiocyanate，ITC)而合成的，而PTER是二甲基化的Res同源物，其分子式為trans-3,5-dimethoxy-4'-hydroxystilbene。另外，該研究還表明，共同孵育于p38 MAPK或JNK的抑制劑，PTER-ITC介導的PPARγ上調就可以被抵消，說明p38 MAPK和JNK信號途徑均參與了PTER-ITC的作用[9]。此外，PTER- ITC還在PPARγ配體結合部位與5個極性的、8個非極性的殘基發生相互作用，對其活性的激活具有至關重要的作用。上述研究表明，PTER-ITC可能通過p38 MAPK和JNK信號途徑參與了PPARγ的激活，從而誘導結腸癌細胞凋亡。

4 抑制磷酸化蛋白激酶PKB(AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路

PI3K-AKT-mTOR信號通路已被證實是對腫瘤具有重要意義的三個主要信號通路之一。mTOR是PI3K/AKT的關鍵下游激酶，可以參與調解腫瘤細胞的增殖、成長、存活及血管生成。事實上，通過磷酸化，PI3K-AKT-mTOR可抑制促凋亡因子活性而激活抗凋亡因子活性。因此，抑制AKT/mTOR磷酸化是抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡的一個重要途徑。

有研究報道，HS-1793、Res的一種合成類似物，可以通過下調AKT的水平而抑制結腸癌細胞HCT116的生長，誘導其凋亡，并伴隨有形態學改變、二磷酸腺苷核糖多聚酶(poly ADP- ribose polymerase，PARP)裂解、Bax/Bcl-2比例改變和caspases 激活[10]。

此外，Res可誘導前列腺癌細胞的DDX5，即DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box helicase 5，亦即p68的表達水平降低；而DDX5耗減可通過抑制mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1)信號，促進細胞凋亡[11]。

當然，在AKT上游可能還存有其他調節機制。研究表明，Res在膀胱癌T24和5637細胞中可降低miR21表達，減少AKT磷酸化，降低Bcl2蛋白表達水平，從而誘導細胞凋亡；而高表達的miR21可恢復AKT活性，下調Bcl2表達和Res誘導的細胞凋亡[12]。說明Res可能通過miR21抑制Akt/Bcl2活性及表達，從而達到促凋亡作用。

5 激活AKT介導的轉錄因子FoxO3a

FoxO3是AKT下游FoxO轉錄因子家族成員之一，可調節細胞功能。Res在肝癌細胞系HepG2中可誘導凋亡，并伴隨有促凋亡蛋白Bim表達的增加，以及AKT調節的FoxO3磷酸化減少。而且，Res可使得核內FoxO3a水平增加而通過Bim調節細胞核的死亡。因此，Res誘導的肝癌細胞HepG2凋亡可能是通過AKT調節的FoxO3磷酸化減少，增加促凋亡蛋白Bim表達而實現的[13]。

6 下調NF-κB活性

Res通過加強細胞間連接及下調NF-κB活性，抑制上皮細胞-間充質轉化(EMT)起到化療增敏作用，可以增強5-氟尿嘧啶(5-Fu)對結直腸癌的抑制效果[14]。而Res加載明膠納米粒子(RSV-GNPs)后，亦可通過下調NF-κB表達，誘導非小細胞肺癌NCI-H460細胞凋亡[15]。

7 抑制JAK/STAT通路

Res可通過抑制JAK1、JAK2和Tyk2及其下游的調節因子STAT3和STAT5的磷酸化，從而抑制JAK2(V617F)突變的腫瘤細胞增殖，誘導其凋亡。這種對具有JAK2(V617F)突變的腫瘤細胞的選擇性效應，比沒有JAK2(V617F)突變的腫瘤細胞更為突出。在來自于JAK2(V617F)突變的真性紅細胞增多癥患者提供的血樣中，Res也抑制了紅系祖細胞集落的形成。而且與選擇性的JAK2抑制劑ruxolitinib聯用，可協同加強其清除JAK2(V617F)突變腫瘤細胞的作用。這些證據表明，Res可通過抑制JAK2通路，選擇性地誘導JAK2(V617F)突變的腫瘤細胞凋亡[16]。

另一項研究也證實，Res可持續抑制四種NK細胞系，即KHYG-1、NKL、NK-92和NK-YS的STAT3活性及JAK2磷酸化，但對STAT3活性有影響的其他上游調節因子如PTEN、TyK2和JAK1等則無明顯調節作用；對STAT3下游的兩個抗凋亡效應因子MCL1和survivin則具有下調的作用[17]。在惡性間皮瘤細胞MSTO-211H中，Res也通過下調MCL1蛋白水平，啟動生長抑制和誘導凋亡作用，并伴隨有procaspase-3裂解、底物PARP出現，caspase-3/7活性增強等效應[18]。

8 激活Fas調節的凋亡途徑

另一種Res的合成類似物，(E)-8-acetoxy-2-[2-(3,4-diacetoxyphenyl)ethenyl]-quinazoline(8-ADEQ)，可以通過增加ROS產生，增加Fas、Fas相關死亡死亡域(Fas-associated death domain，FADD)及FasL表達，促進死亡誘導信號復合物(death- inducing signaling complex，DISC)形成，在人白血病HL-60細胞系中誘導凋亡，并伴隨有MMP降低，細胞色素C釋放，以及caspases-8、caspases-9、caspases-6和caspases-3的激活，及其底物PARP的裂解[19]。

9 調節內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ER stress)

丙酮酸激酶M2(Pyruvate kinase M2，PKM2)在各種腫瘤細胞中往往呈現非正常的高表達狀態，并促進腫瘤生存。Res可通過降低PKM2表達水平，來增加(ER stress)蛋白及線粒體分裂蛋白(mitochondrial fission proteins)的表達，抑制腫瘤細胞的活性，降低融合蛋白(fusion proteins)的水平。這種現象可被人為地高表達PKM2所逆轉。而實驗中，隨著Res的干預microRNA-326 (miR-326)表達升高，若予miR-326模擬物干預則能降低PKM2水平，且促進ER stress及線粒體分裂的恢復。因此，miR-326/PKM2調節的ER stress和線粒體功能紊亂可能參與了Res誘導的腫瘤細胞凋亡[20]。

此外，CSTMP，一種TMP與Res衍生物的合成制劑，可以顯著誘導人骨髓瘤細胞系RPMI8226凋亡，也是通過增加ER stress相關蛋白如CHOP、GRP78、GRP94、裂解的caspase-12等表達，提高相關ER stress信號轉導因子PERK- eIF2α、IRE1α和ATF6活性而達成的。若通過siRNA抑制CHOP，就能顯著抑制CSTMP誘導的凋亡，提示CSTMP可能是通過CHOP依賴的ER stress途徑誘導線粒體功能紊亂及凋亡的[21]。

10 調節Notch1信號通路

有研究認為，下調Notch-1抑制腫瘤細胞生長、侵襲和轉移，此效應可能與激活Akt-mTOR和NF-κB信號通路有關[22,23]。而Res可誘導功能性的Notch1蛋白表達，并通過轉錄調節激活相關通路。在兩種甲狀腺未分化癌(anaplastic thyroid carcinoma，ATC)細胞系HTh7和8505C中，Res干預均可通過S期阻滯及誘導凋亡抑制其增殖，而且Res干預促進甲狀腺特有的基因包括TTF1、TTF2、Pax8以及鈉碘同向轉運體(sodium iodide symporter，NIS)的表達上調；通過siRNA靜默Notch1后，則可導致Res誘導的NIS表達反向降低。說明Res抑制ATC細胞生長及促進其再分化依賴于Notch1信號的激活[24]。

綜上所述，白藜蘆醇誘導腫瘤細胞凋亡的機制主要通過：(1)增加ROS含量，啟動內源性凋亡信號；(2)參與對MAPK家族ERK、p38和JNK蛋白激酶的調節；(3)上調PPARγ水平；(4)抑制AKT/mTOR信號通路；(5)激活AKT介導的轉錄因子FoxO3a；(6)下調NF-κB活性；(7)抑制JAK/STAT通路；(8)激活Fas調節的凋亡途徑；(9)調節ER stress；(10)調節Notch1信號通路等途徑而達成，其作用靶點及調節機制十分多樣，作用于多種不同的腫瘤細胞也顯示了較好的促凋亡效果，研究前景十廣闊。

但目前總的來說，在細胞研究中的報道較多而動物及人體實驗的報道較少，可能是由于白藜蘆醇的光敏感性及代謝不穩定性限制了其充分利用[10]。盡管報道中也有白藜蘆醇的同源合成物的研究報道，但是其光敏感性是否有所改善，其穩定性和干預作用是否能夠得到充分保存甚至是有所提高，目前未有報道的。另外，能否通過一些生物合成或修飾，提高其穩定性及干預效果，也是今后需要深入研究的課題。另外，從不同植物中提取的白藜蘆醇含量是否穩定，哪些植物可以為今后提供充分的藥源，這些問題也可能是今后需要進一步研究和解決的。

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