荷花MADS—box基因的克隆及表達分析

王婧

摘要：采用RT-PCR方法從微山紅蓮花苞中克隆獲得1個與花發育相關的MADS-box基因，命名為NeMADS1。該基因全長729 bp，包含1個720 bp的開放閱讀框，編碼239個氨基酸，具有典型的MADS結構域和K結構域。序列比對和系統進化分析結果表明，NeMADS1與E類家族AGL9/SEP-like3基因親緣關系較近。RT-PCR分析結果表明，NeMADS1基因在花瓣、雄蕊和心皮中表達。

關鍵詞：荷花；花發育；MADS-box；基因表達；RT-PCR

中圖分類號： S682.320.1；Q785 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0039-04

花發育的分子機理一直是植物分子生物學研究的熱點，MADS-box基因家族作為轉錄因子，在花發育過程中起重要作用。MADS-box基因不僅參與花發育的調控，還在開花時間的控制、決定分生組織的分化[1]、促進根的形成[2]，以及種子和果實發育[3-4]等方面都起著重要的作用。

前人在對雙子葉模式植物遺傳突變體的研究中，提出了花器官發育ABCDE模型[5-10]。典型雙子葉植物的花大多具有由外到內4輪結構：萼片、花瓣、雄蕊和心皮。模型認為控制花器官發育的基因按功能可以分成5類（A～E類功能基因），這些基因單獨或共同作用控制各輪花器官的發育[9]。隨著對擬南芥、矮牽牛、金魚草等模式植物的研究，已經克隆到很多MADS-box基因，僅擬南芥中就有100多種MADS-box基因[11]。

SEP（SEPALLATA）基因屬于MADS-box E類基因[9]，是花器官發育所必需的。擬南芥中有4個SEP基因：SEP1、SEP2、SEP3、SEP4（又稱AGL2、AGL4、AGL9、AGL3）[12-15]，SEP1、SEP2、SEP4基因在擬南芥花發育的早期花分生組織中起始表達；而SEP3主要在內3輪花器官原基中表達。隨著花原基的進一步發育，SEP1和SEP2在4輪花器官中均有表達[14]，而SEP3僅在花瓣、雄蕊和雌蕊中表達[8]，SEP4主要在萼片中表達[16]。目前為止，研究人員已從桃[17]、蘋果[18]、草莓[19]、春蘭[20]、文心蘭[21]等多種植物中分離克隆了SEP-like同源基因，并且對其表達模型及功能開展了相關研究。

荷花（Nelumbo nucifera Gaertn.），別稱蓮花，是中國十大傳統名花之一，具有很高的觀賞價值。目前，有關荷花花器官發育MADS-box基因的研究報道較少，更未見AGL9/SEP-like基因的研究報道。本研究以微山紅蓮的花苞為試驗材料，采用RT-PCR技術克隆獲得1個荷花花器官發育 MADS-box家族E類相關基因NeMADS1的全長序列，并分析其表達模式，為蓮科植物進化研究提供依據，同時為研究植物花發育模式以及荷花花器官發育的分子機理奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 植物材料

以吉林省經濟管理干部學院基地的微山紅蓮為試驗材料，于2015年8月取雌蕊分化后期花苞進行基因克隆。取盛花期花朵的萼片、花瓣、雄蕊、心皮進行RT-PCR表達分析。所有材料采集后均立即用液氮處理，于-80 ℃保存備用。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

以雌蕊分化后期花苞為材料，采用十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB法）提取其總RNA，用反轉錄試劑盒（SuperScriptTM Ⅲ Reverse Transcriptase， Invitrogen）合成cDNA，按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 基因克隆與序列分析

查找NCBI中EST序列信息及相關資料設計引物擴增基因全長，引物序列NeS1-F：5′-CTGAAATGGGGAGAGGTAGGGT-3′、NeS1-R：5′-CTGATCATGCCAGCCACCCAGGC-3′，以荷花花苞的cDNA為模板進行基因全長PCR擴增。反應體系為25 μL，反應程序為94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35個循環；72 ℃ 10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收目的片段，連接到pMD-19T（TAKARA）載體上，轉化DH5α菌株，進行克隆、測序。引物合成和測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司進行。

采用DNAMAN軟件進行序列拼接和分析，獲得的序列在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）網站上進行Blast比對，用MEGA 5.0和ClustalX軟件構建系統進化樹。

1.4 RT-PCR表達分析

提取盛花期花萼、花瓣、雄蕊和心皮的總RNA并反轉錄成cDNA，進行RT-PCR表達分析。設計引物NeS1-F2：5′-AACAGGGCATTGAAACGG-3′，NeS1-R2：5′-AGCCACCCAGGCATATAAC-3′，定量PCR采用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ kit（TAKARA）。反應體系為：10 μL SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（2×）mix，0.8 μL forward primer，0.8 μL reverse primer，2 μL cDNA，0.4 μL Rox Reference Dye or Dye（50×），6.0 μL H2O。反應條件為：95 ℃ 5 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。以Actin為內參（Actin-F：5′-TGCCTATGTGGCTCTTGACTAT-3′，Actin-R：5′-GATGGCTGGAATAGAACCTCA-3′）在Roche Lignt Cycler 2.0熒光定量PCR儀上反應，3次重復，采用2-ΔΔCT法進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 基因克隆與序列分析

以雌蕊分化后期的花苞總RNA反轉錄獲得的cDNA為模板進行PCR擴增，分離出長度為729 bp的片段，NCBI上進行Blast比對分析，結果表明該片段與多種植物的MADS-box基因有較高同源性，證明該片段為所需目的片段。通過DNAMAN軟件的序列拼接和分析，獲得基因全長為720 bp，編碼239個氨基酸（圖1），命名為NeMADS1。

蛋白結構域分析結果表明，該蛋白是植物特有的MIKC型MADS-box基因，包含典型的MADS盒（實線部分）和K盒（雙線部分）。Blast同源序列分析該基因與其他植物AGL9/SEP-like3基因具有較高的同源性。

2.2 NeMADS1氨基酸同源性比較

利用NCBI的BlastX工具將NeMADS1基因核酸序列翻譯成氨基酸序列并進行同源性比對，結果表明：NeMADS1與ABCDE模型中的E類蛋白有較高的同源性，其中與EpSEP3、PaAGL9、EcAGL9和PtSEP3的同源性分別是87%、84%、84%、83%。對NeMADS1基因氨基酸序列的多序列比對結果表明：SEP-like基因編碼氨基酸序列含有高度保守的5′端MADS結構域和半保守的K結構域，在差別較大3′端C-末端中發現了SEP-like蛋白特有的SEPⅠ和SEPⅡ基序結構域（圖2）。

2.3 系統進化樹分析

系統進化關系分析結果表明，NeMADS1編碼蛋白與 ABCDE 模型中的AGL9/SEP-like3（E類）基因編碼蛋白同源性較高，與領春木（Euptelea pleiosperma）的EpSEP3關系最近，說明NeMADS1應屬于E類MADS-box基因（圖3）。

A類和E類基因在進化上屬于AP1/AGL9組，該組有3個進化系：AGL9（SEP）、AP1和介于二者之間的AGL6進化系[21-22]。為了確定NeMADS1的歸類及進化關系，選取 AP1/AGL9 組MADS-box基因的氨基酸序列進行聚類分析。結果顯示，AP1/AGL9組氨基酸序列明顯分為3類：SEP、AP1和AGL6，其中AGL6與SEP分枝為姊妹關系，所有AGL9、SEP3聚在一起，然后又與SEP1/2/4聚在了一個大枝上（圖3）。

2.4 RT-PCR表達分析

RT-PCR分析結果表明，NeMADS1基因在花瓣、雄蕊和心皮中表達量較高，尤其在花瓣中表達量最高，在花萼中表達量最低。NeMADS1基因的表達模式與擬南芥SEP3基因在各組織的表達模式一致，進一步說明NeMADS1屬于E類基因（圖4）。

3 討論與結論

本試驗采用RT-PCR技術克隆了與花發育相關的NeMADS1基因。同源性分析結果表明，NeMADS1基因與其他植物的AGL9/SEP-like3基因具有較高的同源性，其蛋白質包含MADS區、K區、I區和C-末端等4個區域，屬于植物典型的MIKC類MADS-box基因。MADS-box蛋白的C-末端被認為與轉錄激活、高階蛋白質復合體的形成、DNA特異性識別、亞細胞定位等有關[23]。SEP亞家族大部分成員的C端具有2個短的、相對保守的基序（SEPⅠ和SEPⅡ基序）[15]。NeMADS1基因具有保守的SEPⅠ和SEPⅡ基序，是典型的SEP-like基因。

通過對SEP-like基因的系統發育分析，發現SEP亞家族發生過多次基因重復事件，其中在被子植物起源之前發生了1次基因重復事件，產生了SEP3進化系和SEP1/2/4進化系[15]。本研究對NeMADS1基因系統進化樹分析表明，所有的AGL9/SEP-like3聚在了一起，其中與領春木、昆欄樹（Trochodendron aralioides）的關系較近， 而三者均屬于基部雙子葉植物，這個結果與APGⅢ分類系統一致，說明AGL9/SEP-like3基因在進化上相對保守，同時也為蓮科在系統進化中所屬的位置提供了證據。

荷花SEP-like基因NeMADS1在花瓣、雄蕊和心皮中表達，這與擬南芥SEP3基因、加州罌粟（Eschscholzia californica）EScaAGL9基因在表達模式上一致[15]，而與草原龍膽（Eustoma grandiflorum）EgSEP3-1基因的表達模式有所差異[24]。SEP作為花器官同源異型基因ABCD的共因子（co-factor）在各輪花器官決定中發揮作用[8]。事實上，各進化系的表達模式是存在差異的[25]，雖然E類基因的表達模式在被子植物不同的物種中有差異，但該基因對所有花器官的發育都是必需的，其功能是保守的。

本試驗中分離出1個MADS-box基因家族E類基因，并對其功能進行了初步分析，有關其時空表達模式和深入功能分析工作也正在進行中，以期為闡明荷花花器官發育的分子調控機理奠定基礎。

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