烏司他丁對機械通氣相關性肺損傷模型兔肺組織中TNF—α的影響

閔軍　潘定斌　雷霆

【摘要】 目的：建立機械通氣相關性肺損傷模型兔肺組織，觀察TNF-α在機械通氣相關性肺損傷模型兔肺組織中TNF-α的變化規律，探討烏司他丁對呼吸機所致肺損傷（ventilator-induced lung injury，VILI）的治療機制是否與抑制TNF-α的活化有關。方法：采用大潮氣量通氣建立呼吸機相關肺損傷兔模型，模型成立后30、60、120、180、240 min，抽取動脈血作血氣分析，采用ELISA法檢測血清肺組織中TNF-α的含量，采用HE染色觀察肺組織病理變化，運用Real-time PCR、Western Blot檢測肺組織中TNF-αRNA、蛋白的表達。結果：家兔在大潮氣量機械通氣后，隨著時間的增加血清中、肺組織中TNF-α表達顯著增加，而采呼吸機相關性肺損傷模型兔在使用烏司他丁干預后，動脈血中的PaO2較前有所回升，血清與肺組織中TNF-αmRNA與蛋白的表達同大潮氣量組相比有明顯著上升（P<0.05）。結論：烏司他丁對呼吸機相關性肺損傷有保護作用，其機制可能是通過下調TNF-α的表達，抑制炎癥反應來實現的。

【關鍵詞】 烏司他丁； 呼吸機相關性肺損傷； 大潮氣量； TNF-α

【Abstract】 Objective：The establishment of ventilator induced lung injury in a rabbit model of lung tissue，to observe the changes of TNF-α in mechanical ventilation induced lung injury model of rabbit lung tissue alpha，to explore the therapeutic mechanism of Ulinastatin on VILI and TNF-α.Method：The injury rabbit model of high tidal volume ventilation was established，after 30，60，120，180 and 240 min，arterial blood for blood gas analysis.TNF-α in serumwere measured by ELISA.The pathological changes of lung tissue were observed by HE staining.The expression of TNF-αRNA and protein in lung tissue was detected by PCR Real-time and Blot Western.Result：After mechanical ventilation，the expression of TNF-α in serum and lung tissue increased significantly.Ulinastatin interved ventilator induced lung injury model in rabbits and rabbit arterial blood PaO2 increased，in serum and lung tissue TNF-α expression were compared with those of the earlier high tidal volume group improved significantly（P<0.05）.Conclusion：Ulinastatin on ventilator induced lung injury has a protective effect， he mechanism may be by down regulating the expression of TNF-α，inhibit inflammatory reaction to achieve.

【Key words】 Ulinastatin； Ventilator associated lung injury； Tidal volume； TNF-α

First-authors address：The Second Hospital of Fuzhou Affiliated to Xiamen University，Fuzhou 350007，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.32.005

呼吸機所致肺損傷（ventilator-induced lung injury，VILI）是機械通氣最嚴重的并發癥之一，主要由于過度機械通氣誘發或引起的急性肺損傷，危害性大，如果發現和處理不當可導致患者死亡[1]。VILI屬于急性肺損傷，中性粒細胞、單核巨噬細胞等免疫細胞會在損傷后于肺內聚集，并釋放的腫瘤壞死因子TNF-α等眾多炎性介質，并啟動早期炎癥反應，而TNF-α等炎癥因子又對炎癥反應的維持起重要作用[2-3]。大潮氣量機械通氣致呼吸機相關肺損傷時在繼發的急性炎癥反應的始動與發展環節中起到關鍵作用。烏司他丁對TNF-α等炎癥因子具有抑制作用，能減輕體內的炎癥反應，值得研究。烏司他丁（Ulinastatin，UTI）是由男性尿液中提取的絲氨酸蛋白酶抑制劑，分子量為67 kD，對TNF-α等炎癥因子具有抑制作用，從而減輕炎癥反應[4-5]。本研究觀察TNF-α在機械通氣相關性肺損傷模型兔肺組織中的變化規律，探討烏司他丁對VILI的治療機制是否與抑制TNF-α的活化有關，并觀察烏司他丁對VILI的療效，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與藥物 雄性3月齡新西蘭家兔24只（清潔級），體重（2.50±0.48）kg[動物合格證：SCXK（滬）2004-0003，上海西普爾-必凱公司]。烏司他丁（國藥準字H19990133）300萬單位。

1.2 實驗儀器與試劑 DEVIBISS公司NEB-2000呼吸機；血氣ABL800血氣分析儀；PE生物9600DNA擴增儀；ABI7500型實時定量PCR儀；TNF-αELISA檢測試劑盒（福州邁新生物技術公司）；RR036A反轉錄試劑盒、SYBR?Green I RR82LR（Takara） （大連寶生物工程公司）；考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒（建成生物研究所）；TNF-α抗體（美國abcam公司），β-actin抗體（美國CST公司），Western Breeze（美國invitrogen公司），PVDF膜（Amersham公司）。

1.3 方法

1.3.1 干預前準備 耳緣靜脈進針，戊巴比妥鈉麻醉，行氣管切開并插管，連接呼吸機。切開左側皮膚分離頸總動脈進行動脈血采集。于右側頸靜脈置靜脈套管針開放靜脈通道，以每小時10 mL/kg持續輸注葡萄糖生理鹽水，補液并維持血壓穩定。準備階段的呼吸機通氣方式：容量控制（CMV）：VT 8 mL/kg，FiO2∶40%，I∶E=1∶2，呼氣末正壓（PEEP）3 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa），維持呼吸頻率30～40次/min、PaCO2 5.32 kPa左右。

1.3.2 分組 穩定機械30 min后記錄各項基礎參數，并將此時時間點記錄為0 h。將實驗動物隨機劃分，每組8只，不同組予不同潮氣量和通氣時間：（1）常規潮氣量組：繼續初始通氣條件VT 8 mL/kg通氣。（2）大潮氣量烏司他丁組：調節呼吸機至VT 40 mL/kg、呼吸頻率8次/min。首次50 000 U/kg注射烏司他丁后，持續靜脈輸注5000 U/（kg·h）。（3）大潮氣量對照組：調節呼吸機至VT 40 mL/kg、呼吸頻率8次/min。持續靜脈輸注地塞米松0.5 mg/（kg·h）。

1.3.3 檢測指標 在分組操作完成后30、60、120、180、240 min，抽取動脈血行血氣分析，抽取靜脈血檢測血清中TNF-α的含量。取血完處死后取肺組織，用于mRNA與蛋白的檢測。

1.3.3.1 血清肺組織中TNF-α含量的檢測 靜脈血離心取血清，肺組織液氮搗碎勻漿于組織稀釋液中，試劑盒標準品分別加入96孔板上。并先后加入生物素、酶標底物，37 ℃溫育60 min。加入終止液終止反應，顯色15 min后，于酶標儀450 nm讀取OD值。

1.3.3.2 肺組織TNF-α蛋白的檢測 提取肺組織的蛋白，測定蛋白濃度后，以30 μg/道上樣，進行SDS-PGEE凝膠電泳， 然后采用半干轉將膠上蛋白印至PVDF膜。室溫封閉30 min。將1∶5000稀釋的抗體封閉膜1 h，洗膜6次后將二抗室溫封閉30 min，后再洗膜6次。將發光底物與膜在室溫下孵育5 min，曝光、顯影。應用Phoretix 1D生物電泳圖象分析系統讀每個條帶的光密度值。

1.3.3.3 肺組織TNF-αmRNA的檢測 TNF-α引物：F 5CGCAAGAGTGTCTGGCGCAA 3，R 5GGATGACGCG GAG ACGGA3，產物長度145 bp。內參β-actin引物：F 5AGGCTGTCTTGTCCTGTA 3，R 5ATGTCACGCCAGATTTCC 3，產物長度176 bp。采用Trizol法提取肺組織RNA，抽提后的RNA加入溴芬蘭進行瓊脂糖凝膠電泳，檢驗RNA是否降解，在確定無降解后測定RNA濃度，按試劑盒說明書步驟進行逆轉錄。逆轉錄后在ABI7500上擴增，得到擴增曲線與CT值。采用2-△△CT計算mRNA的表達量。

1.4 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗。ONE-WAY ANOVA（單向方差分析）組間數據比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動脈血氣改變與常規潮氣量組比較 大潮氣量對照組動物在創傷后30 min，PaO2顯著降低（P<0.05），并在4 h內持續保持低水平。大潮氣量烏司他丁組動物PaO2于30 min先降低，1 h后持續有所升高，與大潮氣量對照組比較有顯著升高但低于同時期常規潮氣量組（P<0.05）。見表1。

2.2 血清肺組織中TNF-α含量的檢測結果 創傷后大潮氣量組血清在TNF-α的含量逐漸升高，烏司他丁組明顯低于對照組組（P<0.05）。同時期常規潮氣量組血清中TNF-α則無明顯變化，且各時間段無明顯變化（P>0.05），見表2。而肺組織中TNF-α的表達量以大潮氣量對照組最高為（98.43±2.99）pg/mL，大潮氣量烏司他丁組次之為（89.69±6.38）pg/mL，常規潮氣量組最低為（75.32±3.21）pg/mL，其他兩組與同時期常規潮氣量組比較（P<0.05），其他兩組與同時期對照組比較（P<0.05）。

2.3 不同組別肺組織中TNF-αmRNA的表達 qPCR擴增曲線說明所采用的體系和條件符合要求（圖1）。同時，溶解曲線表明為特異性擴增（圖2）。肺組織中TNF-αmRNA的表達以大潮氣量對照組最高為1，大潮氣量烏司他丁組次之為（0.534±0.033），常規潮氣量組最低為（0.774±0.042），各組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。

2.4 不同組別肺組織中TNF-α蛋白的表達 大潮氣量對照組肺組織中TNF-α蛋白表達含量最高為（0.843±0.032），大潮氣量烏司他丁組次之為（0.489±0.015），常規潮氣量組最低為（0.194±0.028），各組比較差異均有統計學意義（P<0.05），見圖3。

3 討論

呼吸機所致肺損傷（ventilator-induced lung injury，VILI）是由于機械通氣導致肺損傷的一種嚴重并發癥，病理上顯現為彌漫性肺損傷：肺泡外氣體、肺泡上皮與血管內皮的廣泛破壞、肺水腫和肺不張等。VILI的發病機制復雜：除氣壓傷、容量傷、肺萎陷傷外，免疫細胞和炎癥因子介導的局部炎癥反應也參與其中[7-9]。當肺內細胞感知機械力量刺激后，通過細胞內信號傳導激活炎癥細胞，誘導其釋放大量炎癥因子，導致炎癥級聯反應的發生，大量炎癥介質釋放，并通過肺并進入血液循環，最終促進和加重SRIS及MOF[10-11]。而其中中性粒細胞、巨噬細胞和血管內皮細胞分泌的TNF-α等炎性介質對啟動早期炎癥級聯反應與炎癥反應的維持起著重要作用[12-14]。

TNF是主要由激活的中性粒細胞、巨噬細胞和血管內皮細胞分泌的Ⅱ型膜蛋白，可與細胞膜上的特異性受體結合，實現細胞生長、分化、凋亡及誘發炎癥等生物學效應的促進作用。而在TNF家族中TNF-α不但是炎癥反應過程中重要的啟動因子，還可誘導炎癥相關的細胞因子、受體等合成和表達。同時可激活NF-κB信號通路，誘導肺泡上皮細胞分泌炎癥介質，并相互作用。總之在受到過度機械通氣時肺泡上皮細胞受到牽拉而變形，繼而發生機械應力衰竭，并伴隨胞膜破壞，導致炎性細胞分泌TNF-α增多，介導了NF-κB信號通路的活化，最終誘導肺內細胞的凋亡[15-17]。

本研究結果顯示：VILI損傷模型兔在大潮氣量機械通氣后，隨著時間的增加，血清中、肺組織中TNF-α表達顯著增加，提示其在VILI的發展過程中可能起到一定的作用。肺組織TNF-α表達在VILI的發生、發展中起重要作用，烏司他丁對VILI有保護作用，其機制可能是通過下調TNF-α的表達，抑制NF-κB信號通路的活化來實現的[18-20]。但是，參與VILI的炎癥因子眾多，TNF-α與其他細胞因子也有協同作用，轉錄水平的信號調控網絡復雜。烏司他丁對肺的保護作用是否還有其他的信號通路傳導參與，仍需要更進一步的研究。

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（收稿日期：2016-05-19） （本文編輯：程旭然）