鋅指蛋白703的結構和功能

李丁綜述劉閣玲審校

（1.華北理工大學研究生院，河北唐山063007；2.河北醫科大學附屬唐山市工人醫院內分泌一科，河北唐山063000）

鋅指蛋白703的結構和功能

李丁1綜述劉閣玲2審校

（1.華北理工大學研究生院，河北唐山063007；2.河北醫科大學附屬唐山市工人醫院內分泌一科，河北唐山063000）

本文簡述了鋅指蛋白703(ZNF703)的結構域及其功能，初步探討了ZNF703在腫瘤中的關系及作用機制，為臨床診斷、預后及藥物治療提供一定的研究價值。

ZNF703；蛋白結構域；雌激素；腫瘤

惡性腫瘤是威脅人類健康的重大疾病之一。近年來，通過分子領域研究腫瘤發生機制受到國內外學者的廣泛關注。鋅指蛋白是一類具有指狀結構的轉錄因子，在真核生物中廣泛表達，參與細胞的分化、增殖和凋亡等重要生命過程[1]。人類鋅指蛋白703 (ZNF703)為新發現的鋅指蛋白家族成員。國外學者通過擴增人類染色體8p11-12區域，發現ZNF703基因與乳腺癌的發生及發展密切相關[2]。隨著國內外研究的深入，目前已經證實ZNF703在人類乳腺癌、大腸癌、胃癌及子宮內膜癌等均存在異常表達。本文擬通過闡述ZNF703的研究現狀，分析其在腫瘤發生發展中的作用。

1 鋅指蛋白簡述

鋅指蛋白因含鋅指結構而得名，該結構是由鋅離子與若干保守的氨基酸殘基結合，形成的指狀四面體結構。這一結構最早由Miller等[3]于1985年在非洲爪蟾轉錄因子TFⅢA中發現。隨后人們在哺乳動物、植物、果蠅、病毒中均發現此類含有鋅指結構的蛋白，人們把這類蛋白質統稱為鋅指蛋白。鋅指蛋白可通過鋅指結構，與其他蛋白形成轉錄復合物，結合目標啟動子而發揮調控作用。當鋅離子被其他等金屬離子置換后，鋅指結構將不能形成穩定的折疊，顯著降低了與其他DNA的特異性結合。由此可見，鋅離子可通過維持鋅指結構的穩定性，保證了鋅指蛋白功能的有效性[3]。鋅指蛋白在哺乳動物的細胞內含量豐富，據統計大約有2%的人類基因編碼鋅指蛋白[4]。鋅指蛋白可根據組成鋅指結構的保守氨基酸殘基Cys和His的不同組合，分為C2H2、C4、C6、C4HC3、C3HC4、C2HC、C3H以及聯合型等多種類型[5]。鋅指蛋白通過鋅指結構結合DNA、RNA、DNA-RNA雜交雙鏈分子、蛋白質及其自身，從而在轉錄及翻譯水平上發揮對靶基因的調控作用[6]。

2 ZNF703/NLZ1的蛋白結構域

2.1 ZNF703/NLZ1蛋白簡介NET蛋白屬于鋅指蛋白亞家族，需要結合Groucho家族蛋白、組蛋白脫乙酰基酶1和2[(Histone Deacetylases(HDAC)1and 2)]形成轉錄抑制因子復合物[7]。Ji等[8]認為NLZ1/ZNF703屬于NET蛋白亞家族成員，并證明了在斑馬魚的胚胎組織中NLZ1特異性結合在GAL4(Groucho蛋白家族成員)基因的啟動子上。Castro等[9]發現ZNF703/NLZ1基因在人類及小鼠體內廣泛表達，比較了三種人類ZNF703/NLZ1mRNA(根據大小分別命名為mRNA1、mRNA2、mRNA3)的序列，發現他們的區別僅在于3'-UTR的長度。此外Castro等[9]還證明了可變聚腺苷酸產生了不同的NLZ1基因亞型，進而調節蛋白在組織及物種表達量上的差異。

2.2 NLZ1/ZNF703結構域的功能NLZ1/ZNF703包含六個進化上的保守結構域，其中早已知的三個結構域為SP結構域、圓頭盒(BTD)結構域及C2H2鋅指結構域，均存在于NET家族蛋白與SP家族蛋白中[10]。新近發現的三個結構域為NET蛋白家族所特有，Castro等[9]根據上述三個特有結構域中含量最多的保守氨基酸，而將這三個特定域分別命名為LP、PY及YL，并發現它們在脊椎動物NET蛋白家族的兩個旁系組中都具有高度保守性，故而推測這些特定域對于蛋白的生理功能有重要作用。

2.2.1 是否參與其他蛋白質的結合首先考慮到ZNF703/NLZ1特定域是否對于蛋白質相互結合發揮作用。如上所述，人類NET蛋白可特異性結合HDACs(組蛋白脫乙酰基酶)，這使人聯想到ZNF703/ NLZ1特有域可能充當兩者的結合位點。然而國外研究人員在幾年前已經發現了ZNF703/NLZ1與HDACs的結合位置位于BTD盒結構區域和C2H2型鋅指結構區域之間的氨基酸序列(Δ385-460，Δ408-589)區，ZNF703/NLZ1與Groucho蛋白的結合區域為C2H2鋅指結構域內的ZI(第一鋅指區)與Z2(第二鋅指區)之間的一小段氨基酸序列[11-13]。但是Dorfman等[14]對于NET蛋白家族的結構域結合Groucho家族蛋白的理論提出爭議，所以Castro等[9]重點檢測了NLZ1特有域是否可結合Groucho家族蛋白，通過刪除任一特有域，發現并不影響NLZ1與GRG5(Groucho蛋白家族成員)的結合活性，證明了NLZ1特有結構域在NET與Groucho家族蛋白的結合效應上并不產生作用，這也符合Runko等[11]和Sagerstrom等[12]早先在斑馬魚胚胎上發現的NLZ1與Groucho家族蛋白的結合區域位于鋅指結構區的說法。

2.2.2 結構域的亞細胞定位功能先前的研究發現斑馬魚的NLZ1具有細胞核定位特性[15]。Castro等[9]通過構建編碼MYC標志物的過表達載體來轉染人類HEK293細胞系，證明了ZNF703/NLZ1主要定位于細胞核，但未發現ZNF703的NLS(核轉入機制)通路。此外Castro等[9]還發現了ZNF703在細胞核中的分布基本均勻，少數點狀分布。Castro等[9]通過構建ZNF703/NZL1特有域的缺失模型來觀察ZNF703的亞細胞分布，LP結構域刪除后，并未發現對于蛋白的核定位有影響，但令人驚訝的結果是缺失了同時包含SP及LP的結構區域，發現ZNF703在胞核中點狀分布(即非均勻分布)密度增加，表明LP、SP區域可能維持ZNF703在核中的正態分布，并推測這種點狀分布特性通過阻止ZNF703達到某核染質區，進一步影響其轉錄阻遏的作用。接下來該研究者發現PY域的缺失導致蛋白部分保留在細胞質，而YL域缺失導致完全的核排斥現象，同時刪除所有的三個特定域亦有類似的結果，這表明了位于中央的PY結構域和C末端的YL結構域對于蛋白的核定位作用非常重要，尤其是YL域的作用必不可少[9]。這與Runko等[11]和Sagerstrom等[12]提出的斑馬魚Nlz1蛋白C-末端殘基對于蛋白核定位是必不可少的說法一致。然而，如上所述ZNF703自身沒有核定位功能，但卻形成轉錄抑制復合物在核內發揮作用，而LY和PY對蛋白的核定位又是必要的，這表明LY和PY結構域可能結合其他蛋白質參與某已知核定位通路進入細胞核。

2.2.3 結構域對蛋白轉錄抑制活性的影響Nakamura等[13]表明SP結構域并不直接介導ZNF703/ NLZ1的轉錄抑制，但可能充當蛋白與目標啟動子的結合位點。Castro等[9]使用Gal4-DBD融合物來測試不同NLZ1片段(即缺失各種結構域的片段)特異性結合其啟動子的能力，發現LP和SP結構域缺失均會導致結合能力降低，間接抑制ZNF703-Gal4復合物發揮轉錄抑制作用，而刪除YL結構域并不影響結合能力，但因為YL域缺失如上所述完全阻止了ZNF703轉錄復合物進入核內，所以極有可能影響ZNF703的轉錄抑制功能。而事實并非如此，Castro等[9]刪除YL域后，發現對ZNF703/NLZ1抑制核內TCF/β連環蛋白(WNT信號通路成員)功能的影響很小，這表明ZNF703/ NLZ1可能有其他的信號通路直接作用于核內。Castro等[9]還發現了NLZ/ZNF703作為抑制劑，參與形成斑馬魚胚胎后腦的第4菱腦節。因為被ZNF703/NLZI所抑制的WNT信號通路在所有動物的胚胎發育過程中發揮關鍵作用[15]，證據顯示該通路對生長發育的調控作用與果蠅和小鼠的NET蛋白有關[16]，所以我們相信ZNF703在調控動物胚胎發育的過程中發揮重要作用，具體機制有待研究。

3 ZNF703與腫瘤

3.1 ZNF703與乳腺癌人類染色體8p11-12區域的擴增會促進人乳腺癌的發生和進展[17]。ZNF703基因定位于人類染色體8區域(8p11.23)[18]。Reynisdottir等[19]進一步證明了ZNF703基因作為8p11-12染色體區擴張的驅動癌基因，并支持其獨立擴張的作用，其擴張事件優先發生于Luminal B型乳腺癌中，還發現了ZNF703及其基因在ER(+)乳腺癌中的表達要明顯高于ER(-)乳腺癌。國外學者認為ZNF703基因為Luminal B型乳腺癌的驅動基因，隨著表達量升高患者的生存期縮短，預后變差[19-21]。隨后來自中國的研究也證實了ZNF703及其基因在Luminal A型及其他ER陰性乳腺癌中具有致癌作用，且長鏈非編碼基因RNA SPRY4-IT1靶向作用于ZNF703而發揮在乳腺癌中的促癌作用[22]，這也提示我們ZNF703的致癌機制是復雜的，除了雌激素調節之外可能存在其他的機制。

3.2 ZNF703與其他部位的腫瘤國內研究人員先后證明了ZNF703在人類胃癌、大腸癌、子宮內膜癌、頭頸部鱗癌中均存在致癌作用，且ZNF703的高表達提示預后較差[23-26]。特別注意的是，袁莉敏等[24]發現了ZNF703在子宮內膜癌中的表達量與ER受體存在負相關性，此外畢麗紅[25]發現了ZNF703在胃癌中的致癌作用可能與幽門螺旋桿菌有關，具體機制尚不明確。ZNF703基因在人體多器官均被發現扮演著癌基因的作用，這也提示我們ZNF703可能作為一種廣譜的致癌因子，參與經典的致癌通路，下面我們對其作用機制進行具體闡述。

4 ZNF703的作用機制

4.1 ZNF703與雌激素相關研究證明了ZNF703受雌激素的刺激而上調，通過過表達人乳腺MFC7細胞的ZNF703基因與蛋白，觀察到與ER受體蛋白相關的FOXA1和GATA3蛋白下調，ER蛋白與基因的表達和活性減少，表明ZNF703可能對于雌激素存在負反饋調節[21]，這與袁莉敏等[24]在子宮內膜癌中對ZNF703與ER受體相關性的觀察結果相一致。一些研究把ZNF703基因描述為雌激素受體轉錄活動的目標基因，而且認為雌激素的反應元件在其啟動子區域[27]。ZNF703通過AKT、mTOR信號通路，誘導ERa受體(雌激素受體a)下調，增加了雌激素受體拮抗劑他莫昔芬的耐藥性[28]，而ERa基因作為一種抑癌基因，其高表達可明顯改善患者的腫瘤進展，延長生存期[29]，這也解釋了ZNF703表達增高提示預后差的現象。此外，ZNF703蛋白的高表達可激活非核ER通路[28]，ZNF703可激活轉錄因子E2F1[21]，而E2F1活性的升高可結合C-MYC(原癌基因MYC家族成員)，進一步上調EGFR受體蛋白(表皮生長因子受體家族成員)[30]，活化后的EGFR受體參與了乳腺癌非核ER效應中雌激素激活細胞膜ER受體后的信號傳遞[31]，ERb(雌激素受體b)mRNA的升高也可促進EGFR受體表達增高[32]，故我們推測ZNF703與ERb受體蛋白在功能上有正相關性。Spires等[33]提出了Erb蛋白表達增高導致TAM類藥物的耐藥性增加，這與ZNF703蛋白的作用相同，也提示了兩者在功能上可能具有緊密關系。而目前對于Erb蛋白表達與乳腺癌預后的關系存在爭議，國內外研究中多數學者偏向于Erb蛋白的高表達預示著臨床預后良好，這與ZNF703的臨床預后關系是相反的，但啟示我們通過研究ZNF703調控ER的作用機制為ERb的研究提供新的思路。

4.2 ZNF703在腫瘤中的作用機制Sircolomb等[21]發現ZNF703抑制TGFβ受體的活性及E鈣粘蛋白的表達，上調親遷徙性P120連環亞蛋白表達，從而促進細胞的增殖及遷移，減少細胞間粘附。ZNF703的過度表達細胞顯示出RB1磷酸化，P27kip1蛋白下調，從而上調E2F1和CCNE1(G1/S特異性細胞周期蛋白E1)的表達，誘發細胞從G1期逃避R限制點的作用而進入S期，ZNF703與DCAF7(重組人DDB1和CUL4關聯因子7)、PHB2(重組人抗增殖蛋白2)以及NCOR2(人源重組蛋白)形成核受體轉錄阻遏復合物而調節乳腺CSC(腫瘤干細胞)的自我更新能力，ZNF703與DCAF7相互作用可能解釋其對E2F1的信號的作用，具體機制有待研究。此外，相關研究也證明了ZNF703-DCAF7-PHB2-NCOR2復合物也參與ER轉錄過程[34]，有趣的是，PHB1/NOCR1復合物會抑制E2F1的活性[35]，但是ZNF703/PHB2/NCOR復合物上調E2F1的活性，Sircolomb等[21]認為ZNF703復合物似乎可調節E2F1的活性而不僅只有上調作用。Kwek等[36]指出人類染色體8p11-12和11q12-14之間的擴增驅動基因在乳腺癌的發生發展中存在協同作用，發現Rb/E2F通路激活可刺激CCND1(細胞周期素D1重組蛋白)誘導ZNF703活性，認為E2F1、CCND1可以上游調節ZNF703，這與Sirclomb等[21]所提出ZNF703激活E2F1轉錄因子的說法有差別，這也提示了ZNF703與E2F1之間的作用機制是復雜的，值得我們進一步研究。Holland等[20]發現ZNF703刺激NIH3T3(小鼠胚胎成纖維細胞)轉化為成纖維細胞，而成纖維細胞是一個典型的癌基因，在人類管腔乳腺癌細胞系中有規律的擴增，增強了乳腺癌管腔細胞形成祖細胞的頻率。Holland等[20]還發現ZNF703的高表達抑制TGF-β受體(轉化生長因子β受體)的活性，然而有趣的是沉默ZNF703基因表達后發現TGF-β受體的活性未受影響。我們較為認同Sircolomb等[21]所提出的理論，認為CCND1和雌激素作為上游調節物，誘導ZNF703參與ER轉錄和E2FI轉錄兩種途徑來調節腫瘤干細胞，推測兩者之間可能存在既獨立又協同的通路機制。

綜上所述，ZNF703為一種新發現的鋅指蛋白成員，其蛋白結構與功能之間存在緊密的聯系，作為轉錄抑制因子，在多器官均有致癌作用，其作用機制是復雜的，涉及雌激素依賴、ER轉錄、細胞周期及轉化生長因子信號。通過研究ZNF703的蛋白結構及作用機制，對乳腺癌、子宮內膜癌的激素治療提供一定的研究價值，有望為ZNF703基因靶向治療腫瘤提供新方法。

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