30個(gè)重要小麥生產(chǎn)品種抗葉銹性基因分析

閆曉翠，李在峰，楊華麗，張換換，Gebrewahid Takele Weldu，姚占軍，劉大群，周悅

（1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/華北作物種質(zhì)資源研究與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071001；2河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心，河北保定 071001；3保定學(xué)院生物化學(xué)系，河北保定 071001）

30個(gè)重要小麥生產(chǎn)品種抗葉銹性基因分析

閆曉翠1，李在峰2，楊華麗1，張換換1，Gebrewahid Takele Weldu1，姚占軍1，劉大群2，周悅3

（1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/華北作物種質(zhì)資源研究與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071001；2河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心，河北保定 071001；3保定學(xué)院生物化學(xué)系，河北保定 071001）

【目的】小麥葉銹病是影響中國(guó)小麥產(chǎn)量的重要病害之一，培育持久抗病品種可以經(jīng)濟(jì)、有效地控制該病害。論文通過基因推導(dǎo)結(jié)合系譜分析、分子標(biāo)記及成株抗病鑒定對(duì)小麥生產(chǎn)品種中抗病基因進(jìn)行鑒定，從而確定小麥品種中所攜帶的抗病基因。【方法】選用18個(gè)小麥葉銹菌菌系（PHGQ、THJT、PHJT、KHJS、PHJS、THTT①、KHHT、FHRT、FHJQ、PHTT、THTT②、PHTT、FHTR、FHHT①、FHHT②、TGGT、FHTT、FGMT）接種36個(gè)已知抗葉銹病基因載體品種和中國(guó)的30個(gè)小麥生產(chǎn)品種進(jìn)行苗期抗葉銹病基因推導(dǎo)，進(jìn)一步利用9個(gè)與已知抗病基因緊密連鎖的特異性標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記檢測(cè)，同時(shí)系譜分析法確定供試小麥品種中所攜帶的已知抗葉銹病基因。為了鑒定小麥品種的成株抗性基因，在2014—2015和2015—2016年度將30個(gè)小麥品種、慢銹對(duì)照品種SAAR和感病對(duì)照品種鄭州5389種植于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥試驗(yàn)田和河南周口黃泛區(qū)農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)田，田間用混合生理小種（FHRT、THTT、THJT）接種進(jìn)行成株抗葉銹性鑒定，進(jìn)一步運(yùn)用軟件IBM SPSS Statistics 19.0進(jìn)行方差分析（ANOVA），根據(jù)苗期與成株期的侵染型排除具有主效抗性基因的品種，將田間最終嚴(yán)重度（當(dāng)達(dá)到發(fā)病高峰時(shí)調(diào)查的嚴(yán)重度為最終嚴(yán)重度，final disease severity，F(xiàn)DS）明顯小于或與慢銹對(duì)照 SAAR無(wú)顯著差異的作為慢銹品種，從而篩選出表現(xiàn)慢銹的小麥品種。【結(jié)果】基因推導(dǎo)、系譜分析結(jié)合標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果表明，30個(gè)小麥生產(chǎn)品種中有4個(gè)品種（鄂恩5號(hào)、鄂麥14、陜229和西農(nóng)979）含有抗病基因Lr1，10個(gè)品種（鄂恩1號(hào)、鄂恩5號(hào)、鄂恩6號(hào)、貴農(nóng)16、陜225、陜354、陜715、陜合6號(hào)、陜麥509和陜農(nóng)7859）攜帶有抗病基因Lr26，2個(gè)品種（陜225和小偃81）經(jīng)分子標(biāo)記檢測(cè)含有慢銹抗病基因Lr46，另外還有3個(gè)品種（西農(nóng)979、陜229和貴農(nóng)16）可能含有基因Lr13，所有供試品種均不含Lr9、Lr10、Lr19、Lr20、Lr24和Lr34抗病基因。根據(jù)2年2點(diǎn)的田間抗葉銹病鑒定篩選出18個(gè)表現(xiàn)慢銹的品種，且方差分析結(jié)果表明各品種間和地點(diǎn)間差異均極顯著，年份間差異顯著，品種與地點(diǎn)間、品種與年份間差異均極顯著，而品種與重復(fù)間和重復(fù)間均不顯著，這表明小麥葉銹病抗性的表達(dá)受基因型和環(huán)境互作共同影響。【結(jié)論】30個(gè)小麥品種中共檢測(cè)到Lr1、Lr26、Lr13和Lr46等4個(gè)抗葉銹病基因，其中Lr46為成株抗病基因，通過田間抗性鑒定共檢測(cè)出18個(gè)品種可能攜帶成株慢銹基因，所有慢銹材料中可能含有未知成株抗葉銹病基因，需要進(jìn)一步進(jìn)行遺傳鑒定。

小麥葉銹病；基因推導(dǎo)；成株抗病鑒定；分子標(biāo)記輔助選擇

0 引言

【研究意義】小麥葉銹病是由小麥葉銹菌（Puccinia triticina）侵染引起的真菌性氣傳小麥病害，是危害中國(guó)小麥產(chǎn)量的重要因素之一，病害嚴(yán)重流行年份可導(dǎo)致產(chǎn)量損失達(dá) 40%以上[1]。葉銹病發(fā)生范圍廣泛，20世紀(jì)70年代在墨西哥西北部發(fā)生葉銹病大流行，據(jù)估計(jì)造成產(chǎn)量損失高達(dá)70%[2]。中國(guó)北方麥區(qū)曾在1969、1973、1975和 1979年發(fā)生過中度以上病害流行[3]，2012年和2015年在多個(gè)小麥主產(chǎn)區(qū)暴發(fā)了小麥葉銹病，對(duì)小麥生產(chǎn)造成了嚴(yán)重危害[4-5]。因此不斷發(fā)掘和定位小麥抗葉銹病基因?qū)ωS富中國(guó)小麥抗病基因庫(kù)和培育抗病品種具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】小麥對(duì)葉銹病的抗性分為兩種：垂直抗性和水平抗性。垂直抗性受單基因控制，表現(xiàn)為小種專化抗性，常因小種變異而喪失；水平抗性大多數(shù)受微效多基因控制，具有數(shù)量遺傳特性，為非小種專化抗性。微效多基因一般具有加性效應(yīng)和上位效應(yīng)，不易引起抗病性喪失，表現(xiàn)為持久抗性，比如水平抗病品種Pavon76在生產(chǎn)上利用多年仍保持較好抗性，經(jīng)分子檢測(cè)品種Pavon76中攜帶有多個(gè)微效抗病基因[6]。目前國(guó)際上發(fā)現(xiàn)的100多個(gè)小麥抗葉銹病基因中大多數(shù)為苗期抗病基因，僅有Lr12、Lr13、Lr22（等位基因a和b）、Lr34、Lr35、Lr37、Lr46、Lr48、Lr49、Lr67和Lr68等12個(gè)為成株抗葉銹病基因，其中Lr34、Lr46、Lr67和Lr68為成株微效基因，具有持久抗病性[7]。抗病基因的研究方法主要有常規(guī)雜交法、基因推導(dǎo)法和分子標(biāo)記等。基因推導(dǎo)法的應(yīng)用原理是Flor提出的基因?qū)蚣僬f(shuō)[8]，依據(jù)一套小麥抗葉銹病基因載體品種的表現(xiàn)型推導(dǎo)出供試材料中可能攜帶的抗病基因。1973年，BROWDER[9]首次應(yīng)用13個(gè)近等基因系作為對(duì)照品種推導(dǎo)出了Lr1和 Lr10；胡長(zhǎng)程等[10]在中國(guó)生產(chǎn)品種中推導(dǎo)出了Lr1、Lr2c、Lr10、Lr18和Lr26等抗病基因；袁軍海等[11]在中國(guó)47個(gè)小麥新品種（系）中推導(dǎo)出Lr1、Lr3、Lr3bg、Lr9、Lr10、Lr13、Lr16、Lr23、Lr26和Lr34等10個(gè)抗葉銹病基因。由于基因推導(dǎo)法在小麥抗葉銹病遺傳研究中普遍應(yīng)用，有利于小麥抗葉銹病基因的發(fā)掘與利用，但基因推導(dǎo)容易受到小種鑒別力的影響，導(dǎo)致某些基因推導(dǎo)不出來(lái)，因此在對(duì)抗病基因鑒定時(shí)，常使用基因推導(dǎo)與分子標(biāo)記法互相驗(yàn)證獲得可靠結(jié)果。劉志勇等[12]在48份抗葉銹育種圃高代品系材料中鑒定出Lr9和Lr24；胡亞亞等[13]在14份小麥材料中鑒定出Lr1、Lr10、Lr26和Lr34等抗病基因；韓燁等[14]在來(lái)自CIMMYT品種鑒定出抗病基因Lr26、Lr34、Lr42和Lr47等；潘陽(yáng)等[15]對(duì)來(lái)自104份新疆品種、高代品系中鑒定出Lr26、Lr34、Lr50、Lr3ka、Lr1和Lr14a等抗病基因；同時(shí)LI等[16]也應(yīng)用基因推導(dǎo)法結(jié)合標(biāo)記檢測(cè)在中國(guó)小麥材料中發(fā)現(xiàn)了抗葉銹 Lr1、Lr2a、Lr3bg、Lr3ka、Lr14a、Lr16、Lr17a、Lr18、Lr20、Lr23、Lr24、Lr26、Lr34和LrZH84[17]等14個(gè)抗病基因。【本研究切入點(diǎn)】選用中國(guó)30個(gè)小麥生產(chǎn)品種進(jìn)行苗期基因推導(dǎo)、成株期抗葉銹性鑒定及分子標(biāo)記檢測(cè)。【擬解決的關(guān)鍵問題】確定這些材料可能含有的抗病基因并篩選慢銹品種，從而為作物育種和遺傳研究提供有效遺傳信息并為進(jìn)一步抗病育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試品種及葉銹菌系

供試材料為陜西、貴州和湖北等3個(gè)小麥主產(chǎn)區(qū)的30個(gè)重要小麥生產(chǎn)品種，其名稱、系譜及來(lái)源見表1。基因推導(dǎo)所用的36個(gè)已知抗葉銹病基因的載體品種和感病對(duì)照鄭州 5389及成株慢銹對(duì)照品種 SAAR均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥葉銹病研究室提供[18]；基因推導(dǎo)所用的18個(gè)中國(guó)小麥葉銹菌小種（PHGQ、THJT、PHJT、KHJS、PHJS、THTT①、KHHT、FHRT、FHJQ、 PHTT、THTT②、PHTT、FHTR、FHHT①、FHHT②、TGGT、FHTT、FGMT）以及成株期所用的混合生理小種（FHRT、THTT、THJT）均采集于中國(guó)小麥主產(chǎn)區(qū)并進(jìn)行單孢分離純化，其小種命名參照LONG等[19]提出的三字母密碼命名系統(tǒng)及后來(lái)擴(kuò)展成的四字母命名法（http://www ars.usda.gov/SP2 User Files/ad_hoc/ 36400500 Cerealrusts/pt nomen.pdf）。所有菌種均保存于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥銹病研究室。

1.2 苗期基因推導(dǎo)及侵染性鑒定

將對(duì)照感病品種鄭州5389、36個(gè)攜帶已知抗葉銹病基因的載體品種和供試的30個(gè)小麥品種共67份材料，按順序播種于溫室中育苗盤內(nèi)。待小麥第一片葉片完全展開，采用掃抹法將18個(gè)不同毒力的葉銹菌生理小種分別接于18套小麥葉片上。大約兩周后待感病對(duì)照品種鄭州5389充分發(fā)病時(shí)進(jìn)行抗葉銹鑒定，參照ROELFS等[20]的 6級(jí)侵染性標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)每套小麥品種（系）進(jìn)行抗葉銹病侵染型鑒定，并根據(jù)DUBIN等[21]提出的基因推導(dǎo)原則進(jìn)行抗病基因推導(dǎo)。

1.3 田間接種及成株期抗葉銹性鑒定

2014—2015年和2015—2016年度將32份小麥品種（包括慢銹對(duì)照品種 SAAR和感病對(duì)照品種鄭州5389）分別播種于河北保定河北農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥試驗(yàn)田和河南周口黃泛區(qū)農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)田，種植方式采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)、2次重復(fù)、行距25 cm、行長(zhǎng)1.5 m，每10行種植一個(gè)高感對(duì)照品種鄭州 5389，并且將鄭州5389垂直種植作為接種行。田間接種和成株抗葉銹菌鑒定可參照LI等[16]的方法。運(yùn)用IBM SPSS Statistics 19.0軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA），根據(jù)苗期與成株期的侵染型排除具有苗期抗性基因的品種，將田間最終嚴(yán)重度明顯小于或與慢銹對(duì)照SAAR無(wú)顯著差異的作為慢銹品種。

1.4 已知抗葉銹病基因的分子檢測(cè)

用CTAB法[22]提取小麥葉片基因組DNA，用TE稀釋成50 μL備用，并利用分光光度計(jì)對(duì)DNA濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)用ddH2O稀釋DNA至終濃度40 ng·μL-1作為PCR工作液使用。采用與已知抗葉銹病Lr基因緊密連鎖的11個(gè)分子標(biāo)記進(jìn)行分子檢測(cè)。所有引物的PCR體系為20 μL，含10 μL 2×Taq PCR Mix、6 μL ddH2O、2 μL 4 mol·μL-1引物、2 μL 40 ng·μL-1DNA模板，各引物標(biāo)記擴(kuò)增程序見表 2，擴(kuò)增后以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（Lr46除外）；但Lr46的引物 csLV46-G22對(duì)供試材料擴(kuò)增后，需將其產(chǎn)物酶切后用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

表1 30個(gè)小麥品種來(lái)源、系譜及可能含有抗葉銹性基因的鑒定Table 1 Origins, pedigree and probable genes for leaf rust resistance in 30 wheat cultivars

表2 分子標(biāo)記的引物序列及PCR擴(kuò)增程序Table 2 Primer sequences and PCR amplification programs for different primer combinations

2 結(jié)果

2.1 苗期抗病性鑒定與基因推導(dǎo)分析

接種36個(gè)小麥抗葉銹病載體品種（系）、30個(gè)供試小麥生產(chǎn)品種及感病對(duì)照品種鄭州 5389的反應(yīng)型（IT）列于表3。感病對(duì)照鄭州5389對(duì)所測(cè)試的生理小種均表現(xiàn)高感（IT 4）。36個(gè)已知抗葉銹病載體品種（系）中，攜帶Lr9、Lr19、Lr24、Lr28、Lr47、Lr51和Lr53的載體品種對(duì)所有供試葉銹菌種均表現(xiàn)高抗（IT 0;），而攜帶Lr2c、Lr3、Lr16、LrB、Lr10、Lr3bg、Lr14b、Lr33和Lr44的載體品種對(duì)18個(gè)供試葉銹菌生理小種均表現(xiàn)為高感（IT 3或4），因此上述 16個(gè)抗葉銹病基因無(wú)法通過苗期接種鑒定而推導(dǎo)出來(lái)，其余20個(gè)抗葉銹病基因均可以通過苗期鑒定推導(dǎo)出來(lái)（表1）。Lr2b只對(duì)PHGQ和FHRT兩個(gè)小種表現(xiàn)抗病，對(duì)其余16個(gè)小種表現(xiàn)感病；Lr36只對(duì)PHTT和TGGT兩個(gè)小種表現(xiàn)感病，對(duì)其余16個(gè)小種表現(xiàn)抗病；Lr29對(duì) 4個(gè)小種表現(xiàn)感病，分別為 PHJS、FHHT①、FHHT②和 FHTT號(hào)小種；另外，Lr21對(duì)PHGQ、FHRT、TGGT和FGMT這4個(gè)小種表現(xiàn)抗病，對(duì)其余小種表現(xiàn)感病；Lr45對(duì)小種FHRT和TGGT表現(xiàn)感病，而對(duì)其他小種表現(xiàn)抗病。30個(gè)小麥生產(chǎn)品種對(duì)18個(gè)小麥葉銹菌種表現(xiàn)出不同的抗性（表3）。推導(dǎo)結(jié)果表明鄂麥23、鄂麥15、襄麥55、鄂麥352、陜89150、鄂麥21、鄂麥11和陜旱8675等8個(gè)小麥品種對(duì)所有菌系均表現(xiàn)高感型，因此這些材料不含有已知抗葉銹病基因或攜帶未知抗病基因；Lr1對(duì)小種KHJS、KHHT、FHRT、FHJQ、FHTR、FHHT①、FHHT②、FHTT和FGMT表現(xiàn)低侵染型（;1），而小麥品種陜229、鄂麥14、鄂恩5號(hào)、西農(nóng)979對(duì)所有Lr1無(wú)毒的小種均表現(xiàn)抗性，表明這些材料中攜帶Lr1；Lr13對(duì)編號(hào)PHTT、FHHT①、FHTT和FGMT

表現(xiàn)低侵染型（;1），陜229、貴農(nóng)16和西農(nóng)979等3個(gè)品種對(duì)此4個(gè)小種也表現(xiàn)相似的低侵染型，說(shuō)明這些材料中可能含有 Lr13；Lr26對(duì)小種 TGGT和FGMT表現(xiàn)低侵染型（2），而小麥品種（系）鄂恩1號(hào)、鄂恩5號(hào)、鄂恩6號(hào)、貴農(nóng)16、陜225、陜354、陜715、陜合6號(hào)、陜麥509和陜農(nóng)7859對(duì)所有Lr26無(wú)毒的小種均表現(xiàn)抗性，表明這些材料可能攜帶有Lr26（表1）。

表3 30個(gè)已知抗葉銹病基因?qū)?8個(gè)葉銹菌生理小種的苗期侵染型Table 3 Seedling infection types on 30 wheat lines with known leaf rust resistance genes when tested with 18 pathotypes of P. triticina

續(xù)表3 Continued table 3

續(xù)表3 Continued table 3

2.2 田間成株抗病性鑒定

2014—2015和2015—2016年度連續(xù)2年在河北保定和河南周口2個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)這些材料進(jìn)行了成株抗葉銹鑒定，方差分析結(jié)果表明各品種間和地點(diǎn)間差異均極顯著，年份間差異顯著，品種與地點(diǎn)間和品種與年份間差異均極顯著，而品種與重復(fù)間和重復(fù)間均不顯著，這表明小麥葉銹病抗性的表達(dá)受基因型和環(huán)境互作共同影響（表4）。此外，根據(jù)2年2點(diǎn)田間鑒定，慢銹對(duì)照SAAR均表現(xiàn)明顯的慢銹性（表5）。經(jīng)IBM SPSS Statistics 19.0軟件分析發(fā)現(xiàn)在30個(gè)小麥生產(chǎn)品種共有18個(gè)品種的FDS與慢銹對(duì)照的FDS差異不顯著，且其侵染型在苗期對(duì)混合小種均表現(xiàn)感病，因此這些材料均表現(xiàn)為慢銹性（表5）。

2.3 分子檢測(cè)

30個(gè)小麥品種進(jìn)一步利用11個(gè)分子標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)（表2），共檢測(cè)到Lr1、Lr26和Lr46的特異目的片段（圖1、圖2），而未檢測(cè)到Lr9、Lr10、Lr19、Lr20、Lr24和 Lr34相應(yīng)的特異條帶（圖 1）。鄂麥14、陜229、西農(nóng)979和鄂恩5號(hào)等品種中檢測(cè)出Lr1，鄂恩1號(hào)、鄂恩5號(hào)、鄂恩6號(hào)、陜合6號(hào)、貴農(nóng)16、陜225、陜354、陜715、陜麥509和陜農(nóng)7859等品種中檢測(cè)到與Lr26相同的帶型，陜225和小偃81兩個(gè)品種檢測(cè)出與Lr46基因相同的帶型，其余的品種均未檢測(cè)出Lr46（圖2）。分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果見表1，另外結(jié)果顯示分子標(biāo)記與基因推導(dǎo)鑒定結(jié)果表現(xiàn)一致。

表 4 30個(gè)小麥品種及慢銹SAAR和感病對(duì)照在2014—2015和2015—2016年分別在保定與周口最終病害嚴(yán)重度的方差分析Table 4 Analysis of variance of relative area final disease severity (FDS) in 30 wheat cultivars including slow rusting cultivar SAAR and susceptible checks tested in the 2014-2015 and 2015-2016 growing seasons

3 討論

本研究結(jié)合基因推導(dǎo)和標(biāo)記檢測(cè)，共鑒定出Lr1、Lr13、Lr26和 Lr46等少數(shù)幾個(gè)抗病基因，說(shuō)明中國(guó)小麥材料中抗病基因單一，而且缺乏有效的抗病基因。目前只有少數(shù)幾個(gè)抗病基因如Lr9、Lr19、Lr24、Lr28、Lr47、Lr51和 Lr53等對(duì)所有供試小種表現(xiàn)高抗，但這些基因在生產(chǎn)品種中尚未廣泛應(yīng)用，因此今后應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)抗病育種工作，在生產(chǎn)品種中轉(zhuǎn)化更多的有效抗病基因來(lái)抑制小麥葉銹病流行。本研究中陜 225和小偃81經(jīng)標(biāo)記檢測(cè)攜帶有Lr46，但其田間嚴(yán)重度分別為15%和57%，表現(xiàn)中度抗病及高度感病，表明Lr46單獨(dú)存在時(shí)，效應(yīng)比較微弱，需聚合更多的微效基因，才能達(dá)到高水平的成株抗病性。

鄂恩1號(hào)由（洛夫林10/761）F1與蘇麥3號(hào)雜交選育而來(lái)，親本洛夫林10含有抗病基因Lr26[33]，說(shuō)明鄂麥1號(hào)中攜帶的Lr26可能來(lái)自于洛夫林10；鄂麥14由繁6/偃大72-629雜交選育而成，其親本繁6的系譜為 I413B01828/NP824/3/五一麥/成都光頭分枝麥/中農(nóng) 483/4/中農(nóng) 2813分枝/阿夫，其中阿夫含有Lr1[34]，說(shuō)明鄂麥14中的抗病基因Lr1可能來(lái)自于阿夫；西農(nóng)979的親本西農(nóng)2611是以陜229作母本、（84＜14＞43×83＜2＞3）×（西農(nóng)65×小偃6號(hào)）作父本雜交選育而成，雖然陜229中的Lr1無(wú)法經(jīng)系譜推出，但很明顯西農(nóng)979的Lr1來(lái)自于陜229。莊巧生[35]在2003年指出洛夫林、畢加索、山前草和阿芙樂爾等骨干品種均含有抗葉銹病基因 Lr26，本研究中攜帶Lr26的4個(gè)品種陜農(nóng)7859、陜麥509、陜354和陜715，其親本均有攜帶Lr26的骨干親本。經(jīng)基因推導(dǎo)可知西農(nóng)979、陜229和貴農(nóng)16可能攜帶有Lr13，此3個(gè)品種在田間嚴(yán)重度為19%，表現(xiàn)為慢銹品種；Lr13的載體品系RL4031在田間的嚴(yán)重度為5%，西農(nóng)979、陜229和貴農(nóng)16是否攜帶Lr13有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。本研究中還鑒定到18個(gè)表現(xiàn)成株慢銹的品種，這些材料中可能攜帶未知的成株慢銹基因，今后應(yīng)利用遺傳分析結(jié)合分子標(biāo)記明確其成株抗性的抗病機(jī)理，同時(shí)這些材料也可將來(lái)用于持久抗性品種的選育。

表5 32個(gè)小麥品種、慢銹品種及對(duì)照品種苗期對(duì)混合小種的反應(yīng)型和成株期在2014—2015年和2015—2016年的最終病害嚴(yán)重度Table 5 Infection types (IT) in the seedling test with P. triticina pathotype mixed species and mean final disease severity (FDS) in the field experiments with the same pathotype in the 2014-2015 and 2015-2016 growing seasons for 32 wheat genotypes with slow rusting resistance to leaf rust

圖1 用Lr1、Lr9、Lr10、Lr19、Lr20、Lr24、Lr26和Lr34標(biāo)記檢測(cè)30個(gè)小麥品種的部分電泳結(jié)果Fig. 1 Part of PCR amplification of 30 Chinese wheat cultivars with the markers Lr1, Lr9, Lr10, Lr19, Lr20, Lr24, Lr26, and Lr34

圖2 用cslv46-G22標(biāo)記檢測(cè)30個(gè)小麥品種的電泳結(jié)果Fig. 2 The PCR amplification of 30 Chinese wheat cultivars with the CAPS marker cslv46-G22

基因推導(dǎo)及標(biāo)記檢測(cè)各有優(yōu)缺點(diǎn)：分子標(biāo)記快速、準(zhǔn)確且不受環(huán)境條件的限制，但易擴(kuò)增出非特異性帶型，出現(xiàn)假陽(yáng)性，影響結(jié)果檢測(cè)的準(zhǔn)確性；基因推導(dǎo)法周期短、不受生長(zhǎng)季節(jié)限制、在短期內(nèi)可對(duì)大量品種進(jìn)行分析且結(jié)果準(zhǔn)確，但易受小種鑒別力不足或遺傳背景等因素影響，使鑒定結(jié)果受到限制。在本研究中所選的分子標(biāo)記特異性強(qiáng)，能準(zhǔn)確地檢測(cè)出抗病基因，而且苗期基因推導(dǎo)與標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果一致，更加驗(yàn)證了結(jié)果的可靠性。部分材料由于含有未知抗病基因沒有推導(dǎo)出已知抗葉銹病基因，用其與感病品種配置雜交組合，進(jìn)一步利用遺傳分析和分子定位對(duì)未知基因進(jìn)行鑒定有望發(fā)現(xiàn)一些新的抗病基因，目前本課題組中共發(fā)現(xiàn)了LrZH84[17]、LrG98[36]、LrXi[37]、LrBi16[38]、LrNJ97[4]、LrFun[39]、LrZH22[40]等 7個(gè)新的抗葉銹病基因，都是通過此方法進(jìn)行鑒定和定位的。另外，本研究采用苗期基因推導(dǎo)和成株抗性鑒定相結(jié)合，苗期鑒定能夠檢測(cè)出苗期主效抗病基因，而不能檢測(cè)出成株微效抗病基因，而田間通過接種強(qiáng)毒性生理小種進(jìn)行鑒定，能夠檢測(cè)出成株慢銹基因。在本研究中篩選出18個(gè)品種可能攜帶成株慢銹抗病基因，這些材料可應(yīng)用于小麥生產(chǎn)培育持久抗病品種來(lái)防治小麥葉銹病。

4 結(jié)論

根據(jù)苗期基因推導(dǎo)和分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果，在 30個(gè)小麥品種（系）中有14個(gè)品種（系）中可能攜帶有4個(gè)已知抗葉銹病基因，即Lr1、Lr13、Lr26和Lr46。檢測(cè)到10個(gè)品種（系）含有Lr26，其中鄂恩5號(hào)攜帶Lr26和Lr1，貴農(nóng)16攜帶Lr26和Lr13，另外Lr26和Lr46共同存在于陜225中，檢測(cè)到含有Lr1的共有4個(gè)品種（系），除了上述鄂恩5號(hào)外，Lr1和Lr13共同存在陜229和西農(nóng)979中，品種鄂麥14僅含有Lr1；含有Lr46的有2個(gè)品種（系），除了陜225外，小偃81僅攜帶Lr46。通過田間抗性鑒定共檢測(cè)出18個(gè)品種（系）可能攜帶成株慢銹基因。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Analysis of Wheat Leaf Rust Resistance Genes in 30 Important Wheat Cultivars

YAN XiaoCui1, LI ZaiFeng2, YANG HuaLi1, ZHANG HuanHuan1, GEBREWAHID Takele Weldu1, YAO ZhanJun1, LIU DaQun2, ZHOU Yue3

(1College of Agronomy, Agricultural University of Hebei/North China Key Laboratory for Germplasm Resources of Education Ministry, Baoding 071001, Hebei;2College of Plant Protection, Agricultural University of Hebei/Biological Control Center for Plant Disease Pests of Hebei Province, Baoding 071001, Hebei;3Department of Biochemistry, Baoding University, Baoding 071001, Hebei)

【Objective】Leaf rust is an important wheat disease and it has a great influence on wheat yield. Breeding durable resistant cultivars can economically and effectively control the disease. The objective of this study is to identify leaf rust resistance genes in 30 wheat cultivars from China by gene postulation, molecular marker-assisted selection, adult plant resistance identification and pedigree analysis.【Method】The cultivars were tested for seedling responses in the greenhouse to 18 Puccinia triticina pathotypes (PHGQ, THJT, PHJT, KHJS, PHJS, THTT①, KHHT, FHRT, FHJQ, PHTT, THTT②, PHTT, FHTR, FHHT①, FHHT②, TGGT, FHTT, FGMT) and to a mixed pathotypes (FHRT, THTT, THJT) for slow leaf rusting resistance in the field in 2014-2015 and 2015-2016 cropping seasons in Zhoukou, Henan Province and Baoding, Hebei Province. CIMMYT line SAAR, with typical slow rusting resistance and Zhengzhou 5389, a highly susceptible line were used as slow rusting and susceptible checks, respectively. Differential sets containing 36 near-isogenic lines (NILs) in a background of Thatcher with known leaf rust resistance genes were used to compare the infection types of the cultivars at seedling stage. The software IBM SPSS Statistics 19.0 was used for analysis of variance (ANOVA) and for determining least standard deviations (LSDs) for comparing the FDS (the final diseases severity) among the wheat cultivars. Cultivars which were susceptible to the mixed pathotypes and had lower or non-significantly higher values of FDS than those of the slow rusting check in field trials were considered to be slow rusting cultivars.【Result】Gene postulation combined with pedigree analysis, and markers detection results showed that four cultivars, viz. Een 5, Emai 14, Shaan 229, and Xinong 979 contained Lr1; 10 cultivars (Een 1, Een 5, Een 6, Guinong 16, Shaan 225, Shaan 354, Shaan 715, Shaanhe 6, Shaanmai 509 and Shaannong 7859) carried Lr26, two cultivars (Shaan 225 and Xiaoyan 81) contained slow rust resistance gene Lr46 by molecular marker detection; three varieties (Xinong 979, Shaan 229, and Guinong 16) might contain Lr13. All cultivars didn’t carry resistance genes, viz. Lr9, Lr10, Lr19, Lr20, Lr24, and Lr34. Based on the leaf rust resistance phenotype data in the field through four environments, a total of 18 cultivars showed slow rusting resistance. The variance analysis results showed that the genotypes-years interactions and the genotypes-locations were highly significant differences but genotypes-replicates interaction was not significant. At the same time, highly significant differences were found for wheat genotypes and environment (seasons and locations) for FDS in the field trials, but its effect on variation was much less than the genotypic differences. Therefore, these suggested that the expression of wheat leaf rust resistance was mainly influenced by genotypes and environments.【Conclusion】Four resistance genes, viz. Lr1, Lr26, Lr13, and Lr46 were found in 14 wheat cultivars among 30 released winter wheat cultivars in China, but known leaf resistance genes could not be detected in other 16 cultivars. A total of 18 cultivars might carry slow rust resistance genes according to the field resistance data. All slow rusting materials may contain unknown plant leaf rust resistance genes, which need further genetic identification.

wheat leaf rust; gene postulation; adult plant resistance; molecular marker-assisted selection

2016-08-22；接受日期：2016-10-19

國(guó)家自然科學(xué)基金（31361140367，31571662）、河北省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃重點(diǎn)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（11960145D）、河北省高等學(xué)校自然科學(xué)研究項(xiàng)目（QN2016316）

聯(lián)系方式：閆曉翠，Tel：15933976327；E-mail：yanxiaocui101412@126.com。通信作者姚占軍，Tel：0312-7528121；E-mail：yzhj201@aliyun.com。通信作者劉大群，E-mail：ldq@hebau.edu.cn