中藥有效成分硫酸多聚糖WSS25在動物膠質瘤血管再生中的實驗研究

續嶺　王培　謝明祥　肖順武　猶春躍　吳海濤　張學軍　趙洪新　唐懷波　代垠

【摘要】 目的：分析中藥有效成分硫酸多聚糖WSS25對動物模型下腦膠質瘤血管再生的影響作用。方法：以10只正常大鼠腦組織作為對照組，以20只C6膠質瘤模型大鼠腦腫瘤組織作為觀察組，對比兩組微血管密度計數（MVD）及CD34陽性表達率差異。同時將30只C6膠質瘤模型大鼠分為未接受藥物干預的未干預組及接受硫酸多聚糖WSS25干預的干預組，每組15只。對比兩組MVD計數及CD34陽性表達率差異。結果：觀察組腦組織或腫瘤組織中MVD計數及CD34陽性表達率均明顯高于對照組（P<0.05），干預組腦腫瘤組織中MVD計數及CD34陽性表達率均明顯低于未干預組（P<0.05）。結論：大鼠C6膠質瘤模型腦腫瘤組織中血管均明顯增生，且經硫酸多聚糖WSS25干預后，腦腫瘤組織中血管可顯著降低，其作用機制可能與CD34密切相關。

【關鍵詞】 硫酸多聚糖WSS25； 大鼠； 膠質瘤； 血管再生

Study the Role of Glioma Angiogenesis and Its Mechanism of Chinese Medicine Effective Component Polysaccharide Sulfate WSS25 in Animal Models of Cerebral Glioma Angiogenesis/XU Ling，WANG Pei，XIE Ming-xiang，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（02）：001-004

【Abstract】 Objective：To analyze the glioma angiogenesis and its mechanism of component Polysaccharide Sulfate WSS25 impact on animal models of cerebral glioma angiogenesis in animal models of cerebral glioma angiogenesis.Method：As the control group，with 10 normal rats，20 C6 glioma model rats were as the observation group，counting microvascular density（MVD） and CD34 positive expression rate the positive expression rate differences of two groups were compared.At the same time，30 rat of C6 glioma model were divided into the intervention group（Polysaccharide Sulfate WSS25） and the without intervention group，15 cases in each group.MVD counting and CD34 positive expression rate of two groups were compared.Result：MVD and CD34 positive expression in the observation group of brain tissue were significantly higher than those of the control group（P<0.05），MVD and CD34 positive expression in the intervention group were lower than those of the without intervention group（P<0.05）.Conclusion：Rat C6 glioma model in brain tissue hyperplasia of blood vessels and lymphatic vessels are obvious，and the polysaccharide sulfate WSS25 after the intervention，in the brain blood vessels and lymphatic vessels can be significantly reduced，its mechanism may be closely related with CD34.

【Key words】 Polysaccharide Sulfate WSS25； Rat； Glioma； Angiogenesis

First-authors address：Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Zunyi 563003，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.02.001

腦膠質瘤為臨床最為常見的顱內惡性腫瘤，其占顱內惡性腫瘤的50%左右，臨床有著較高的發病率[1]。雖然目前臨床已經出現了包括手術治療、放射治療、藥物化療及基因免疫治療在內的多種治療方法及治療方案，可應用于本病的臨床治療，但因本病有著增長迅速且易于復發的臨床特征，不僅增加了本病的治療難度，同時也使得患者的死亡率較高[2]。近年來臨床研究顯示，腦膠質瘤快速增生其原因與腫瘤內部血管生成有著密切的關系，快速生成的腫瘤內部血管，可為腫瘤提供充足的氧氣及營養成分，促進腫瘤組織的快速增長，因此抗腫瘤血管生成目前已經成為惡性腫瘤治療中最為重要的治療方向之一[3]。而近年來臨床觀察顯示，中藥天麻有效成分硫酸多聚糖WSS25在一定程度上具有著抗腫瘤血管生長的作用，而對于其作用機制目前臨床研究上少。故為可系統地評價硫酸多聚糖WSS25對腫瘤內部血管生長的影響及其作用機制，本研究將其應用于C6膠質瘤模型大鼠中，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以60只Wistar雄性大鼠作為觀察對象，隨機將大鼠分為對照組、觀察組、未干預組及干預組四組。對照組含大鼠10只，未接受腦膠質瘤建模；觀察組含大鼠20只，接受C6腦膠質瘤建模；未干預組含大鼠15只，為C6腦膠質瘤建模成功后，未接受硫酸多聚糖WSS25干預；干預組含大鼠15只，為C6腦膠質瘤建模成功后，接受腫瘤內注射硫酸多聚糖WSS25干預。對照組體質量261～296 g，平均（279.66±12.11）g；觀察組體質量262～297 g，平均（277.33±12.26）g；未干預組體質量260～298 g，平均（278.16±12.09）g；干預組體質量261～298 g，平均（279.98±12.05）g。對照組與觀察組間、未干預組與干預組間體質量比較，差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 建模方法 觀察組、未干預組及干預組三組內大鼠均需接受C6膠質瘤建模，C6膠質瘤購自中科院上海生物學研究所。大鼠均于麻醉、固定及消毒后，進行開顱鉆孔，暴露局部腦組織，隨后將C6膠質瘤接種至右腦尾狀核部位，完成接種后，觀察組及未干預組立即封閉鉆孔部位，而干預組隨后均于該部位硫酸多聚糖WSS25局部注入，見圖1～4。所有大鼠均于C6膠質瘤接種20 d后處死。

1.3 標本制作 大鼠處死后，留取局部腦組織（對照組隨機選擇腦組織部位，觀察組、未干預組及干預組選取膠質瘤部位），應用免疫組化S-P法對四組局部腦組織或腫瘤中CD34及LYVE-1陽性表達率進行及觀察。免疫組化S-P方法：首先對所有腦組織或腫瘤組織組織裂解，做成細胞懸液，完成固定及包埋后，進行切片，切片厚度為4 μm。隨后將所有切片置于80 ℃下進行溫烘烤，烘烤時間設定為50 min。烘烤完成后，將切片進行脫蠟及脫水處理。完成以上操作后，需對標本切片進行孵育，孵育液應用3%過氧化氫，孵育溫度為室溫，孵育時間為10 min。隨后進行蒸餾水沖洗及5 min的PBS浸泡。完成浸泡后，將標本切片放置于沸騰的枸櫞酸鈉沖液中，放置時間為15 min。取出后需于室溫下靜置40 min，并進行PBS沖洗3次。沖洗完成后進行一抗及二抗，一抗及二抗結束時分別進行3次PBS沖洗。完成一抗及二抗后進行標本切片的染色及復染，染色應用DAB染色，復染應用蘇木素。免疫組化試劑盒為KIT-5010（購自福州邁新生物技術開發有限公司），DAB顯色試劑盒為

DAB-0031（購自福州邁新生物技術開發有限公司）。

1.4 觀察指標 首先將所有切片標本置于顯微鏡低倍鏡下進行觀察，選取標本中血管豐富區域，轉換為高倍鏡，于高倍鏡下統計MVD計數。其次，對所有標本組織裂解，做成細胞懸液，免疫組化辨別CD34、MMP-9、VEGF、TSP-1及PPAR-γ陽性率進行判定，均以標本中棕黃色細胞漿>10%者為陽性。對比兩組MVD計數、CD34、MMP-9、VEGF、TSP-1及PPAR-γ陽性率表達率差異。

1.5 統計學處理 本研究所得所有數據均導入SPSS 19.0軟件中，建立數據庫。計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組與觀察組MVD計數比較 對照組腦組織中MVD計數為（3.11±1.25）個/HP，觀察組腦腫瘤組織中MVD計數為（8.33±2.16）個/HP，觀察組明顯高于對照組（P<0.05）。

2.2 對照組與觀察組血管因子陽性表達率比較 觀察組腦腫瘤組織中CD34、MMP-9及VEGF陽性表達率均明顯高于對照組，而TSP-1及PPAR-γ均明顯低于對照組（P<0.05），見表1。

2.3 未干預組與干預組MVD與LVD計數比較 未干預組腦腫瘤組織中MVD計數為（8.55±2.32）個/HP，干預組腦腫瘤組織中MVD計數為（6.29±2.15）

個/HP，干預組明顯低于未干預組（P<0.05）。

2.4 未干預組與干預組間血管因子陽性表達率比較 干預組腦腫瘤組織中CD34、MMP-9及VEGF陽性表達率均明顯低于未干預組，而TSP-1及PPAR-γ明顯高于未干預組（P<0.05），見表2、圖5～7。

3 討論

3.1 膠質瘤動物建模概況 因大鼠在膠質瘤模型建立過程中具有著經濟易得、制作簡單、腫瘤生長迅速、模型制作時間短、生存期可標準化等優點，因此大鼠為目前臨床應用于制作膠質瘤最為常用的模型動物[4]。而雖然目前臨床可應用于建立膠質瘤模式的大鼠可包括Wistar大鼠、SD大鼠及無腺裸鼠等多種，但臨床觀察顯示，僅Wistar大鼠所制作出的動脈模型更接近于腦膠質瘤[5-6]。而臨床在進行模型建立過程中，最為常用的細胞株則包含C6、9L、T9 和F98等多，而通過近年來臨床觀察顯示，C6細胞株所制作出的膠質瘤模型，具有著簡單、穩定、成本低、易大規模制備等優點，已被臨床廣泛應用于膠質瘤的動物模型制作中[7-8]。雖然通過C6所致制作出的動脈模型具有較前的免疫原性，對于腫瘤的免疫學研究存在一定的缺陷，但其對于腫瘤內血管的生長卻敏感性較高，因此在對于評價腫瘤內部血管再生情況，常應用C6模式[9-10]。因此，本研究將C6膠質瘤模型作為觀察模型。

3.2 CD34及MVD評價價值 雖然近年來醫學技術有著飛速的發展，但是對于惡性腫瘤的發生機制，仍未完全明確。但近年來臨床研究顯示，惡性腫瘤組織內部細胞因子可顯著升高，且可伴有血管及淋巴管增生[11-12]。因此有學者認為，惡性腫瘤的發生及發展與體內多種細胞因子升高及血管及淋巴管增生可能與均存在顯著的關系[13-15]。

而在本研究所選取的觀察的指標中，MVD計數可通過直視觀察對組織內血管密度情況進行分析，最為直觀的評價腫瘤組織內血管情況的指標。而CD34屬鈣黏蛋白，生理情況下，其僅分布于造血干細胞膜及血管內皮細胞內，而局部血管再生后，也可使得局部血管內皮細胞含量升高，使得表達情況明顯升高[16-17]。因此其可作為評價血管再生情況最可靠的標記物之一。因此本研究將MVD計數及CD34作為觀察指標，以評價膠質瘤組織內的血管再生情況。

而本研究在分析硫酸多聚糖WSS25對大鼠C6膠質瘤模型內血管再生情況前，對模型內血管再生情況進行分析，結果顯示：觀察組腦組織中MVD計數及CD34陽性表達率均明顯高于對照組（P<0.05）。由此可見，腦膠質瘤動物模型內，血管再生情況顯著。

3.3 硫酸多聚糖WSS25作用分析 硫酸多聚糖WSS25為提取自中藥天麻的藥物有效成分，目前臨床研究顯示，其具有著一定的抗癌細胞生長及抗血管生成的作用，因此本研究將其應用于膠質瘤的動物模型中，以探討其在膠質瘤中的作用。通過本研究結果可見：在接受硫酸多聚糖WSS25干預的膠質瘤動脈腦組織標本中，其MVD計數均明顯低于對照組，且CD34陽性表達率明顯低于未干預組（P<0.05）。可見，在應用了硫酸多聚糖WSS25干預后，大鼠C6膠質瘤模型中的血管降低，且可刺激血管生長的CD34因子的陽性表達率也顯著的下降。有研究表明，硫酸多聚糖WSS25可在一定程度上降低動物模型內血管的再生情況，且其機制可能與抑制CD34因子有關[18-21]。

綜上所述，大鼠C6膠質瘤模型腦組織中血管及淋巴管均明顯增生，且經硫酸多聚糖WSS25干預后，腦組織中血管及淋巴管可顯著降低，其作用機制可能與CD34密切相關。

參考文獻

[1]申漢威，李俊卿，李紅星，等.新城疫病毒與膠質瘤的研究進展[J].檢驗醫學與臨床，2014，36（z2）：301-303.

[2]牟成志，張海山，曲元明，等.艾司西酞普蘭對膠質瘤患者術后抑郁癥狀療效的對照研究[J].精神醫學雜志，2012，25（3）：207-209.

[3]詹茸婷，和鴻，王明磊，等.磁敏感加權成像血管結構半定量評分法對顱內膠質瘤分級的診斷價值[J].實用放射學雜志，2014，12（12）：1958-1961.

[4] Doblas S，Saunders D，Kshirsagar P，et al.Phenyl-tertbutylnitrone induces tumor regression and decreases angiogenesis in a C6 rat glioma model[J].Free Radic Biol Med，2008，44（1）：63-72.

[5]邱大勝，徐麗瑩，尹明媛，等.注射后留置時間對大鼠C6腦膠質瘤模型的影響[J].重慶醫科大學學報，2008，33（10）：1260-1263.

[6] Stupp R，Reni M，Gatta G，et al.Anaplastic astrocytoma in adults[J].Crit Rev Oncol Hematol，2007，63（1）：72.

[7]易林華，傅相平，李安民，等.Wistar大鼠C6膠質瘤腦移植模型的應用[J].南方醫科大學學報，2011，31（2）：277-279.

[8]王震，李凱強，陳秉宇，等.烏骨藤粗提物對大鼠膠質瘤C6細胞的體外實驗研究[J].浙江醫學，2015，37（10）：809-811，819.

[9] Ran S，Volk L，Hall K，et al.Lymphangiogenesis and lymphatic metastasis in breast cancer[J].Pathophysiology，2010，17（4）：229-251.

[10] Mierke C T.Cancer cells regulate biomechanical properties of human microvascular endothelial cells[J].The Journal of Biological Chemistry，2011，286（46）：40 025-40 037.

[11] Ma Y，Hou Y，Liu B，et al.Intratumoral Lymphatics and Lymphatic Vessel Invasion Detected by D2-40 Are Essential for Lymph Node Metastasis in Bladder Transitional Cell Carcinoma[J].The Anatomical Record，2010，293（11）：1847-1854.

[12] Ozmen F，Ozmen M M，Ozdemir E，et al.Relationship between LYVE-1，VEGFR-3 and CD44 gene expressions and lymphatic metastasis in gastric cancer[J].World J Gastroenterol，2011，17（27）：3220-3228.

[13] Shindo K，Aishima S，Ohuchida K，et al.Podoplanin expression in cancer-associated fibroblasts enhances tumor progression of invasive ductal carcinoma of the pancreas[J].Mol Cancer，2013，12（1）：168.

[13] Fei Xiao，Hong Qiu，Ling Zhou，et al.WSS25 inhibits Dicer，downregulating microRNA-210，which targets Ephrin-A3，to suppress human microvascular endothelial cell（HMEC-1） tube formation[J].Glycobiology，2013，23（5）：524-535.

[14] Chen X，Xiao F，Wang Y，et al.Structure-activity relationship study of WSS25 derivatives with anti-angiogenesis effects[J].Glycoconjugate Journal，2012，29（5/6）：389-398.

[15]朱航，雷迅，張帆，汪洋.腦膠質瘤危險因素Meta分析及危險因素控制后發病率的變化趨勢[J].中國醫科大學學報，2012，41（6）：554-558.

[16]朱惠芳，張遠旭，趙旭東.腦膠質瘤動物模型的研究及應用進展[J].動物學研究，2012，33（3）：337-342.

[17]尚超，洪楊，薛一雪.MACC1基因在腦膠質瘤中的表達及其對U87細胞凋亡和增殖的影響[J].解剖科學進展，2011，17（1）：1-3.

[18]徐國政，袁先厚.腦膠質瘤靶向治療新進展[J].中國臨床神經外科雜志，2011，16（9）：568-572.

[19]陳麗娟，魯翠濤，趙應征，等.超聲微泡用于腦膠質瘤靶向藥物遞送[J].藥學學報，2015，50（1）：99-103.

[20]林婷婷，李鋼.腦膠質瘤的綜合臨床治療的研究進展[J].中國臨床神經外科雜志，2013，18（5）：316-319.

[21]劉燕茹，朱曉芳，王琴，等.海藻多聚糖硫酸酯對小鼠毛囊生長周期的影響[J].揚州大學學報（農業與生命科學版），2010，31（2）：10-13.

（收稿日期：2016-11-15） （本文編輯：程旭然）