一種具有瓊膠酶活性的海洋細菌淀粉酶的表達和分析

林伯坤宋燕陸國永趙敏鐘名其胡忠

（1. 廣東醫科大學公共衛生學院東莞市環境醫學重點實驗室，東莞 523808；2. 汕頭大學廣東省海洋生物技術重點實驗室，汕頭 515063）

一種具有瓊膠酶活性的海洋細菌淀粉酶的表達和分析

林伯坤1，2宋燕2陸國永2趙敏2鐘名其2胡忠2

（1. 廣東醫科大學公共衛生學院東莞市環境醫學重點實驗室，東莞 523808；2. 汕頭大學廣東省海洋生物技術重點實驗室，汕頭 515063）

旨在驗證海洋新種細菌ZC1中可能存在的具有瓊膠酶活性的淀粉酶。對菌株ZC1中的淀粉酶編碼基因amy440進行基因克隆和重組原核表達，并用活性電泳法驗證重組蛋白的淀粉酶和瓊膠酶活性。結果顯示，基因amy440的重組蛋白在淀粉酶和瓊膠酶活性電泳上均出現活性顯色條帶。菌株ZC1中基因amy440的編碼蛋白是一種具有瓊膠酶活性的淀粉酶。

瓊膠酶；淀粉酶；多功能酶；基因克??；重組表達

多功能酶（multifunctional enzymes，MFEs）通常是指具有多種生理功能的酶［1］。按照酶的作用機理，一般可以將多功能酶分為：條件多功能酶，底物多功能酶和催化多功能酶［1］。條件多功能酶是指在不同反應條件下具有不同催化活性的酶，底物多功能酶強調能作用于不同底物，催化多功能酶則指用相同的作用位點催化不同的生物轉化反應。一般認為多功能酶可以在不加大基因組的前提下擴大生物體的生物功能［2］，此外多功能酶可以在生化或信號途徑中轉換其功能使生物體更好適應環境［3］。

α淀粉酶是得到研究和應用最廣泛的淀粉水解酶［4］。按照CAZy數據庫根據催化活性保守區的劃分［5］，當前報道的大多數α淀粉酶（EC 3.2.1.1）屬于糖苷水解酶13家族（GH13），其次歸屬于GH57家族，還有少數屬于GH119和GH126［4］。糖苷水解酶分子中一般除了催化區還有底物結合模塊［6，7］。目前報道的淀粉酶的淀粉結合模塊主要包括10個糖結合模塊家族（Carbohydrate-Binding Module，CBM），分別是：CBM20、CBM21、CBM25、CBM26、CBM34、CBM41、CBM45、CBM48、CBM53和CBM58［4］，此外還有新近建立的CBM69［8］和CBM74［9］。瓊膠酶（Agarase）是可以降解瓊脂糖的酶，分別歸屬于糖苷水解酶GH16、GH50、GH86、GH96和GH118家族［10］。目前科學界已經在各種生物體中發現了一些多功能淀粉酶［11-14］，Liu等［15］最近就報道具有瓊膠酶和卡拉膠酶活性的α淀粉酶Amy63。但目前報道的擁有瓊膠酶活性的淀粉酶還非常少。

產瓊膠酶海洋細菌ZC1是2012年建立的細菌新種Aquimarina agarilytica的典型菌株［16］，其基因組已經得到測序［17］，在其基因組中發現了兩個淀粉酶編碼基因?？紤]到菌株ZC1可以在含淀粉而不含瓊膠的培養基中產生瓊膠酶，推測該菌株可能會產生同時具有淀粉酶和瓊膠酶活性的酶。本研究擬通過克隆和重組表達菌株ZC1的一個淀粉酶編碼基因amy440以驗證其重組蛋白可能具有的淀粉酶和瓊膠酶活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 質粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、細菌基因組提取試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司；蛋白質分子量標準購于江蘇碧云天研究所（Beyotime）；DNA分子量標準、DNA聚合酶（Primer STAR HS DNA polymerase）、dNTP Mixture、限制性內切酶、T4 DNA連接酶、克隆質粒載體pMD19-T購自大連寶生物有限公司；瓊脂糖（Agarose LE）系由臺灣MD生物公司生產，其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 材料 在產瓊膠酶海洋細菌ZC1的基因組中，發現了兩個推測的淀粉酶編碼基因，其中一個命名為amy440。

1.2 方法

1.2.1 淀粉酶基因amy440的生物信息學分析 運用Blast程序分析蛋白序列相似性（http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/），在線工具motif分析保守區（http:// www.genome.jp/tools/motif/）， 用 軟 件BioEdit進 行序列比對，用軟件Mega 6.0［18］構建系統進化樹（Neighbor-Joining）。

1.2.2 淀粉酶基因amy440的克隆和重組表達載體構建 使用Primer Premier 5.0 軟件設計特異性引物，所設計的引物如表1所示。

表1 淀粉酶基因amy440的PCR引物

使用細菌基因組提取試劑盒提取菌株ZC1的基因組DNA，使用表1中引物擴增淀粉酶基因，擴增體系如下。

PCR反應體系：2×Primer STAR Buffer 25 μL，Primer STAR HS DNA polymerase 2.5 U，dNTP Mixture各200 μmol/L，正反引物各50 pmol，DNA模板0.1 μg，用水補足至50 μL。

PCR反應條件：95℃預變性4 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2.5 min，30個循環數；72℃延伸15 min。

使用質粒小提試劑盒提取表達載體pET-32a（+）表達載體。使用限制性內切酶Sac I與Sal I同步雙酶切基因amy440的PCR擴增產物和表達載體。將連接好的重組載體轉化大腸桿菌E. coli DH5α感受態細胞，置于37℃培養。通過T7引物PCR擴增來篩選重組子，目的克隆送測序（華大基因）。將經過驗證的重組載體轉化大腸桿菌E. coli Rosetta（DE3）pLyS，同樣用T7引物進行轉化驗證。同時設立空載體對照：將提取的pET-32a（+）質粒直接轉化E. coli Rosetta（DE3）pLyS感受態以作為誘導表達時的空載體對照。

1.2.3 目的基因的重組表達 將重組菌培養于含氨芐青霉素（50 μg/mL）的LB液體培養基中，當細菌生長至對數生長期時，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG誘導目的基因的表達（16℃、150 r/min誘導20 h）后，取100 mL菌液收集菌體，向菌體中加入20 mL Tris-HCl緩沖液（20 mmol/L，pH8.0）重懸菌體，在冰浴中超聲破碎菌體（超聲破碎條件：功率300 W，工作3 s，間歇3 s，全程15 min）。分別取胞外發酵液、菌體總蛋白、菌體破碎上清和破碎沉淀等組分進行SDS-PAGE檢測誘導表達效果。同時設置未誘導對照和空載體對照。

1.2.4 包涵體蛋白的制備和復性 對誘導表達的重組菌進行超聲破碎，離心收集包涵體沉淀（12 000 r/min，15 min）。用適量的緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素，2%Triton）洗滌包涵體沉淀，最后用適量的包涵體溶解緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，100 mmol/L β-巰基乙醇，2%Triton）重懸，室溫攪拌過夜。12 000 r/min，4℃離心15 min，收集上清液，用SDS-PAGE檢測包涵體溶解效果。用透析緩沖液稀釋溶解的包涵體蛋白濃度至約100 μg/mL，依次用分別含6、4、2、1和0.5 mol/L尿素的透析液進行透析，在4℃透析，每4-6 h更換新鮮透析液一次，高速離心去除沉淀，最后用磷酸緩沖液（pH7.4）透析過夜，高速離心去除沉淀，上清進行超濾濃縮。

1.2.5 活性電泳測定淀粉酶和瓊膠酶活性 在12%的分離膠（不含SDS）中分別加入1%的淀粉、1%的低熔點瓊脂糖作為酶的反應底物，以復性的包涵體蛋白為電泳樣品。電泳結束后，將分離膠置于20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液中，37℃孵育30 min，取出分離膠用碘液對其染色，分別觀察淀粉酶和瓊膠酶活性。

2 結果

2.1 淀粉酶Amy440基因的生物信息學分析

淀粉酶Amy440的編碼基因長2 190 bp，編碼 730個 氨 基 酸（GenBank accession number = WP_010181598）。Blast分析表明，淀粉酶Amy440與GenBank數據庫中其他淀粉酶序列最高只有45%的序列相似性，在線工具motif的分析（圖1）表明，淀粉酶Amy440的N端存在一個α淀粉酶活性催化區，在C端一側有兩個屬于CBM26家族的底物結合模塊。因此，Amy440應屬于α淀粉酶。在與目前已經得到研究的屬于GH13、GH57、GH119和GH126等家族的α淀粉酶構建的蛋白序列系統進化樹（圖2）表明，Amy440與GH13家族的α淀粉酶聚在同一分支，因此Amy440應屬于GH13家族。

圖1 淀粉酶Amy440的序列分析

圖2 淀粉酶Amy440的系統進化樹

2.2 淀粉酶Amy440的基因克隆和重組表達

淀粉酶Amy440的理論蛋白分子量約為81 kD，加上載體中的融合蛋白，理論上重組蛋白分子量約為95 kD。經SDS-PAGE檢測（圖3），對比未誘導的樣品，經誘導表達的重組菌菌體破碎液的沉淀中發現有過量表達的目的條帶，說明表達的目的蛋白主要以包涵體的形式存在，需要進行包涵體蛋白的制備和復性。

圖3 重組菌表達的檢測

2.3 包涵體蛋白的復性

提取的包涵體蛋白經復性后進行SDS-PAGE分析，結果（圖4）顯示，在電泳凝膠上顯示比較單一的條帶，且分子量大小與預期相符，說明純化效果較好，可以用于下一步的活性檢測。

圖4 SDS-PAGE檢測復性后的包涵體蛋白

2.4 淀粉酶活性檢測

電泳結束后，蛋白凝膠上的淀粉酶條帶水解附近的淀粉，電泳凝膠上其他部位淀粉不受影響，經碘液染色，淀粉酶所在部位的淀粉已被水解而不著色，顯示無色透明條帶，其他部位仍含有淀粉而著色（圖5-A），說明包涵體蛋白具有淀粉酶活性，也即證實編碼蛋白Amy440具有淀粉酶活性。

2.5 瓊膠酶活性檢測

電泳結束后，蛋白凝膠上的瓊膠酶條帶水解附近的瓊脂糖，電泳凝膠上其他部位瓊脂糖不受影響，經碘液染色，瓊膠酶所在部位的瓊脂糖已被水解而不著色，其他部位仍含有瓊脂糖而著色（圖5-B），說明包涵體蛋白具有瓊膠酶活性，也即證實編碼蛋白Amy440具有瓊膠酶活性。

圖5 非變性凝膠電泳檢測酶活性

3 討論

目前發現的雙功能糖苷水解酶中有的具有兩個催化區［19］，一個催化區負責一種酶活性；有的只有一個催化區［20-22］，同一個催化區賦予兩種酶活性。本研究中的淀粉酶Amy440含有α淀粉酶的活性催化區，而并沒有當前已知的瓊膠酶活性催化保守區，推測只有一個催化區，屬于催化多功能，因此Amy440的主要活性應該在于淀粉酶，瓊膠酶活性是次要的活性。這與目前已報道的唯一同時具有淀粉酶和瓊膠酶活性的多功能淀粉酶Amy63相似［15］。雖然均具有淀粉酶和瓊膠酶活性，Amy63與Amy440的蛋白序列相似性只有28%左右，這可能與它們的物種親緣關系較遠有關：Amy63來自變形菌門弧菌屬，而Amy440來自擬桿菌門。并且Amy63擁有的催化區屬于GH70家族，而Amy440催化區屬于GH13家族。這也說明同時賦予淀粉酶和瓊膠酶活性的催化區不只來自一個GH家族。

一般認為CBM能起到幫助酶催化區附著底物的作用，已有研究表明CBM對酶的催化活性也有重要影響，可以提升酶的催化效率［23，24］。按照CAZy數據庫的記錄，目前有80種CBM。當前與淀粉酶有聯系的CBM有10多種。CBM26是其中一種常見的底物結合模塊，通常主要存在GH13家族α淀粉酶的C端或催化區之后［4，25］。用在線工具motif對Amy63進行分析后，發現Amy63沒有目前已知的CBM保守區，而在Amy440的C端部分存在兩個CBM26保守區。含有CBM26也從側面說明Amy440應屬于GH13家族α淀粉酶，與系統進化分析一致。目前已有研究顯示，CBM26的數量可能與淀粉酶活性有關［26，27］，CBM26數量越多，淀粉酶活性也越高。但相關研究還很少，需要更多研究來探討CBM與淀粉酶活性的關系。目前已得到研究的瓊膠酶中含有的CBM主要是CBM6［28，29］和CBM13［30，31］，擁有這些CBM的瓊膠酶主要歸屬于GH16家族。按照CAZy數據庫的記錄，當前未有瓊膠酶附帶CBM26模塊。

有關多功能酶的多功能催化活性的分子機制是今后的研究重點。對于淀粉酶Amy440，有待進一步研究其催化結構域的結構及其多功能催化活性的關鍵氨基酸。

4 結論

基因amy440是產瓊膠酶海洋新種細菌ZC1的淀粉酶編碼基因，長2 190 bp，編碼730個氨基酸，序列分析表明，其屬于糖苷水解酶13家族的α淀粉酶。通過對淀粉酶基因amy440進行克隆和重組原核表達，發現amy440的重組蛋白同時具有淀粉酶和瓊膠酶活性。

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（責任編輯 馬鑫）

Expression and Analysis of an Amylase with Agarase Activity from a Marine Bacterium

LIN Bo-kun1，2SONG Yan2LU Guo-yong2ZHAO Min2ZHONG Ming-qi2HU Zhong2
（1. Dongguan Key Laboratory of Environmental Medicine，School of Public Health，Guangdong Medical University，Dongguan 523808；2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Marine Biotechnology，Shantou University，Shantou 515063）

Our aim is to confirm that there is amylase with agarase activity in the novel marine bacterial strain ZC1. The amylase gene amy440 of strain ZC1 was cloned and expressed in recombinant prokaryotic vector and the amylase and agarase activity of the recombinant protein was determined using the method of activity staining electrophoresis. Results indicated that the recombinant protein of gene amy440 showed amylase and agarase activity in the activity staining electrophoresis. Conclusively，the encoded protein of gene amy440 of strain ZC1 is an amylase with agarase activity.

agarase；amylase；multifunctional enzyme；gene cloning；recombinant expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.018

2016-05-19

國家自然科學基金項目（31200077，41476150），廣東省揚帆計劃（4YF16003G），廣東省海洋生物技術重點實驗室開放基金項目（GPKLMB201504）

林伯坤，男，博士，研究方向：生物技術、衛生檢驗學；E-mail：albertbklin@foxmail.com

鐘名其，男，博士，研究方向：生物技術；E-mail：mqzhong@stu.edu.cn