家蠅幾丁質酶基因MDCII重組表達質粒的構建及表達模式研究

楊尉錦國果吳沁怡李妍付萍張勇

（1. 貴州醫(yī)科大學，貴陽550004；2. 貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腫瘤生物治療中心，貴陽550004）

家蠅幾丁質酶基因MDCII重組表達質粒的構建及表達模式研究

楊尉錦1國果1吳沁怡2李妍1付萍1張勇1

（1. 貴州醫(yī)科大學，貴陽550004；2. 貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腫瘤生物治療中心，貴陽550004）

從家蠅EST測序數據庫中篩選獲得家蠅幾丁質酶基因 MDCII，對該基因進行克隆及分子特性分析，探討其在家蠅不同組織、不同發(fā)育時期及經不同微生物誘導后的時空表達模式。利用EST測序技術從已構建的家蠅幼蟲cDNA質粒文庫篩選出MDCII基因，運用生物信息學方法分析該基因序列及其編碼蛋白的理化特性，采用鄰接法構建系統(tǒng)進化樹；PCR技術擴增目的基因，構建pEASY-E1-MDCII重組質粒，轉化到Trans1-T1克隆感受態(tài)細胞中；采用實時熒光定量PCR（Real Time PCR）技術，檢測MDCII基因在不同發(fā)育時期和不同組織部位的表達差異；采用注射法將不同微生物導入到家蠅3齡幼蟲體內，Real Time PCR檢測誘導后不同時間點MDCII基因表達水平的變化。結果顯示，MDCII基因的ORF框全長1 374 bp，編碼457個氨基酸，理論分子量51.6 kD，進化樹分析比對與果蠅成蟲盤生長因子的遺傳距離較近。構建了具有正確基因序列的pEASY-E1-MDCII重組質粒。MDCII基因在家蠅不同發(fā)育階段中均有不同程度的表達，在3齡幼蟲中，以唾液腺和脂肪體中的表達水平較高；在白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌誘導后3 h，MDCII基因均出現明顯的表達上調。MDCII基因屬于幾丁質酶中成蟲盤生長因子，參與了家蠅的生長發(fā)育，在免疫防御過程中也發(fā)揮了一定作用。

家蠅；幾丁質酶；克隆；表達模式

幾丁質是由β-1，4糖苷鍵連接N-乙酰-D- 氨基葡萄糖構成的直鏈多糖高聚物，廣泛存在于自然界中［1］。在昆蟲體內，它存在于外骨骼、圍食膜中，發(fā)揮骨架支撐等重要生理功能。幾丁質的水解主要由幾丁質降解酶來完成，幾丁質酶是幾丁質降解酶家族的關鍵酶，參與了昆蟲蛻皮、圍食膜降解等多種重要生命活動［2-4］。此外，幾丁質酶也具有抑制病原微生物生長等作用。鑒于幾丁質酶的重要性，以幾丁質為靶標，通過阻斷幾丁質酶的表達途徑，從而可阻止昆蟲的蛻皮、羽化及圍食膜再生，達到防治有害昆蟲目的［5］。由于幾丁質及其聚合物在脊椎動物等高等動物中不存在，因此通過擾亂幾丁質酶的正常調控進而破壞幾丁質的新陳代謝來防治害蟲，對脊椎動物和人類是相對安全并且有效的生物防治策略。

自1993 年Kramer［6］從煙草夜蛾中克隆出第一條完整的昆蟲幾丁質酶基因cDNA序列后，現已從雙翅目（dipterans）［7］、鱗翅目（lepidopterans）［8，9］、鞘翅目（coleopterans）［10］、半翅目（hemipteransf）［11］和膜翅目（hymenopterans）等昆蟲中鑒定到多個不同類型的幾丁質酶基因，有多個學者證實了幾丁質酶對小菜蛾、埃及伊蚊等有殺蟲增效作用［12，13］。

家蠅是一種常見的衛(wèi)生昆蟲，幾乎分布在世界的每一個地方，攜帶多種病原體和寄生蟲，可傳播傷寒、霍亂、痢疾等多種傳染病。一直以來，人們主要依靠化學手段來防治家蠅，但長期、大量地使用化學殺蟲劑，不僅對環(huán)境造成嚴重污染，同時使家蠅的抗藥性不斷增加，導致防治日益困難［14］。因此，尋求一種即可靠又安全的防治有害昆蟲的方法具有重要的意義。目前，國內外對家蠅的研究主要集中在先天性免疫活性因子的篩選及功能研究方面［15，16］，但對其在生長發(fā)育及免疫防御中具有重要意義的幾丁質降解酶家族卻鮮有報道。

本課題組前期對篩選到的家蠅幾丁質酶Ⅰ（MDCI）進行了克隆表達分析［17］，本研究對家蠅幾丁質酶MDCII基因進行克隆，構建重組表達質粒，采用實時熒光定量PCR的技術，分析MDCII的時空表達模式，初步探討該基因在家蠅生長發(fā)育及免疫防御過程中可能發(fā)揮的作用，旨在為有害昆蟲的生物防治設計合理的控制措施提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 家蠅（貴州醫(yī)科大學寄生蟲學教研室實驗室傳代繁殖），飼養(yǎng)條件：溫度28±1℃，相對濕度50%-60%，光照黑暗各12 h交替。

1.1.2 主要試劑和儀器 RNAiso Reagent（Total RNA提 取 試 劑 ）；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，SYBR Premix Ex TaqTMII，焦碳酸二乙酯（DEPC），DNA標志物DL2000，DNA凝膠回收試劑盒質粒、DNA快速提取試劑盒（均購自大連TaKaRa公司）；其他試劑均為國產分析純。PCR擴增儀（德國 Eppendorf 公司）；紫外分光光度計（美國 GE 公司）；顯微解剖鏡（尼康）。

引物合成與DNA測序：引物由TAKARA公司合成；重組質粒DNA測序工作由上海生工生物技術有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 家蠅幾丁質酶基因MDCII的識別及序列測定 對測定得到的家蠅3齡幼蟲EST序列進行BLAXT分析，從中篩選獲得編碼家蠅幾丁質酶基因的文庫質粒（編號為005-H08），命名為MDCII。

1.2.2 MDCII基因的生物信息學分析 利用NCBI網站的BLAST工具進行數據庫基因序列的相似性及同源性查找和比對，使用MEGA5.1軟件采用鄰接法構建系統(tǒng)進化樹；瑞士生物信息學研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)（ExPASy）分析MDCII基因編碼蛋白的理化特性。

1.2.3 MDCII基 因 的cDNA克 隆 用DNAClub和Primer5.0設 計 引 物。 上 游 引 物 為：5'-CAGTACCGATCATCGATATCAATACC-3'，下游引物為：5'- TTAGTGCAACAAACGATATTTAATG-3'。以MDCII基因的cDNA文庫質粒為模板，PCR循環(huán)參數為：94℃預變性5 min；94℃變性60 s；54℃退火60 s；72℃延伸60 s，35個循環(huán)；72℃總延伸10 min。PCR后產物行1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將目的基因與pEASY-E1載體25℃連接20 min，冰浴5 min，連接產物轉入Trans1-T1克隆感受態(tài)細胞中。挑選單菌落混于10 μL LB培養(yǎng)液中，用相同的引物、體系、循環(huán)參數分別使用目的基因的上下游引物、目的基因上游引物和T7下游引物、T7上游引物和目的基因下游引物及T7上下游引物進行PCR鑒定；將PCR鑒定陽性的菌液測序。

1.2.4 家蠅MDCII在不同發(fā)育時期、不同組織的表達分析 提取家蠅不同發(fā)育時期（卵、各齡期幼蟲、蛹及雌雄成蟲），以及3齡幼蟲不同組織（體壁、氣管、唾液腺、脂肪體、馬氏管及中腸）的總RNA，每個樣本設3個技術重復，并進行逆轉錄后，以獲得總cDNA，根據擴增得到的MDCII基因的cDNA序列在其保守序列區(qū)設計特異引物，上游引物序列為5'- ATGCAAATTTCATCAGTTTTCATCC-3'；下游引物序列為5'-GGATGAAAACTGATGAAATTTGCAT-3'。內 參 根 據 家 蠅 GAPDH 序 列 設計，上游引物為5'-CATCATCTCCGCTCCATC-3'；下游引物為5'-AAGCCATACCAGTGAGTTTACC-3'， 進 行qRTPCR檢測。反應條件為：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火1 min，40個循環(huán)。

1.2.5 家蠅MDCII在不同微生物誘導后的表達分析 取大小均一的3齡家蠅幼蟲，用顯微注射法分別將大腸埃希菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球（Staphylococcus aureus），白色念珠菌（Candida albicans），注入體內。在細菌刺激后3、6、12、18、24、36和48 h取樣，各實驗點分別設置3組平行，每個實驗對象設有6個生物重復。分別提取總RNA，按上述反應條件進行qRT-PCR檢測。采用比較CT值法對目標基因進行相對定量分析，采用SPSS17.0進行統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1 MDCII基因序列分析

MDCII基因序列包含一個1 374 bp的完整開放閱讀框（ORF），編碼一個由457氨基酸組成的蛋白，理論分子量約為51.6 kD，等電點約為9.13，含有6個半胱氨酸，在溶液中性質穩(wěn)定。MDCII同舌蠅的幾丁質酶成蟲盤生長因子（Idgf4）具有53%的相似性，與果蠅的CG520蛋白的相似度為61%。BLAST對其保守結構域分析顯示，MDCII包含幾丁質酶的保守結構域，屬于糖苷水解酶18家族（圖1）。

圖1 BLAST中MDCII保守結構域分析

二級結構分析顯示，MDCII蛋白有N-糖基化位點1個，N-肉豆蔻酰化位點7個，有6個潛在的蛋白激酶C磷酸化位點，1個甲殼酶18家族的活性位點。MDCII功能結構域為第31位氨基酸到第434位氨基酸間的序列，無幾丁質酶結合域，含有12個α螺旋和β折疊。

MDCII的進化分析中，所選序列分別來自果蠅、埃及伊蚊、按蚊和致倦庫蚊等，結果（圖2）顯示家蠅MDCII與果蠅成蟲盤生長因子的遺傳距離較近。

2.2 MDCII基因cDNA克隆

以MDCII基因的cDNA文庫質粒為模板，用特異性引物進行PCR擴增，獲得與預期目的基因大小一致的條帶（圖3）。經測序比對，結果顯示與目的基因cDNA序列一致。

圖2 MDCII進化樹分析

圖3 MDCII基因重組質粒的PCR鑒定圖

2.3 MDCII基因表達模式

2.3.1 不同發(fā)育時期的表達模式分析 在家蠅的各個發(fā)育時期，MDCII基因均有不同程度的表達。以卵期作為參照，MDCII基因在2齡幼蟲中的表達量最高，其表達量由高到低依次為：2齡＞3齡幼蟲＞1齡幼蟲＞雄蟲＞蛹＞雌蟲＞卵（圖4）。

圖4 MDCII基因在家蠅生活史不同發(fā)育階段的表達差異

2.3.2 不同組織部位的表達模式分析 在家蠅3齡幼蟲的各主要組織中，以體壁作為參照，MDCII基因在唾液腺和脂肪體中的表達量較高，其表達量由高到低依次為：唾液腺＞脂肪體＞馬氏管＞中腸＞氣管＞體壁（圖5）。

2.4 MDCII基因在不同微生物誘導后3齡幼蟲體內

的表達差異

3齡幼蟲經白色念珠菌誘導后，MDCII基因在誘導3 h后出現了明顯的表達上調，6 h出現下調，但與基礎免疫狀態(tài)相比仍處于較穩(wěn)定的高水平狀態(tài)，到達24 h后，表達開始下調，直至36 h以后，接近基礎免疫狀態(tài)（圖6）。經金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌誘導后，MDCII基因在誘導后的各個時間點亦出現明顯的上調，其在誘導后3 h上調最為明顯（圖7、圖8）。

圖5 MDCII基因在家蠅3齡幼蟲各組織部位的表達差異

圖6 MDCII經白色念珠菌誘導后家蠅3齡幼蟲中的表達差異

圖7 MDCII經金黃色葡萄球菌誘導后家蠅3齡幼蟲中的表達差異

圖8 MDCII經大腸埃希菌誘導后家蠅3齡幼蟲中的表達

3 討論

幾丁質酶是幾丁質降解酶家族的關鍵酶。Arakane等［18］根據各種昆蟲幾丁質酶的氨基酸序列的同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析，將幾丁質酶和幾丁質酶類似蛋白分為Ⅰ-Ⅷ型，隨后通過RNAi技術和RT-PCR對這些基因的功能和表達特異性進行了研究［19］，證明了不同類型的幾丁質酶及其類似蛋白在昆蟲的不同生長發(fā)育階段和不同組織中的作用具有很大的差異性。昆蟲體內通常有多種幾丁質酶共同存在，發(fā)揮不同的功能［20］。

本研究從家蠅3齡幼蟲cDNA文庫中篩選出MDCII基因，構建了原核重組質粒，并初步探討了該基因在家蠅發(fā)育和免疫防御過程中的可能作用。在克隆過程中所選用的是pESAY-E1表達載體，帶有T7啟動子和Lac，組氨酸標簽，因其在與目的片段相連處有突出的胸腺嘧啶（T）與PCR產物中自帶的腺嘌呤（A）相連，故可省略傳統(tǒng)表達載體構建過程中載體及PCR純化產物雙酶切的步驟。但采用的連接方式可能會導致目的片段與載體啟動子閱讀方向反向連接情況出現，因此，在進行PCR鑒定時需要用目的片段前的T7啟動子上游引物和目的基因的下游引物、目的基因的上游引物和目的基因后的T7啟動子下游引物，以及T7啟動子的上下游引物同時進行PCR鑒定。

通過實時熒光定量PCR技術，對目的基因時空表達模式進行研究，探尋該基因在家蠅發(fā)育及免疫防御過程中的潛在功能。結果發(fā)現，MDCII基因在家蠅各發(fā)育時期都有不同程度的表達，其中在家蠅幼蟲2齡期和3齡期中的表達量最高，而到達蛹期表達量下降，提示MDCII參與了家蠅的生長發(fā)育。MDCII在3齡幼蟲組織中都有較為穩(wěn)定的表達，其中在唾液腺和脂肪體的表達量較高。

進化分析顯示，MDCII與果蠅成蟲盤生長因子（IDGFs）的同源性較高。IDGFs歸屬于幾丁質酶V型，現有的研究表明其在昆蟲的生長發(fā)育過程中起到不可或缺的作用。果蠅IDGFs在脂肪體中高表達，本研究結果亦顯示MDCII在脂肪體中表達量較高，提示家蠅和果蠅的IDGFs在組織表達特性上有相似之處。有研究顯示，除了參與細胞的增值和分化外，IDGFs還具有免疫功能，有學者在對岡比亞按蚊IDGFs進行研究時發(fā)現，這類蛋白在金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌誘導后出現明顯上調，其原因主要因為這類蛋白可能作用于細菌細胞壁的肽聚糖結構，使細菌的細胞壁結構發(fā)生改變，激活相應的免疫應答，抵制細菌［21］。舌蠅的成蟲盤生長因子可以抵制含幾丁質的微生物（如真菌）的侵染，但具體作用機制尚未研究清楚［22］。家蠅MDCII基因在白色念珠菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌誘導后均出現明顯的表達上調，推測家蠅MDCII基因也參與了家蠅對病原微生物的免疫防御過程，在機體的抗菌過程中亦發(fā)揮一定的作用。

4 結論

本研究成功構建pEASY-E1-MDCII重組表達質粒，通過生物信息學分析，構建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現MDCII基因屬于成蟲盤生長因子，采用實時熒光定量PCR方法，初步研究了MDCII基因參與了家蠅的生長發(fā)育，在免疫防御過程中也發(fā)揮了一定作用。

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（責任編輯 狄艷紅）

Construction of the Recombinant Expression Plasmid and Expression Pattern of Chitinase Gene MDCII from Musca domestica

YANG Yu-jin1GUO Guo1WU Qin-yi2LI Yan1FU Ping1ZHANG Yong1
（1. Guizhou Medical University，Guiyang 550004；2. Cancer Molecular Diagnostics & Immunotherapy Center，the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University，Guiyang 550004）

The aims of this study are to isolate the chitinase gene MDCII from Musca domestica EST sequencing database，to clone the gene and analyze its molecular characteristic，and to explore the temporal-spatial expression patterns of the gene in different tissues and different developmental stages as well as after induced by different microorganism. Firstly，EST sequencing technology was employed to screen the chitinase gene MDCII from the constructed cDNA plasmid library of M. domestica larvae，the bioinformatics method to analyze the gene sequence and physicochemical properties of the encoded protein，and the neighbor joining to build phylogenetic tree. Then，the target gene amplified by PCR then was constructed into the recombinant plasmid pEASY-E1-MDCII，the recombinant plasmid was transformed in clonal cell Trans1-T1，and the real-time PCR technology was to detect the expression difference of the MDCII gene in different developmental stages and different tissues. Finally，injection method was used to induce different microorganisms into the 3 instar larvae of M. domestica，and realtime PCR to detect the changes of expression level in different time points after inducing. The results indicated that the ORF length of the MDCII gene was 1 374 bp，encoding 457 amino acids，and the molecular weight 51.6 kD. The alignment analysis of the phylogenetic tree revealed that the genetic distance of MDCII was close to the adult growth factor of Drosophila. The recombinant plasmid pEASY-E1-MDCII with correctgene sequence was successfully constructed. The MDCII gene expressed in different developmental stages of M. domestica at different expression levels，and the highest in salivary glands and fat body of 3 instar larva. The MDCII gene presented up-regulated expression at 3 h after induction of Candida albicans，Staphylococcus aureus，and Escherichia coli. In conclusion，the MDCII gene is the adult growth factor in chitinase，participating in growth and development of M. domestica，and also playing a certain role in immune defense process.

Musca domestica；chitinase；clone；expression pattern

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.015

2016-11-07

國家自然科學基金項目（81560337，81160204）

楊尉錦，女，碩士研究生，研究方向：昆蟲分子免疫；E-mail：879123782@qq.com

國果，女，博士，研究方向：昆蟲分子免疫；E-mail：guoguojsc@163.com