結縷草轉錄因子基因ZjDREB4.1克隆和逆境表達模式

李京 吳奇 張琳婕 李旭婷 周敏琪 韋善君

（中央民族大學生命與環境科學學院，北京 100081）

結縷草轉錄因子基因ZjDREB4.1克隆和逆境表達模式

李京 吳奇 張琳婕 李旭婷 周敏琪 韋善君

（中央民族大學生命與環境科學學院，北京 100081）

以日本結縷草（Zoysia japonica）‘Meyer’品種為材料，克隆獲得了1個DREB（dehydration responsive element binding）類轉錄因子基因，命名為ZjDREB4.1。該基因編碼區長651 bp，編碼216個氨基酸，推測的蛋白質ZjDREB4.1分子量為22.9 kD，等電點pI為5.74，第50-110位氨基酸組成一個典型的AP2 保守結構域。在基因的系統發生樹中，ZjDREB4.1蛋白與擬南芥AtTINY蛋白和玉米ZmDBF2蛋白聚為一支，屬于DREB亞家族A-4組。在葉組織中ZjDREB4.1為組成型表達，受低溫誘導上調表達，在干旱和高鹽脅迫下表達先下調后恢復至正常水平。

轉錄因子；DREB；半定量RT-PCR；非生物脅迫

草坪草作為地被綠化植物，在改善生態環境、美化生活中起著重要的作用［1，2］。結縷草屬（Zoysia Willd.）是一類在全球范圍內廣泛種植的暖季型草坪草，系禾本科結縷草屬植物，它具有發達的匍匐莖和根狀莖，葉片厚硬且近革質，建成的草坪具有彈性好、耐修剪、耐踐踏、耐鹽堿、抗高溫和抗干旱等優良特性［3］，因而被廣泛地用于城市綠地、運動場草坪、機場草坪、水土保持、護坡護堤等諸多方面。該屬植物包括11個種和部分變種、變型，主要分布在太平洋沿岸的東亞、東南亞和澳洲地區。我國是結縷草種質資源大國，分布有5個種，即日本結縷草（Zoysia japonica Steud.）、細葉結縷草（Zoysia tenuifolia Willd.ex Trin.）、大穗結縷草（Zoysia macrostachya Franch.et Sav.）、中華結縷草（Zoysiasinica Hance）和溝葉結縷草（Zoysia matrella（L.）Merr.）［3］。山東省膠州灣和遼寧省的遼東半島是我國結縷草天然種質資源的主要分布地，也是我國結縷草種子生產的重要基地。長期以來，開發結縷草種質資源、培育優良新品種，一直是我國草坪草育種的重點內容之一。

自然條件下，干旱、低溫和高鹽堿等非生物逆境是影響草坪建植和養護的重要因素［4］。研究逆境脅迫響應的分子機制，培育抗逆性強的品種，一直是結縷草育種研究中的重要內容。對擬南芥、水稻以及其他多種植物的研究結果表明，植物感受逆境信號后調節多個基因的表達［5］，從而進行一系列生理生化調節以應對逆境［6］。根據功能，逆境應答基因可分為兩大類：一類是編碼功能蛋白基因，包括一些滲透調節物合成基因、抗氧化酶基因和抗脫水蛋白基因等，主要起保護細胞免受脅迫損傷的作用；另一類是調節基因，包括轉錄因子、激酶基因等，它們參與應激信號轉導和調節功能基因的表達［7］。轉錄因子由于調節多個功能基因的表達，在逆境響應中起重要作用。已報道的植物逆境響應轉錄因子包括AP2/EREBP類［8］、bZIP類［9］、MYB類［10］、WRKY 類［11］和NAC類［12］。其中，屬于AP2/EREBP類 的 DREB（dehydration responsive element binding）亞家族基因研究得最深入，它們參與抵抗干旱、低溫和高鹽脅迫應答。DREB亞家族轉錄因子均含有1個由57-70個左右氨基酸殘基組成的保守的AP2/EREBP結構域，分為A-1-A-6六個亞組［13］。DREB1和DREB2，即A-1和A-2亞組，與逆境響應關系最密切，在林木［14］、果樹［15］、禾谷類作物［16］、觀賞植物［17］、草坪草［18］等種類中均有研究報道。除此以外，DREB A-4亞組的一些基因，包括擬南芥中的TINY1［19］和 TINY2［20］、棉花中的GhDBP3基因［21］、玉米中的ZmDBF2基因［22］和大豆中的GmTINY1基因［23］，它們的表達受低溫脅迫、干旱脅迫和植物激素ABA、乙烯等不同程度的誘導。超表達TINY的擬南芥突變體表現出了植株矮小、葉厚、胚軸縮短、雌蕊和花絲縮短、花藥位置低于柱頭等性狀［24］。轉化了川桑（Morus notabilis）MnDREB4A基因的煙草葉片保水能力更強，衰老速度減慢，植株抗低溫、高鹽和干旱的能力也有所增強［25］。這些研究結果說明DREB亞家族A-4亞組成員也參與植物的逆境應答，具有抗逆功能。已有的研究結果為結縷草逆境響應分子調節研究提供了方向。

日本結縷草‘Meyer’轉錄組測序結果顯示，結縷草有多個DREB轉錄因子基因，但是它們在抵抗逆境中的作用尚未有系統的研究［26］，目前僅有一個DREB1［27］和兩個DREB2［28，29］基因序列和功能報道。根據結縷草‘Meyer’轉錄組的注釋信息，其中有一個拼接序列可能是DREB4基因。本研究在該序列推測閱讀框兩端設計引物，克隆獲得結縷草第一個DREB4基因，命名為ZjDREB4.1。利用生物信息學軟件分析該基因的生物信息學特征，采用半定量RT-PCR技術檢測低溫、干旱和高鹽脅迫下葉組織中ZjDREB4.1的表達狀況，構建ZjDREB4.1的植物表達載體，為后續研究其功能提供理論參考和研究材料。

1 材料與方法

1.1 材料

日本結縷草（Zoysia japonica Steud.）品種‘Meyer’ 由中國科學院南京植物所劉建秀研究員惠贈。材料種植于培養室中，栽培基質為珍珠巖∶蛭石∶營養土按1∶1∶2比例的混合物，培養溫度25℃/20℃（L/D），光周期14 h/d，正常管理。選取生長狀態相近的材料，分別進行逆境處理。低溫處理是將材料轉移到低溫生長箱中，培養溫度6℃/4℃（L/D），光強6 000 lux。分別用含有20% PEG-6000和300 mmol/L NaCl的營養液澆灌根部模擬干旱和高鹽脅迫。逆境處理時間梯度為2、12、24和72 h。以培養室內未處理材料為對照（0 h，CK）。取植株頂端第1-2片展開葉，液氮速凍后置于-80℃備用。

總RNA抽提試劑TRIpure Reagent、膠回收試劑盒、質粒小量制備試劑盒和pUM-T 載體均購自北京百泰克生物技術有限公司。M-MLV逆轉錄酶和T4 DNA連接酶均購自Promega公司。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 購自天根生化科技（北京）有限公司。DNA限制性內切酶購自Thermo 公司。實驗用引物（表1）合成及測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 cDNA合成及DNA提取 采用TRIpure Reagent 總RNA抽提試劑提取各樣品中的總RNA。RNA經電泳檢測完整性、Nanodrop測定濃度。以檢測合格的總RNA為模板，以Oligo dT 為引物，用反轉錄酶M-MLV反轉錄為cDNA，具體操作按照說明書進行。以 actin1 為內標基因，用 cDNA 特異性引物Pactin-F 和 Pactin-R（表1）對 cDNA 進行 PCR 擴增，檢測反轉錄效果。總DNA的提取采用CTAB法［30］。

1.2.2 基因的克隆 分別以4℃脅迫2 h的cDNA和基因組DNA為模板，用引物P4.1-F和P4.1-R（表1）擴增目的基因的編碼區序列，反應體系為（20 μL）：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，P4.1-F和P4.1-R各2 μL（10 μmol/L），cDNA或DNA模板1 μL，ddH2O 5 μL。反應程序為：95℃ 5 min；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 45 s，共32個循環；72℃ 7 min，4℃保存。擴增產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，并回收接近700 bp的特異性產物。將回收產物與T載體（pUMT）連接，產物轉化E.coli DH5α，進行藍白斑篩選。挑取白斑進行液體培養，取菌液進行PCR檢測。隨機挑取2個PCR陽性的菌液進行測序鑒定，確定克隆的基因序列完全正確。

表1 引物序列及用途

1.2.3 基因的生物信息學分析 采用生物信息學軟件對獲得的ZjDREB4.1序列進行相關分析，具體分析目標及選用的軟件見表2。

表2 ZjDREB4.1基因的生物信息學分析使用的相關軟件

1.2.4 基因的表達分析 采用半定量RT-PCR分析葉片中ZjDREB4.1在低溫、干旱以及高鹽3種脅迫下的表達動態。以cDNA為模板，先用Pactin-F和Pactin-R對內參基因actin1進行PCR擴增，反應體系為（20 μL）：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，Pactin-F和Pactin-R各2 μL（10 μmol/L），cDNA模板1 μL，ddH2O 5 μL。反應程序為：95℃ 5 min； 94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 45 s，共25個循環；72℃ 7 min，4℃保存。產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，確定條帶亮度基本一致時各處理的cDNA用量。然后以該用量的cDNA為模板，用ZjDREB4.1基因特異性引物P1和P2（表1），參照以上擴增體系進行34個循環的PCR擴增，產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，比較各處理條帶亮度。

2 結果

2.1 ZjDREB4.1基因全長的克隆

根據轉錄組測序信息，在預測的基因CDS兩端設計引物，分別以4℃低溫處理2 h的cDNA和基因組DNA為模板進行PCR擴增，結果（圖1）均獲得了大小在500-750 bp之間的特異帶。將該核酸片段克隆到T載體上，測序結果顯示，兩種模板擴增的核酸序列相同，且與轉錄組中的基因序列完全一致，說明該基因沒有內含子。

圖1 ZjDREB4.1基因擴增結果

2.2 ZjDREB4.1基因序列分析

ZjDREB4.1基因CDS長651 bp，編碼一條由216個氨基酸殘基組成的多肽（圖2）。推測的平均蛋白質分子量為22.9 kD，理論pI為5.74。蛋白的分子式組成為C996H1556N290O319S7，其中丙氨酸（Ala）含量最高，為15.7%，其次為絲氨酸（Ser，12.0%）、脯氨酸（Pro，10.2%）和天冬酰胺（Asp，7.9%），酪氨酸（Tyr）含量最低，為0.9%。利用ExPASy分析該蛋白在酵母和大腸桿菌中的半衰期分別大于20和10 h，不穩定系數為47.80（40以上為穩定蛋白），推測為穩定蛋白。

在NCBI網站上對ZjDREB4.1蛋白進行保守結構域預測結果表明，在50-110位氨基酸之間含有一個典型的AP2結構域（conserved AP2 domain）。cNLS Mapper分析顯示，蛋白ZjDREB4.1有兩個核定位信號，分別位于第32-40和第66-80位氨基酸區間（圖2）；SignalP 3.0 Server軟件分析確定ZjDREB4.1不具有信號肽，推測ZjDREB4.1為核定位蛋白。NetPhos軟件分析顯示，ZjDREB4.1蛋白存在絲氨酸和蘇氨酸2個磷酸化位點，但這兩個位點的磷酸化數目不同，其中絲氨酸磷酸化位點20個，蘇氨酸磷酸化位點4個（圖2）。用ProtScale分析該序列的親/疏水性，結果表明，在多肽鏈第38位精氨酸（Arg）有最低分值-3.333，親水性最強；第132位賴氨酸（Lys）有最高分值2.422，疏水性最強。親水區域大于疏水區域，故該肽鏈表現為親水性。利用CFSSP預測ZjDREB4.1二級結構結果顯示，該蛋白的二級結構以α-螺旋和β-折疊片為主，其中α-螺旋含量達到64.8%，還含有一部分的β-轉角和無規則卷曲（圖3-A）。SWISS-MODEL server 在線模型預測顯示，ZjDREB4.1的第49-110位氨基酸與數據庫中的14個模型相匹配，其中與3gcc.1模型相似度最高（61.4%）。以3gcc.1為模板建立的ZjDREB4.1結構模型顯示，其結構域含有3個反向平行的β-sheet和一個與β-sheet幾乎平行的α-helix（圖3-B）。

2.3 ZjDREB4.1蛋白的同源性及系統發生樹分析

利 用NCBI上 的BLAST對ZjDREB4.1氨 基酸序列進行同源檢索，結果表明，該基因與已報道的多種植物的DREB類轉錄因子高度相似。將ZjDREB4.1與其6個直系同源基因的氨基酸序列進行比對，結果（圖4）表明，它們的AP2結構域具有高度保守性，而在C端和N端均有較大差異性。選取模式植物擬南芥DREB A-1-A-6基因和其他6種植物的部分DREB類轉錄因子基因，通過DNAMAN軟件對它們的氨基酸序列進行多序列比對和構建基因系統發生樹，結果（圖5）顯示ZjDREB4.1屬于DREB亞家族的A-4亞組，與水稻的OsDREB4.4遺傳距離最近。進化樹中A-4亞組的10個同源基因明顯地分為3個分支，水稻的4個基因分別歸屬到3個分支中。在第一個分支中含有單、雙子葉植物的同源基因，但兩類明顯地分開；ZjDREB4.1與水稻的OsDREB4.1/4.4、玉米的ZmDBF2和小麥的TmCBF7同屬第二分支；而水稻OsDREB4.2為一個單獨的分支。說明植物DREB類轉錄因子A-4亞組一些成員的出現可能在單、雙子葉植物分化之前。

圖2 ZjDREB4.1基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列

圖3 ZjDREB4.1蛋白二級結構和模型預測

2.4 ZjDREB4.1基因表達模式分析

以actin1為內參，采用半定量RT-PCR技術比較ZjDREB4.1在低溫、干旱和高鹽脅迫下的表達量變化。結果（圖6）表明，ZjDREB4.1在正常條件下有表達；在低溫脅迫2-72 h時間內上調表達，其中在2 h和72 h表達水平較高；在干旱和高鹽脅迫下，2-24 h時間內均下調表達，72 h后恢復至接近正常水平，說明ZjDREB4.1是結縷草葉組織的正常表達基因，受低溫脅迫誘導上調表達，在干旱和高鹽脅迫72 h后保持正常表達。

圖4 ZjDREB4.1與其他同源基因氨基酸序列比較

3 討論

DREB類轉錄因子與植物抵抗非生物脅迫關系密切，調控多個抗逆功能基因的表達，參與植物的抗逆活性調節［31，32］。結縷草是一種多耐逆的優質草坪草，研究其DREB基因結構、功能和表達模式可為該屬植物的抗逆機制提供分子參考。轉錄組測序結果顯示，日本結縷草中含有DREB轉錄因子A-1-A-6亞組多個基因，部分基因與低溫脅迫應答相關［26］。Wang等［28］從結縷草‘Meyer’中克隆獲得了首個DREB A-2亞組基因，過量表達該基因的擬南芥植株的抗寒能力明顯增強。可祥等［29］以結縷草‘膠東青’變種為材料，克隆獲得了第2個DREB A-2亞組基因ZjDREB2.2，其表達量受低溫和干旱誘導上調。馮勛偉和才宏偉［27］以日本最北部原產的結縷草品系為材料，克隆獲得了結縷草首個DREB A-1亞組基因ZjCBF，超表達該基因的擬南芥植株的抗寒性明顯高于野生型。本研究以結縷草‘Meyer’為實驗材料，克隆獲得該屬植物的首個DREB A-4亞組基因，命名為ZjDREB4.1。ZjDREB4.1基因編碼區全長651 bp，沒有內含子。已報道的川桑（Morus notabilis）［25］、毛果楊（Populus trichocarpa）［33］、水稻（Oryza sativa）［34］的DREB A-4組基因也沒有內含子。說明DREB轉錄因子亞家族中，A-4組與A-1基因的結構相似［35］，而與A-2類基因不同，后者通常含有一至多個內含子［28，36］。

圖5 ZjDREB4.1的系統發生樹

推測的ZjDREB4.1蛋白含有一個AP2結構域，其結構模型與擬南芥的AtERF1基因的AP2結構域的模型（3gcc.1）高度相似［37］。AtERF1屬于乙烯響應元件結合蛋白（Ethylene-responsive element binding proteins，EREBPs），這些蛋白的AP2結構域高度保守，可以結合以GCCGCC為核心的ERE元件（簡稱GCC-box）［38］。擬南芥的AtTINY、AtTINY2還可以結合以CCGAC為核心序列的DRE元件。對不同DREB基因的AP2結構域進行序列比對分析發現，結構域的第14位纈氨酸（V14）和第19位谷氨酸（E19）對識別和結合DRE順式元件至關重要［13］，而第15位的絲氨酸（S15）與識別ERE元件相關［19］。ZjDREB4.1 的AP2結構域具有V14、E19和S15的結構特征，其對ERE和DRE元件結合活性有待鑒定。

圖6 不同逆境脅迫下ZjDREB4.1的表達模式

已報道的DREB A-4組基因中，有一些基因的表達受非生物脅迫調節。擬南芥AtTINY基因在根和葉中的表達幾乎不受干旱、高鹽、低溫和ABA的誘導［19］，但是AtTINY2基因在正常生長條件下幾乎不表達，在低溫、干旱和高鹽脅迫下其表達量會上升［20］。水稻OsDREB4.1基因為組成型表達，OsDREB4.2和OsDREB4.3受干早和高鹽誘導，但不受低溫影響［34］。玉米ZmDBF2基因在低溫和高鹽脅迫下上調表達［22］。川桑MnDREB4A基因在葉中主要響應低溫脅迫，在12-24 h時達到峰值，然后降低［25］，而在根中對4種脅迫（高溫、低溫、高鹽、干旱）幾乎都有響應。本實驗結果顯示，結縷草葉組織中ZjDREB4.1為組成型表達，低溫逆境誘導其上調表達，在干旱和高鹽脅迫2-24 h時表達水平下降，72 h后恢復到正常水平。該逆境響應模式與已報道同源基因有差異，這也體現了不同植物同類基因在表達調節上有差異，這種差異可能與植物的抗逆特征相關。

4 結論

本研究報道了結縷草的DREB 類轉錄因子A-4組的一個基因ZjDREB4.1。該基因具有一個AP2結構域，與EREBP的AP2結構域的結構模型高度相似。葉組織中ZjDREB4.1為組成型表達，受低溫誘導上調表達，在干旱和高鹽脅迫72 h后保持正常表達。

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（責任編輯 馬鑫）

Cloning and Expression Profiles of a Transcription Factor Gene ZjDREB4.1 in Zoysia japonica Under Adversity

LI Jing WU Qi ZHANG Lin-jie LI Xu-ting ZHOU Min-qi WEI Shan-jun
（College of Life and Environmental Science，Minzu University of China，Beijing 100081）

A novel DREB（dehydration responsive element binding）transcription factor gene，designated as ZjDREB4.1，was isolated from cultivar ‘Meyer’ of Zoysia japonica. The open reading frame（ORF）of ZjDREB4.1 was 651 bp in length，encoding 216 amino acid residues. The putative protein ZjDREB4.1 was 22.9 kD in molecular weight and with a theoretical isoelectric point（pI）of 5.74. Amino acids from the 50thto the 110thwere predicted to build up a conserved AP2 domain. The phylogenetic tree analysis showed that ZjDREB4.1 was grouped with AtTINY of Arabidopsis thaliana and ZmDBF2 of maize，belonging to the A-4 group of DREB subfamily. ZjDREB4.1 was expressed constitutively in leaves. The expression was up-regulated under cold stress，and was first down-regulated then returned to normal level under drought and salt stresses.

transcription factor；DREB；semi-quantitative PCR；abiotic stress

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.012

2016-06-22

國家自然科學基金項目（31100507），國家大學生科學研究與創業行動計劃項目（GCCX2016110016）

李京，女，碩士研究生，研究方向：生物化學與分子生物學；E-mail：horsel@126.com

韋善君，女，博士，講師，研究方向：植物生理與分子生物學；E-mail：wei.s.j@163.com