聚維酮碘對中華絨鰲蟹蟹種急性毒性實驗和概率回歸分析

徐宇+楊鳶劼+葛家春+許志強+鄧燕飛

摘要：本實驗為掌握聚維酮碘對中華絨鰲蟹蟹種的半致死劑量（LD50）。通過預實驗，得到實驗劑量的上限劑量對數值（Xk）和下限劑量對數值（Xi），實驗組間距（d），再確定實驗組藥物濃度。實驗設1個對照組，7個實驗組藥物濃度分別為15.85，19.50，23.99，29.51， 36.31， 44.67和54.95 mg/L。每個實驗組放置雌、雄蟹蟹種各10只，平均體重（5.95±0.48） g。以一次性給藥方式，觀察和記錄24 h和48 h實驗蟹種的死亡情況。實驗數據采用SAS統計軟件中概率單位程序進行概率回歸分析。實驗結果顯示，7個實驗組聚維酮碘對中華絨鰲蟹蟹種24 h急性毒性試驗死亡率分別為0、0、0.15%、0.35%、0.85%、0.95%、100.0%、100.0%。直線回歸方程：Y=-16.104 1 +11.519 2 log（Dose）， R2=0.897 4（P>0.8）。24 h半致死劑量（LD50）為25004 86 mg/L，95%可置信區間23.313 96～26.806 31 mg/L。48 h對照組和實驗組實驗蟹種在24 h基礎上均無死亡。

關鍵詞：聚維酮碘；中華絨鰲蟹；蟹種；急性毒性；SAS

聚維酮碘（povidone-iodum，PVP-I）又稱碘伏、強力碘等。是以高分子聚合物聚乙烯吡咯烷酮（PVP）為載體與碘絡合而成的不定型絡合碘，具有很好的水溶性和穩定性。聚維酮碘以結合碘形式存在，只有少部分為游離碘，在溶劑中逐漸釋放游離碘，起到緩釋作用，具有極強的殺菌力和廣泛的殺菌譜[1-3]。聚維酮碘曾選用于美國阿波羅航天計劃太空實驗室消毒而聞名于世，被美國藥典、英國藥典、日本藥典、馬丁代爾藥典和《中華人民共和國藥典》載入，是國際公認的高效、廣譜、無毒的消毒殺菌產品。

中華絨鰲蟹（Eriocheir sinensis）為我國淡水養殖主要經濟動物，其生活周期有三個階段[4]。在海水中孵出經脫殼變態為大眼幼體，淡化后在淡水中變態生長為蟹種，最后養成為成蟹。各生長階段面臨著生理、生物和機械等不安全因素的影響。為獲得安全和便于操作的中華絨鰲蟹蟹種消毒藥物，實驗選擇聚維酮碘，通過對蟹種的急性毒性試驗，了解和掌握聚維酮碘對中華絨鰲蟹蟹種的半致死劑量（LD50）。旨在為中華絨鰲蟹養殖過程中的消毒和疾病預防提供依據和指導。

1料與方法

1.1實驗材料

實驗藥物聚乙烯吡咯烷酮絡合碘（C6H9I2NO），上海阿拉丁生化科技股份有限公司試劑級產品。中華絨鰲蟹取自江蘇省淡水水產研究所高淳河蟹養殖基地培育的長江雙年系F1代蟹種。實驗用水為曝氣自來水。玻璃水族箱大小為（90×30）cm。

1.2實驗方法

1.2.1急性毒性試驗實驗中華絨鰲蟹蟹種選擇無病癥、步足完整的健康個體。實驗室暫養7 d，投喂蛋白含量為32%，青島六和水產飼料有限公司生產的蟹種配合飼料。實驗前停食1 d，排空腸道，實驗期間不喂食。實驗水體體積0.29 m3，水深10 cm，pH值6.5～8.5，水溫19.3 ℃。24 h氣泵充氣，確保溶氧5.0 mg/L以上。實驗采用一次性給藥，觀察和記錄24 h和48 h實驗蟹種的死亡情況，以玻棒輕觸實驗蟹種不動即判斷為死亡。

實驗設1個對照組，7個藥物劑量組。每個實驗劑量組放置雌蟹蟹種和雄蟹蟹種各10只。預實驗設8個藥物劑量為0，8.0，16.0，20.0，250，32.0，64.0和128.0 mg/L。根據預實驗結果，確定實驗劑量的上限劑量對數值（Xk）和下限劑量對數值（Xi），依據實驗組間距公式d =（Xk-Xi）/（G-1），[d<0.155（0.08～0.10）]，計算實驗組藥物的對數劑量。

1.2.2實驗數據分析實驗數據采用SAS/STAT13.1統計軟件中概率單位程序（PROBIT Procedure）進行概率回歸分析[5]。概率單位程序選擇以藥物對數劑量[log10（Dose）]作為自變量，死亡概率單位為應變量，利用最大可能率估計法找出回歸模型的參數估計值，建立直線回歸方程模型：Y = b0 + b1×log10（DOSE）。模型的適合度和概率值的95%置信區間，分別由選項LACKFIT和INVERSRCL定界。最后根據模型估算的概率值與實際估算值進行比較，以PREDPPLOT圖表示兩者間的吻合程度。

設藥物分組標志為A，劑量為DOSE，各次試驗的死亡數為R，試驗動物數為N，計算藥物的半致死劑量（LD50）。

SAS程序：

DATA a；

Input a dose r n；

PROC PROBIT LOG10；

MODEL r/n=dose/LACKFIT INVERSECL；

BY A；

RUN。

2結果

2.1實驗藥物劑量的確定

實驗蟹種平均體重（4.56±0.53） g。24 h對照組死亡率為0。根據7個藥物劑量組24 h死亡率，選取16.0，20.0，25.0，29.0和55.0 mg/L為有效實驗藥物劑量（表1）。

2.2聚維酮碘對中華絨鰲蟹蟹種的急性毒性影響

實驗蟹種平均體重（5.95±0.48）g。24 h急性毒性試驗對照組和15.85 mg/L藥物劑量組死亡數為0。19.50、23.99、29.51和36.31 mg/L藥物劑量組死亡數分別為3、7、17和19只。4467 mg/L和54.95 mg/L藥物劑量組死亡數均為20只。由此得到，24 h聚維酮碘對中華絨鰲蟹蟹種死亡率分別為0、0.15%、0.35%、085%、0.95%、100.0%、100.0%。48 h對照組和實驗組實驗蟹種在24 h基礎上均無死亡。

3討論

聚乙烯吡咯烷酮本身沒有抗菌作用，與碘絡合后碘在表面活性劑中的緩慢釋放，不僅增加了碘的溶解度，同時提高了碘溶液的穿透能力，達到持久消毒殺菌作用。聚維酮碘是唯一被中國藥典收載的含碘消毒制劑，對大部分細菌，真菌和病毒均有不同的抑菌和殺菌作用[6，7]。根據《化學農藥環境安全評價試驗準則》（GB/T 31270.12-2014）中農藥對魚類等級劃分標準，聚維酮碘為低毒類藥物。《危險化學品魚類急性毒性分級試驗方法》（GB/T 21281-2007）中，聚維酮碘為急性毒性Ⅲ級。聚維酮碘性狀穩定，使用簡便，殺菌作用持久，刺激性低，不產生二次污染，無殘留毒性的特點，在水產經濟動物養殖中主要用于魚卵、苗種和疾病防治的殺菌消毒[8-12]。

急性毒性試驗是評價毒物最直接的方法。聚維酮碘對甲殼類養殖動物幼體的毒性研究中，郭永軍[13]、熊斌[14]和李飛[15]等分別對凡納濱對蝦仔蝦、南美白對蝦仔蝦和青蝦幼蝦進行了毒性研究報道。本次實驗主要針對中華絨鰲蟹蟹種進行了24 h急性毒性試驗，SAS/STAT13.1統計軟件分析實驗數據，得到直線回歸方程：Y=-16104 1 + 11.519 2 log10（Dose）， 24 h半致死劑量（LD50）值為25.00486 mg/L，95%可置信區間為23.313 96～26.806 31 mg/L。實驗結果低于與劉慶坤[16]對三疣梭子蟹大眼幼體和Ⅰ仔蟹24 h LD50 36.661 mg/L和35.467 mg/L，鹽度是否對聚維酮碘有效碘穩定性產生影響還待進一步進行實驗探討。

實驗統計學計算半致死劑量（LD50）的方法很多，如目測法、改良冠氏法、序貫法、概率單位-對數圖解法、加權直線回歸法（Bliss）法等[17]。Bliss法是毒理學研究中常用的數據分析方法，SAS軟件分析系統中可以調用PROBIT過程來實現Bliss法。

本次實驗數據采用國際公認的大型集成標準應用軟件SAS（statistical analysis system）軟件包編寫程序[17-18]。數據語言程序建立臨時數據集a，輸入順序為藥物劑量（does），死亡數（n），實驗動物數（r）。調用PROBIT過程，選擇LOG10為藥物劑量取常用對數。MODEL語句以LACKFIT要求對失似進行檢驗；INVERSECL求出用原始藥物劑量所表達的各種反應劑量。BY語句要求按分組劑量A分別計算。參數的估計通過概率單位（PROBIT Procedure）程序進行概率回歸分析，實驗數據與函數值間的似合度，以皮爾遜卡方檢驗（Pearson Chi-Square）和L.R卡方檢驗（L.R.Chi-Square） 2種方法對曲線失似進行檢驗分析。檢驗結果P值均大于0.05，似合優度檢驗結果支持PROBIT模型。

曲線似合檢驗采用概率單位法分析，以對數藥物劑量作為自變量，死亡概率為應變量，得到直線回歸方程。同時進行了參數的假設檢驗，得到直線回歸方程中截距（a），斜率（b）與對數半致死劑量（μ）、標準差（σ）間的關系。PREDPPLOT圖選項與ODS圖形觀察符合正態的公差分布，曲線的似合效果是滿意的。

運用SAS軟件進行實驗數據統計分析，大大簡化了繁鎖的運算，運算精密度高，使用者只需根據實驗數據更改程序的數據部分，結果更加可靠。

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