菌落總數(shù)測(cè)試片環(huán)氧乙烷滅菌法研究

王艷蕊，肖茜文，劉 爽，劉 桐，何 苗，任大勇，陳 萍

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2.吉林省安信食品技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司，吉林長(zhǎng)春 130012）

菌落總數(shù)測(cè)試片環(huán)氧乙烷滅菌法研究

王艷蕊1，肖茜文1，劉 爽1，劉 桐1，何 苗2，任大勇1，*陳 萍1

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2.吉林省安信食品技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司，吉林長(zhǎng)春 130012）

考察環(huán)氧乙烷滅菌中滅菌溫度、環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度、滅菌時(shí)間、相對(duì)濕度對(duì)菌落總數(shù)測(cè)試片的滅菌效果，得出最佳滅菌參數(shù)。通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化環(huán)氧乙烷滅菌工藝條件，采用生物檢測(cè)法和化學(xué)檢測(cè)法進(jìn)行滅菌效果評(píng)價(jià)，以比色分析法檢測(cè)菌落總數(shù)測(cè)試片中的環(huán)氧乙烷殘留。結(jié)果表明，環(huán)氧乙烷對(duì)菌落總數(shù)測(cè)試片的最佳滅菌條件為滅菌溫度55℃，環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度600 mg/L，相對(duì)濕度40%，滅菌時(shí)間3 h，解析時(shí)間12 h，環(huán)氧乙烷殘留量0.7 mg/kg；生物檢測(cè)和化學(xué)檢測(cè)合格；經(jīng)過(guò)細(xì)菌增殖培養(yǎng)，與國(guó)標(biāo)法培養(yǎng)結(jié)果符合率達(dá)到97%。由此可見(jiàn)，環(huán)氧乙烷能較好用于菌落總數(shù)測(cè)試片的滅菌，殘留量符合規(guī)定，對(duì)滅菌物品性能無(wú)影響。

環(huán)氧乙烷滅菌；菌落總數(shù)測(cè)試片；比色分析

0 引言

菌落總數(shù)用來(lái)判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量，反映食品在生產(chǎn)過(guò)程中是否符合衛(wèi)生要求，是食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[1]。菌落總數(shù)測(cè)試片法是一種將樣液直接接種于測(cè)試片上，在一定溫度下培養(yǎng)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)的新型檢測(cè)技術(shù)，由于其具有省時(shí)省力、操作簡(jiǎn)單、便于運(yùn)輸、成本低等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用[2]。在工業(yè)化生產(chǎn)中，開(kāi)展對(duì)菌落總數(shù)測(cè)試片的滅菌研究至關(guān)重要，環(huán)氧乙烷滅菌法作為一種可以在低溫下滅菌的方法，是菌落總數(shù)測(cè)試片滅菌的首選。

環(huán)氧乙烷，又名氯化乙烯或氧丙烷，在常溫常壓下是無(wú)色氣體，是一種廣譜、高效、穿透力強(qiáng)、對(duì)消毒物品損害較小的滅菌劑，被廣泛用于不耐熱、不耐濕制品的滅菌中[3]。環(huán)氧乙烷滅菌效果受多種因素影響，為達(dá)到最佳滅菌效果，需要有效進(jìn)行控制，以達(dá)到消毒滅菌的目的。試驗(yàn)從環(huán)氧乙烷滅菌溫度、相對(duì)濕度、環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度和滅菌時(shí)間等方面對(duì)菌落總數(shù)測(cè)試片滅菌效果的影響進(jìn)行研究，建立可用于菌落總數(shù)測(cè)試片的滅菌方法，從而達(dá)到對(duì)測(cè)試片滅菌效果好、成本低的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與方法

胰蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉等，北京蘭博利德商貿(mào)有限公司提供；甘露醇、吐溫-80、丙酮酸鈉等，上海生物工程有限公司提供；自制菌落總數(shù)測(cè)試片；環(huán)氧乙烷化學(xué)指示卡、枯草桿菌黑色變種芽孢菌（Bacillus subtilisvar.niger） ATCC9372生物指示劑，北京四環(huán)衛(wèi)生藥械有限公司提供。

環(huán)氧乙烷滅菌器，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)、DHP-781型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌落總數(shù)測(cè)試片的制備

菌落總數(shù)測(cè)試片的制備詳見(jiàn)陳萍等人[4]“一種菌落總數(shù)測(cè)試片、制備方法及其應(yīng)用”。

1.2.2 環(huán)氧乙烷滅菌法

將待滅菌的菌落總數(shù)測(cè)試片試驗(yàn)包置于環(huán)氧乙烷滅菌器內(nèi)，設(shè)置環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度600 mg/L，相對(duì)濕度55%，滅菌溫度55℃，滅菌3 h后，抽真空排除殘余環(huán)氧乙烷，使其進(jìn)入水中生成乙二醇排放，送入無(wú)菌空氣，完全排除環(huán)氧乙烷[5]。

1.2.3 菌量計(jì)數(shù)方法

菌量計(jì)數(shù)方法參照《消毒技術(shù)規(guī)范》 （2002）將枯草桿菌黑色變種芽孢菌片放置于玻璃管內(nèi)，將菌片打碎混勻，10倍梯度稀釋，選擇合適的稀釋水平接種于培養(yǎng)基上，于37℃條件下培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。

1.2.4 滅菌效果評(píng)價(jià)

（1）生物監(jiān)測(cè)法。生物檢測(cè)采用環(huán)氧乙烷生物檢測(cè)指示菌片（枯草桿菌黑色變種芽孢菌片）放于待滅菌包內(nèi)，滅菌完成后立即取出生物指示菌片，制備菌懸液，進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)；由活菌計(jì)數(shù)法得到枯草桿菌黑色變種芽孢的殘菌，以暴露時(shí)間為橫坐標(biāo)、枯草桿菌黑色變種芽孢殘菌對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，得到回歸方程，計(jì)算得D值。試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。D值是殺滅90%微生物所用的時(shí)間，等于線性曲線斜率的負(fù)倒數(shù)。

（2）化學(xué)檢測(cè)法。采用環(huán)氧乙烷指示卡作為化學(xué)檢測(cè)方法，將化學(xué)指示卡放在待滅菌包的中央，根據(jù)滅菌后化學(xué)指示卡的變色，判斷是否已達(dá)滅菌效果。環(huán)氧乙烷指示卡由玫紅色變?yōu)樯钭仙瑴缇耆?/p>

1.2.5 環(huán)氧乙烷各因素滅菌條件的優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)。以D值為衡量指標(biāo)，考察滅菌溫度、環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度、滅菌時(shí)間和相對(duì)濕度對(duì)環(huán)氧乙烷滅菌效果的影響。將標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)包放入環(huán)氧乙烷滅菌器內(nèi)，滅菌溫度分別為45，50，55，60，65℃；環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度分別為400，500，600，700， 800 mg/L；相對(duì)濕度分別為35%，45%，55%，65%，75%；滅菌時(shí)間分別為2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 h。

（2）正交試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以D值作為試驗(yàn)的衡量指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究滅菌溫度、環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度、滅菌時(shí)間和相對(duì)濕度4個(gè)因素對(duì)D值的影響，確定最優(yōu)滅菌參數(shù)。

正交因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.6 環(huán)氧乙烷殘留量的檢測(cè)

將已滅菌的菌落總數(shù)測(cè)試片在不同解析時(shí)間，參照李傳秋等人[6]采用的比色分析法對(duì)滅菌后的菌落總數(shù)測(cè)試片進(jìn)行取樣和處理，測(cè)得滅菌后菌落總數(shù)測(cè)試片的環(huán)氧乙烷殘留量。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 8368—87中規(guī)定，物品經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌解析后，其殘留量應(yīng)≤10 mg/kg。

1.2.7 環(huán)氧乙烷滅菌效果檢測(cè)

使用環(huán)氧乙烷進(jìn)行滅菌，檢查生物檢測(cè)和化學(xué)檢測(cè)指標(biāo)；在滅菌后的菌落總數(shù)測(cè)試片上接種一定濃度的混合菌懸液，計(jì)數(shù)紅色菌落作為檢測(cè)指標(biāo)，同時(shí)與國(guó)標(biāo)瓊脂平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行對(duì)照，檢測(cè)滅菌后環(huán)氧乙烷對(duì)菌落總數(shù)測(cè)試片細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS和ORIGIN 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)均采用單因素ANOVA方差分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌溫度對(duì)D值的影響

不同滅菌溫度下的D值見(jiàn)圖1。

圖1 不同滅菌溫度下的D值

由圖1可知，隨著滅菌溫度的升高，D值在45～55℃時(shí)下降速度快；在滅菌溫度大于55℃后，D值出現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)，說(shuō)明55℃以后隨著滅菌溫度的升高殺菌效果的增強(qiáng)幅度開(kāi)始減小。由此可得出，滅菌溫度為55℃左右較為適宜。

2.2 環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度對(duì)D值的影響

不同環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度下的D值見(jiàn)圖2。

圖2 不同環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度下的D值

由圖2可知，隨著環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度的升高，D值在400～600 mg/L時(shí)下降顯著，在600 mg/L后下降趨勢(shì)平緩，但沒(méi)有出現(xiàn)平臺(tái)期。由此可以得出，環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度為600 mg/L時(shí)較為適宜。

2.3 滅菌時(shí)間對(duì)D值的影響

不同滅菌時(shí)間下的D值見(jiàn)圖3。

圖3 不同滅菌時(shí)間下的D值

由圖3可知，隨著滅菌時(shí)間的增加D值顯著下降，滅菌時(shí)間大于3.0 h后，D值緩慢下降；繼續(xù)增加滅菌時(shí)間，D值幾乎不再變化。因此，選擇3.0 h為菌落總數(shù)測(cè)試片的最佳滅菌時(shí)間。

2.4 相對(duì)濕度對(duì)D值的影響

不同相對(duì)濕度下的D值見(jiàn)圖4。

圖4 不同相對(duì)濕度下的D值

由圖4可知，在相對(duì)濕度為30%～50%的范圍內(nèi)，D值緩慢下降；相對(duì)濕度為50%時(shí)，D值達(dá)到最小；在相對(duì)濕度為50%～70%的范圍內(nèi)，D值緩慢上升。因此，選擇相對(duì)濕度為50%時(shí)進(jìn)行環(huán)氧乙烷滅菌。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果及最佳組合的確定

正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析見(jiàn)表2。

D值越小說(shuō)明滅菌效果越好，極差越大表明該因素對(duì)D值的影響越大。從表2正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析表可知，環(huán)氧乙烷滅菌最優(yōu)組合為A2B2C1D2，即滅菌溫度55℃，環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度600 mg/L，相對(duì)濕度40%，滅菌時(shí)間3 h，此時(shí)滅菌效果最好。因此，影響滅菌效果因素的主次順序是滅菌溫度＞環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度＞相對(duì)濕度＞滅菌時(shí)間。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析

2.6 滅菌后環(huán)氧乙烷殘留量檢測(cè)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著解析時(shí)間的增加，環(huán)氧乙烷殘留量逐漸減少，解析12 h后，殘留量0.7 mg/kg，符合滅菌后環(huán)氧乙烷殘留量應(yīng)小于10 mg/kg的規(guī)定。

菌落總數(shù)測(cè)試片環(huán)氧乙烷殘留量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 菌落總數(shù)測(cè)試片環(huán)氧乙烷殘留量檢測(cè)結(jié)果

2.7 環(huán)氧乙烷滅菌效果檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)過(guò)環(huán)氧乙烷滅菌后，環(huán)氧乙烷化學(xué)指示卡均由玫紅色變?yōu)樯钭仙瑴缇耆蝗〕鼍m宜條件下培養(yǎng)，生物指示物培養(yǎng)結(jié)果均呈現(xiàn)陰性，滅菌合格。

與國(guó)標(biāo)瓊脂平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行比較，符合率達(dá)到97%，說(shuō)明環(huán)氧乙烷滅菌后對(duì)菌落總數(shù)測(cè)試片細(xì)菌生長(zhǎng)沒(méi)有影響，滅菌解析后可以安全使用。

菌落總數(shù)測(cè)試片和國(guó)標(biāo)法的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 菌落總數(shù)測(cè)試片和國(guó)標(biāo)法的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

3 討論

環(huán)氧乙烷滅菌法是一種滅菌可靠、使用安全的低溫條件滅菌法。滅菌后，對(duì)菌落總數(shù)測(cè)試片損害較小，滅菌效果可靠。

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，不斷完善和改進(jìn)環(huán)氧乙烷對(duì)菌落總數(shù)測(cè)試片的滅菌條件，得出菌落總數(shù)測(cè)試片滅菌的最優(yōu)組合。同時(shí)由結(jié)果得出，滅菌溫度對(duì)環(huán)氧乙烷滅菌效果影響顯著，滅菌效果隨著滅菌溫度的提升不斷加強(qiáng)；其次是環(huán)氧乙烷濃度、相對(duì)濕度和滅菌時(shí)間，三者對(duì)滅菌效果的影響相對(duì)較小。采用比色分析法測(cè)定不同解析時(shí)間下環(huán)氧乙烷的殘留，解析12 h后菌落總數(shù)測(cè)試片上的殘留即可達(dá)到0.7 mg/kg，符合國(guó)標(biāo)中環(huán)氧乙烷殘留規(guī)定的限值要求；與國(guó)標(biāo)瓊脂平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行對(duì)比，細(xì)菌培養(yǎng)增殖結(jié)果符合率達(dá)到97%，說(shuō)明環(huán)氧乙烷滅菌后對(duì)菌落總數(shù)測(cè)試片細(xì)菌生長(zhǎng)沒(méi)有影響，滅菌解析后可以安全使用。

國(guó)外對(duì)環(huán)氧乙烷滅菌研究較為成熟，國(guó)內(nèi)卻很少關(guān)于環(huán)氧乙烷滅菌方面的深入研究，試驗(yàn)對(duì)菌落總數(shù)測(cè)試片滅菌方式進(jìn)行初步研究，為今后進(jìn)一步研究菌落總數(shù)測(cè)試片的滅菌方法提供理論依據(jù)，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

[1]王佳男，肖茜文，王艷蕊，等.食品微生物測(cè)試片研究進(jìn)展 [J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2016，7（2）：701-705.

[2]洪炳財(cái)，陳向標(biāo)，賴明河.食品中微生物快速檢測(cè)方法的研究進(jìn)展 [J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2013，19（6）：15-18.

[3]徐燕，孫巍，吳曉松.環(huán)氧乙烷滅菌技術(shù)應(yīng)用與發(fā)展[J].中國(guó)消毒學(xué)雜志，2013，30（2）：146-151.

[4]陳萍，王艷蕊，王佳男，等.一種菌落總數(shù)測(cè)試片、制備方法及其應(yīng)用：中國(guó)，201610195209.7[P].2016.

[5]馬偉，何靜芳，沈偉，等.臺(tái)式環(huán)氧乙烷滅菌器對(duì)醫(yī)療器械滅菌效果的試驗(yàn)觀察 [J].中國(guó)消毒學(xué)雜志，2013，30（1）：25-27.

[6]李傳秋，王磊，陳軍.環(huán)氧乙烷滅菌效果及殘留量的實(shí)驗(yàn)研究 [J].食品與藥品，2014，16（1）：41-43.◇

Study on the Ethylene Oxide Sterilization of Aerobic Bacteria Counting Test Piece

WANG Yanrui1，XIAO Qianwen1，LIU Shuang1，LIU Tong1，HE Miao2，REN Dayong1，*CHEN Ping1

（1.School of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun，Jilin 130118，China；2.Anxin Food Technology Services of Limited Liability Company in Jinlin Province，Changchun，Jilin 130012，China）

To obtained the optimal ethylene oxide sterilization parameter by comparing different sterilization effect of ethylene oxide with different temperature，concentration，sterilization time and relative humidity.Ethylene oxide sterilization process conditions are optimized by the orthogonal experiment，chemical and biological detection are used to evaluation the sterilization effect on the aerobic bacteria counting test piece，colorimetric analysis method in detecting the total number of colonies of ethylene oxide residues.The optimal sterilization condition is temperature 55℃，ethylene oxide concentration 600 mg/L，relative humidity 40%，sterilization time 3 h，after 12 h parsing，ethylene oxide residues is 0.7 mg/kg.The test of the biological and chemical are qualified；After bacterial multiplication culture，compared with national standard method the training results coincidence rate reaches 97%.Ethylene oxide sterilization can be better used to aerobic bacteria counting test piece sterilization，residues in accordance with regulations，and have no influence on performance of sterilization items.

ethylene oxide sterilization；aerobic bacteria counting test piece；colorimetric analysis

R181.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.01.008

1671-9646（2017）01a-0029-03

2016-11-25

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目（20150204018SF）。

王艷蕊（1989— ），女，碩士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。

*通訊作者：陳 萍（1968— ），女，博士，教授，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。