基于分子對接技術虛擬篩選菊苣與腸道CNT2結合的化學成分研究

周月+張冰+林志健+張曉朦+李凡+王海鴿+王雪潔

[摘要]利用分子對接技術虛擬篩選菊苣與腸道濃度型核苷轉運蛋白2（CNT2）結合的化學成分，為探討菊苣干預嘌呤核苷吸收的降尿酸作用機制研究提供理論依據。采用同源建模手段構建人CNT2三維結構模型，采用Vina軟件虛擬篩選菊苣小分子化合物作用于CNT2的化學成分。以CNT2抑制劑7，8，3′-三羥基黃酮的打分為閾值，篩選出23個打分高于陽性抑制劑的菊苣化學成分。其中打分靠前的菊苣化合物是菊苣降尿酸作用的重要化合物，其能否通過抑制CNT2活性干預腸道嘌呤核苷的吸收降低體內尿酸水平有待生物學實驗進一步探討。CNT2可能是菊苣降尿酸的效用靶點，為指導實驗研究菊苣干預嘌呤核苷吸收降尿酸研究提供向導。

[關鍵詞]同源建模； 富集型核苷轉運蛋白2； 菊苣； 虛擬篩選； 高尿酸血癥

[Abstract]To virtual screen the compound of Chicory combined with the concentrative nucleoside transporter 2 （CNT2） in molecular docking technology.The homology model of hCNT2 was produced， and then the Vina software was employed to virtual screen the Chicory compound combined with CNT2. Compared with 7，8，3′-trihydroxyflavone， a CNT2 inhibitors， 23 score higher chicory compounds were hit.Meanwhile， the ten top compounds have been revealed that play important role in decrease the uric level. The bioactivity to CNT2 needs to be investigatedin experiment. CNT2 may be a potential target of chicory， which decreases the absorption of purine nucleoside in intestinal tract.

[Key words]homology modeling； CNT2； Chicory； virtual screening； hyperuricemia

doi：10.4268/cjcmm20162113

腸道是嘌呤核苷吸收轉運的重要場所。濃度型核苷轉運蛋白2（concentrative nucleoside transporter 2，CNT2）是腸道攝入嘌呤核苷的核心轉運體，控制著尿酸生成的前體物質外源性嘌呤核苷的攝入，抑制腸道CNT2的轉運可降低體內血尿酸水平，可能成為藥物降尿酸的潛在作用靶點^[1]。目前，尚未獲得哺乳動物CNT2的蛋白晶體結構，已解析的霍亂弧菌CNTs蛋白晶體結構滿足人源CNT2蛋白同源建模的要求。因此，本研究以嘌呤核苷轉運蛋白為靶點，采用同源建模和分子對接技術虛擬篩選菊苣作用于嘌呤核苷轉運蛋白的小分子化合物，以期為指導開展實驗研究菊苣干預嘌呤核苷吸收的降尿酸作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 濃度型核苷轉運蛋白2的三維結構模型構建

1.1.1 hCNT2同源模型構建 以人源CNT2（hCNT2，NP_004203.2）在NCBI蛋白質數據庫中用PSI-BLAST在Protein Data Bank數據庫進行序列相似性搜索。同源模建使用Modeller 9.15程序和 EasyModeller 4.0圖形操作界面，由程序自動生成 5個模型，根據打分值選取molPDF值及DOPE Score均最低的模型作為目標蛋白。蛋白三維結構的顯示采用 Discovery Studio 3.5 Client程序。

1.1.2 分子力學優化 本研究使用GROMACS5.1程序包在Amber力場先進行3 000步最陡下降法（steepest descent）再進行1 000步共軛梯度法（conjugategradient）進行能量優化，以消除同源模建模型存在的一些不合理因素。最終模型切去第1～74和第584～658個氨基酸。

1.1.3 模型評價與驗證 模型評價主要采用SAVES在線工具的ProCheck考察模型立體化學質量。同時，使用Autodock 4.2分子對接軟件將10個實驗獲得的已知hCNT2抑制劑^[2]（8-腺嘌呤核苷衍生物，IC50 0.64～52 μmol·L^-1）與模型對接驗證模型的可靠性。參閱文獻，10個hCNT2抑制劑采用ChemDraw繪制，在MM2力場進行能量最小化，并保存為 PDB 格式備用。對接前設置小分子可扭轉鍵保持柔性，添加電荷并以 PDBQT 格式存儲。

1.2 菊苣小分子虛擬篩選

菊苣小分子配體來自課題組前期建立的菊苣小分子化合物庫，包括253個化學成分，主要涉及黃酮類、酚酸類、倍半萜類等成分^[3]。考慮到菊苣化合物結構類型，以文獻報道的黃酮類hCNT2抑制劑7，8，3′-三羥基黃酮作為陽性對照藥^[4]。從ZINC 數據庫中下載黃酮類hCNT2抑制劑（cas code），并利用ChemBio3D軟件進行MM2力場優化，保存成PDB格式備用，對接前設置小分子可扭轉鍵保持柔性，添加電荷最后以 PDBQT 格式存儲。使用Vina分子對接軟件進行虛擬篩選。

2 結果與分析

2.1 同源模型構建與評價

同源序列搜索比對結果顯示，hCNT2與霍亂弧菌的CNTs（vibrio cholera CNT，code：4PB1和3JTI）的一致性（identity）為37%，相似性（positives）為57%，空位百分數（Gaps）為5%，滿足同源建模和用于虛擬篩選及小分子配體對接的前提條件^[5]。以4PB1和3JTI為模板，利用Modeller進行多模板建模、Loop 優化，得到初級三維模型。再應用Gromacs進行能量最小化。由于hCNT2第1～74個和第585～658個氨基酸序列沒有一致性較高的模板，經跨膜區域預測顯示這2段氨基酸處于兩端，同時距離轉運蛋白結合底物位點較遠，切除以上2處氨基酸序列得到最終三維模型。Prochek程序得出的拉氏圖結果顯示97.8%的氨基酸落在最佳允許區（79.4%）和允許區（18.4%），1.7%的氨基酸落在一般允許區，僅0.4%的氨基酸落在不允許區，說明得到的hCNT2模型氨基酸二面角結構比較合理（氨基酸殘基骨架的二面角分布見圖1）。

2.2 同源模型驗證

在活性位點設置方面，嘌呤核苷結合位點主要位于第7和第8跨膜螺旋區。研究表明：將hCNT1轉運蛋白的第7和第8跨膜螺旋區上氨基酸殘基Ser319/Gln320和Ser353/Leu354定點突變成hCNT2相應位置的殘基（Gly313/Met314和Thr347/Val348）后將從嘧啶核苷轉運體變成嘌呤核苷轉運體^[6]。因此，Gly313， Met314， Thr347和Val348為底物識別的關鍵氨基酸。選擇分子對接活性位點和盒子大小時，將Gly313， Met314，Thr347和Val348，以及vcCNTs蛋白結合、轉運底物的重要功能氨基酸相對應的hCNT2序列上的Thr315， Glu316， Glu492， Phe536， Asn538和Ser541殘基含括在盒子^[7-8]。調整對接位點，最終Gird Box 中心坐標在x， y和z方向設置為216.866， 189.261 和 80.029，盒子大小為 40×50×50（每個格點距離為0.375 nm）。采用拉馬克遺傳算法進行構象搜索，初始種群數設置為 150，能量評定最大次數為250萬，每個分子配體都設定得到50個構象，其他參數選擇默認值，進行半柔性對接，評分函數為半經驗的自由能計算方法。將10個已知的hCNT2抑制劑與模建模型進行對接，結果顯示AutoDock給出的自由能大小排序與實驗測得的IC50較為一致，同時根據△G≈-RTln（IC50），將AutoDock的自由能打分函數與實驗測得抑制劑生物活性（-lgIC50）進行相關性分析，輔助說明同源模型識別底物的可靠性，結果顯示R²=0.91，表明模建模型質量可靠，分子對接參數設置合理，在一定程度上可區分活性不同的化合物，可用于菊苣化學成分的虛擬篩選研究。10個化合物結構見圖2，打分函數結果見表1。

2.3 菊苣化學成分虛擬篩選

最終篩選出21個得分高于陽性藥（7，8，3′-三羥基黃酮）的化合物，按照打分高低依次為3，4-二咖啡酰奎寧酸、1，3-二咖啡酰奎寧酸、4，5-二咖啡酰奎寧酸、3，5-二咖啡酰奎寧酸、1，4-二咖啡酰奎寧酸、菊苣苷-6-對羥基苯乙酰、菊苣酸、橙黃胡椒酰胺、菊苣萜苷K、山萵苣苦素、5，6，7，3′，4′，7′-7-O-β-D-glucopyranoside-heaxahyrosy-flavone、3′-羥基-4′-甲氧基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖基二氫黃酮、4-O-咖啡酰基奎寧酸、3，4β-dihydro-15-dehydrolactucopicrin、菊苣萜苷N、矢車菊素-3-葡萄糖苷、2，6-di[but-3（E）-en-z-only]naphthalene、11β，13-二氫山萵苣苦素、lactupicrin-15-al、epi-8α-angeloyloxy-cichoralexin、3-O-p-coumdroyl quinic acid。化合物詳細信息及其類別詳見表2。使用Pymol軟件及ligplot軟件分析觀察菊苣化合物與模建蛋白的對接結果，由于篇幅限制僅展示打分結果排名前9個化合物與模建蛋白hCNT2對接結果，見表3。

3 討論

腸道CNT2在嘌呤核苷吸收中發揮重要作用，抑制腸道CNT2活性可減少外源性嘌呤核苷的攝入而降低血尿酸水平。因此，CNT2是防治高尿酸血癥的藥物作用新靶點。本研究切入CNT2嘌呤核苷轉運蛋白，采用同源建模方法構建人CNT2的三維結構模型，采用分子對接軟件虛擬篩選了菊苣與CNT2相結合的化學成分，并分析了其與轉運蛋白的作用結合模式，從干預外源性嘌呤核苷攝入角度初步探討中藥菊苣降尿酸作用的潛在效用靶點。

在hCNT2靶蛋白結構建模方面，哺乳動物CNT2蛋白的晶體三維結構目前尚未解析出來，但是近年源于霍亂弧菌的CNTs轉運蛋白的X射線晶體結構已被解析出來^[7-8]。vcCNTs不但轉運機制與hCNT2相同，均是鈉離子梯度轉運，而且與hCNT2具有37%的一致性，尤其是在核苷結合位點與hCNT2具有73%的一致性。滿足同源建模序列一致性不低于30%的要求。因此，本研究利用vcCNTs晶體結構同源構建hCNT2靶蛋白結構，首次虛擬篩選菊苣結合hCNT2的化學成分。

在模型可靠性驗證方面，本文選擇活性已知的10個8-氨基腺苷衍生物與hCNT2模建模型進行分子對接，以間接說明hCNT2模建模型的可靠性。目前，選擇性hCNT2抑制劑相對較少，尚無成熟的藥物上市，主要為核苷類衍生物和黃酮類化合物。Masahiro等^[1]證實合成的核苷類衍生物KGO-2143和KGO-2173可抑制hCNT2活性，從而抑制飲食源性嘌呤引起的血尿酸水平的升高。Tatani等^[2]進一步合成hCNT2抑制劑腺苷衍生物，篩選出8-氨基腺苷衍生物對hCNT2具有較好的抑制作用，其中biphenyl-4-yl-8-aminoadenosine活性最好，其半數抑制濃度達（0.64±0.19）μmol·L^-1。本研究結果顯示hCNT2模建模型對活性不同的抑制劑化合物具有一定的識別作用，可以為菊苣化學成分的篩選提供可靠的靶蛋白結構。

在菊苣成分篩選結果方面，本研究從菊苣中篩選出了與CNT2結合且打分較高的9個酚酸類和8個倍半萜類化合物。菊苣主要含有酚酸類、倍半萜類和黃酮類化合物以及多糖類物質。其中，酚酸類成分主要為咖啡酸衍生物，如菊苣酸， 3，5-二咖啡酰奎寧酸，4，5-二咖啡酰奎寧酸和1，3-二咖啡酰奎寧酸等，是菊苣發揮降尿酸作用的重要化學成分。朱春勝等^[9]采用“譜效關系”手段研究了菊苣降尿酸藥效的物質基礎，表明色譜圖中峰 2（綠原酸）， 3， 5（菊苣酸）， 6， 7， 8與菊苣降尿酸作用密切相關。李英等^[10]研究了菊花中酚酸類和黃酮類成分對黃嘌呤氧化酶活性的抑制作用，顯示3，4-二咖啡酰奎寧酸甲酯、1，5-二咖啡酰奎寧酸、3，5-二咖啡酰奎寧酸、4，5-二咖啡酰奎寧酸等對黃嘌呤氧化酶活性具有較好的抑制作用。倍半萜類成分是菊苣中含量最高的一類化合物。實驗室前期采用分子對接技術研究菊苣小分子化學成分對黃嘌呤氧化酶的抑制作用，篩選出山萵苣苦素、山萵苣苦素乙酯和11β，13-二氫山萵苣苦素等24個倍半萜類化合物。同時，選擇山萵苣苦素開展的生物學實驗證實山萵苣苦素可以顯著降低高嘌呤飲食誘導的高尿酸血癥模型鵪鶉的血尿酸水平。但是，尚沒有菊苣相關化學成分與CNT2作用的實驗研究。因此，作者認為應進一步開展體外活性試驗驗證虛擬篩選出的菊苣化合物對CNT2活性的抑制作用。

4 結論

采用分子對接技術虛擬篩選與hCNT2結合的菊苣小分子化合物，最終得到23個打分較高的化合物，表明腸道嘌呤轉運蛋白可能是菊苣降尿酸的作用靶點。而且，打分靠前的菊苣化合物是菊苣發揮降尿酸作用的重要成分，需開展生物學實驗進一步驗證其對腸道CNT2轉運的抑制作用，為指導實驗研究菊苣干預嘌呤核苷吸收降低血尿酸的作用機制提供直觀的理論依據與導向。

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[責任編輯 丁廣治]