中草藥聯用對羅非魚無乳鏈球菌作用的研究

王德強，佟延南，李芳遠，劉宏偉，李忠琴

（1.海南省海洋與漁業科學院，海南海口570100；2.國家羅非魚產業技術體系海口綜合試驗站，海南海口 570100；3.集美大學水產學院廈門市漁用藥物工程技術研究中心，福建廈門 361021）

中草藥聯用對羅非魚無乳鏈球菌作用的研究

王德強1，2，佟延南1，2，李芳遠1，2，劉宏偉3，李忠琴3

（1.海南省海洋與漁業科學院，海南海口570100；2.國家羅非魚產業技術體系海口綜合試驗站，海南海口 570100；3.集美大學水產學院廈門市漁用藥物工程技術研究中心，福建廈門 361021）

本文利用BIOLOG自動微生物鑒定系統對所分離保存的羅非魚致病菌株進行生化鑒定，確定為無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae），進而測定虎杖、五倍子、地榆、黃連、大黃、白頭翁、黃芩等14種中草藥單用及聯用復方對該致病菌株的抑菌效果。結果表明，從14種中草藥中篩選出6種中草藥（中草藥A、中草藥B、中草藥C、中草藥D、中草藥E、中草藥F）對無乳鏈球菌有良好的抑制作用；隨后考察此6種中草藥組合成雙聯用、三聯用及四聯用復方的抑菌效果，其中雙聯用中的2種復方具有顯著協同作用，4種復方具有協同作用；三聯用中的8種復方具有顯著協同作用，3種復方具有協同作用；四連用中的1種復方具有顯著協同作用，1種復方具有協同作用。

羅非魚；無乳鏈球菌；中草藥；單用；聯用

羅非魚是海南省主要的淡水養殖品種，年養殖產量約35萬t，年出口創匯上億元。在目前高密度集約化生產過程中，羅非魚鏈球菌病時有發生，據調查發現羅非魚鏈球菌病的暴發可造成80%以上的病死率，經濟損失慘重[1]。疾病發生時，生產者難免不得不使用一些化學藥物進行防治，加之盲目的單用或混用，其結果不僅浪費成本，使疾病無法得到有效控制，而且造成了羅非魚生理代謝障礙，病情加劇以及藥物殘留，水環境污染，養殖生態中的正常菌群失調，耐藥性甚至多重耐藥性增強，給今后疾病的控制帶來更大的困難。

中草藥是一種天然環保型綠色藥物具有高效、毒不良反應少、安全性高、殘留少等諸多優點。目前用中草藥代替抗生素是水產病害防治的發展趨勢[2-4]，研究中草藥對致病菌的作用效果以指導合理用藥越發重要，因此推廣中草藥防治水產動物疾病，有著極其重要的意義[5]。已有研究表明，中草藥防治羅非魚鏈球菌病綠色環保[6]，且具有較好的抑菌和殺菌效果[7-8]。本文選取14種具有廣譜抗菌活性的中草藥，研究其單方和復方對無乳鏈球菌的體外抑制作用，以期為羅非魚鏈球菌病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中草藥采集《中華人民共和國藥典》具有抗菌、清熱解毒特性的虎杖、五倍子、地榆、黃連、大黃、白頭翁、黃芩、鉤藤、白茱萸、龍舌草、黃柏、苦參、使君子及檳榔14種中草藥用于試驗。

1.1.2 菌株1株羅非魚致病性無乳鏈球菌，由海南省海洋與漁業科學院淡水漁業研究所和珠江水產研究所從海南省羅非魚主產區患病的羅非魚腦部分離、鑒定并保存。

1.1.3 培養基酵母粉（廣東環凱微生物科技有限公司），腦心浸萃液態培養基（廣東環凱微生物科技有限公司）、瓊脂粉（廣東環凱微生物科技有限公司）、葡萄糖（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 方法

1.2.1生理生化鑒定運用BIOLOG自動微生物鑒定系統對所保存的羅非魚致病性無乳鏈球菌進行鑒定。

1.2.2 藥材預粉碎處理將所選的中藥用中藥粉碎機粉碎至100目左右，然后放入超微粉碎機進一步粉碎，收集超微藥粉備用。在掃描電子顯微鏡下觀察，90%以上的顆粒粒徑大小在5～10μm。

1.2.3 平板稀釋法采用瓊脂擴散法，在復合培養基添加中藥超微粉，以濃度1mg/mL開始進行兩倍稀釋，配置不同濃度梯度的藥敏培養基。將無乳鏈球菌接種至斜面，35℃培養24 h后，使用無菌水將其洗下，并調節菌液濃度調至107CFU/m L，取菌液2μL以涂布的方法接種在經過121℃20 min滅菌后的藥敏培養基平板上，每個藥物濃度梯度做三組平行。將接種好的平板放置35℃培養，分別記錄為該菌株的最低抑菌濃度（MIC）值，48 h后觀察藥板上菌落的生長情況最低殺菌濃度（MBC）值。

1.2.4 中草藥雙聯用抑菌試驗根據中藥單用的數據結果選出了6種中藥進行中藥雙聯用復方的篩選。

試驗組：以復合培養基為溶劑，用瓊脂稀釋法，采用棋盤交叉法，將參與雙聯用的兩種中藥的單用最低抑菌濃度1/16 MIC、1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC，兩兩混合配比制備雙聯用藥敏培養基。

對照組：聯用的兩種中藥的單用MIC的藥敏平板作為單用藥物的對照。

1.2.5 中草藥三聯用抑菌試驗根據雙聯用的基礎跟第三種中藥進行聯用。

試驗組：以復合培養基為溶劑，用瓊脂稀釋法，采用棋盤交叉法，將參與三聯用的三種中藥的單用最低抑菌濃度1/16MIC、1/8MIC、1/4MIC，先雙聯用，再與第三種中藥進行雙聯用的混合配比制備三聯用藥敏培養基。

對照組：聯用的三種中藥的單用MIC的藥敏平板作為單用藥物的對照。將細菌接種至斜面，35℃培養24 h后，使用無菌水將其洗下，并調節菌液濃度調至107CFU/mL，取菌液2μL接種在經過121℃20 min滅菌后的藥敏培養基平板上，每個藥物濃度梯度做三組平行。

1.2.6 中草藥四連用抑菌試驗根據三聯用的基礎跟第四種中藥進行聯用。

試驗組：以復合培養基為溶劑，用瓊脂稀釋法，采用棋盤交叉法，將參與四聯用的四種中藥的單用最低抑菌濃度1/32 MIC、1/16 MIC、1/8 MIC、1/4 MIC，先三聯用，再與第四種中藥進行雙聯用的混合配比制備中藥四聯用藥敏培養基。

對照組：聯用的四種中藥的單用MIC的藥敏平板作為單用藥物的對照。

1.2.7 聯用指數（FIC）計算

①FIC指數計算：

FIC指數=MIC甲藥聯合/MIC甲藥單用+ MIC乙藥聯合/MIC乙藥單用

②指數判讀方法：

FIC≤0.5為顯著協同作用，FIC＞0.5～1為協同作用，FIC=1為相加作用，FIC＞1～2為無關作用，FIC＞2拮抗作用。

2 結果

2.1 菌株的生理生化鑒定

利用BIOLOG自動微生物系統進行菌株鑒定，結果為Streptococcus agalactiae（gp B）。該菌株能利用葡萄糖、半乳糖、甘露糖、麥芽糖、果糖、海藻糖、蔗糖，不能分解乳糖、巖藻糖、鼠李糖、肌醇、山梨醇、D，L-絲氨酸、L-組氨酸、L-丙氨酸和L-精氨酸，明膠和檸檬酸等指標為陰性。

2.2 中草藥單用結果

14種中藥采用瓊脂擴散法，以濃度1mg/mL開始進行兩倍稀釋，根據MIC值和MBC值確定了6種單用抑制羅非魚無乳鏈球菌效果較好的中藥。

2.3 中藥雙聯用結果

6種中藥兩兩聯用，有15種組合，每個中藥組合，做了16種配方。六種中藥的雙聯用總共做了480個平板。實驗結果如表1所示：雙聯復方D1、D2顯著協同作用；雙聯復方C1、C2、D3、F1、F2為協同作用；雙聯復方B1為相加作用；雙聯復方A1、B2、B3、D4、F3、F4、F5為無關作用。

2.4 中藥三聯用結果

6種中藥三三聯用，有20種組合，每種中藥組合，做了64種配方。六種中藥的三聯用總共做了2560個平板。實驗結果如表2所示，三聯復方E1、E2、E3、E4、A1、A2、A3、A4顯著協同作用；三聯復方C1、E5、B1為協同作用；三聯復方A5為相加作用；三聯復方E6、E7、E8、B2、C2、C3、E9、A6為無關作用。

表1 15種中藥雙聯用藥敏試驗結果

表2 20種中藥三聯用藥敏試驗結果

2.5 中藥四聯用結果

6種中藥四聯用，有15種組合，每種中藥組合，做了256種配方。六種中藥的四聯用總共做了7680個平板。實驗結果如表3所示四聯復方E1顯著協同作用；四聯復方E2為協同作用；四聯復方E10為相加作用；四聯復方A1、A2、C1、A3、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9為無關作用。

表3 15種中藥四聯用藥敏試驗結果

3 討論

3.1 中藥單用體外抑菌效果分析

近年來，在水產養殖業中中草藥越來越多的被用于提高水產動物營養、防治疾病和提高機體免疫力等方面。特別是防病方面，因中草藥具有毒性低、毒不良反應小、不易產生抗藥性等特點，已成為替代抗生素類藥物的首選。藥理學研究表明，單味中藥在抑制魚源病原微生物上有獨特的功效，并且是水產養殖病害防治用藥的基礎，已有不少學者采用不同方法研究了中藥對水產動物病原菌的體外抑菌效果。本研究首先從虎杖、五倍子、地榆等14種中草藥中篩選出抑制作用較好的中草藥單方，結果表明有6種中草藥抑制效果較佳。研究結果與某些文獻報道結果一致，如張彬等[7]報道了金銀花、黃芩、大黃、連翹、黃柏對羅非魚海豚鏈球菌具有一定的抑菌作用。吳穎瑞等[8]報道了博落回、紫草、田基黃、補骨脂、三顆針、田七須、五倍子對無乳鏈球菌和海豚鏈球菌均表現出一定的抑菌活性。

3.2 中藥聯用體外抑菌效果分析

針對中藥聯用所產生的協同或拮抗作用，目前大多數學者認為是由于中藥的有效成分不同、抑菌機制不同造成。將兩種抑菌作用途徑或靶點不同的中藥聯用，就可以多位點、多途徑攻擊致病細菌的細胞，提高藥物的殺傷力。中藥聯用產生拮抗減效的原因可能是每種中藥發揮藥效的化學成分在聯用時，發生多種有效成分相互結合、吸附等物理作用，從而降低藥物的溶出、吸收，甚至發生化學反應，導致藥物失去原有的抑菌活性。

從中醫藥學角度來說，中藥講求的是藥物的組方配伍，通過合理的配伍可以增強原有的功用，如何明等[9]發現中藥復方制劑抑制作用優于單味中藥。因此，本研究分別研究了單用效果較好的6種中藥的雙聯用、三聯用和四連用復方，根據不同配伍選出了抑菌效果更佳的2種雙聯用復方、8種三聯用復方和1種四連用復方，可見，科學配伍不同的藥物組成復方制劑，能明顯的提高療效。

本試驗雖然篩選出了對羅非魚無乳鏈球菌有較好抑制作用的中草藥單方和復方，但中草藥有效成分的分析和能否開發為有實際應用價值的水產藥物仍需進一步深入研究。

[1]曾凡美.羅非魚鏈球菌病重在防治——“羅非魚鏈球菌病流行風險分析與對策研討會”廣州[J].海洋與漁業，2009（11）：16-17．

[2]何愛華，張曦，陶琳麗，等.6種中草藥對4種淡水魚致病菌體外抑菌作用的研究[J].南方水產科學，2011，7（2）：73-76. [3]童國忠，石亞素，馬劍茵，等.中草藥對海水養殖黃魚病原弧菌抑菌效果研究[J].水產科學，2007，26（8）：436-439.

[4]鄭天倫，王國良，金珊．網箱養殖大黃魚弧菌病的中草藥防治[J].水產科學，2005，24（2）：24-25.

[5]程志斌，葛長榮，韓建眾.中草藥有效成分對動物免疫系統功能的影響及其應用[J].動物科學與動物醫學，2002，19（1）：11-13.

[6]溫周瑞，裴家田，王文博，等.一種中草藥復方制劑對羅非魚非特異性免疫力的影響[J].大連水產學院學報，2009，24（2）：136-140．

[7]張彬，黃婷，陳福艷，等.10種中草藥及4種組方對羅非魚致病性海豚鏈球菌體外抑菌試驗[J].淡水漁業，2011，41（5）：35-39.

[8]吳穎瑞，龔慶芳，方宏，等.153種中草藥對羅非魚無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的抑制活性研究[J].西北農林科技大學學報.2013，41（1）：25-32.

[9]何明，張永跟.中藥抑菌作用研究現狀[J].北京中醫藥大學學報：中醫臨床版，2007，14（6）：44-46.

新疆巴里坤縣鹵水淡化試養對蝦首次獲得成功

2016年12月1日，記者在巴里坤縣海立德水產養殖專業合作社養殖基地看到，鹵水淡化后工廠化養殖南美白對蝦首次獲得成功，填補了哈密地區對蝦養殖的空白，令人興奮的是，地處內陸深處的巴里坤人在今年春節可以吃到當地產的海產品。

巴里坤海立德水產養殖專業合作社技術總監張建波介紹，11月12號投的這茬苗，從P5的苗到現在一共是19 d了，現在大的能有3 cm，小的也有2 cm，應該說試養成功了。

巴里坤海立德水產養殖專業合作社理事長盛軍先是江蘇省連云港市人，來哈密市創業工作已30多年，涉足過許多行業。當他看到近年來興起的工廠化海產品養殖項目紛紛獲得了良好的效益，而且了解到農業設施化、水產養殖工廠化是當今低碳、環保的國際大趨勢，盛軍先毅然決定在巴里坤縣投資創辦海產品養殖。巴里坤湖是咸水湖，盛產鹵蟲，鹵蟲是養殖對蝦最好的餌料。盛軍先提取了巴里坤湖的水樣，歷時一年多，先后在哈密市環保局、地質六大隊、中國水產科學研究院黃海水產研究所等地進行了全項目分析檢測，結果顯示湖水水質優良，水中的各種微量元素完全適合海產品養殖，而且不含重金屬。盛軍先邀請專家實地進行了考察，又在國內各水產品養殖基地進行了深入考察和市場分析，與中國水產科學研究院黃海水產研究所簽訂了合作協議，由黃海水產研究所提供技術支持，實施了“鹵水淡化海產品養殖西北示范基地”項目，開始嘗試海產品的養殖。

巴里坤海立德水產養殖專業合作社理事長盛軍先說，新疆的市場是很大的，而且養的是純的海鮮，這個海產品的口感和淡水養殖的水產品的口感那是不一樣的，所以他對這個市場很有信心。

2016年5月，盛軍先注冊成立了巴里坤海立德水產養殖專業合作社。在距離巴里坤湖1.3 km遠的海子沿鄉尖山子修建了2座1 000m2的養殖車間以及配套設施，完成投資300多萬元。11月12號，合作社放養了第一批南美白對蝦苗種。

巴里坤海立德水產養殖專業合作社理事長盛軍先說，今年這一批蝦看這個長勢，春節絕對可以豐富我們哈密人民的餐桌，長勢良好。

海立德水產養殖專業合作社計劃一期項目投資1 300萬元，除了養殖南美白對蝦，還計劃養殖多寶魚、梭子蟹等。

巴里坤海立德水產養殖專業合作社理事長盛軍先說，明年大概還要投資1 000萬，有3個池子，其中有一個大池子，中間搞一個觀光通道，讓客人來了從觀光通道可以很直觀的看到，就像那個水族館一樣，透明的，可以看到蝦、多寶魚、梭子蟹在水里頭游。

一期項目完工后，海立德水產養殖專業合作社對蝦、多寶魚、梭子蟹的年產量將預計達到100 t、50 t和30 t。在合作社發展的同時，盛軍先還打算帶動更多的當地農牧民一同致富，海產品養殖將成為巴里坤農牧民增收的一條新途徑。

巴里坤海立德水產養殖專業合作社理事長盛軍先說，我們這個項目也是個創新，會給我們合作社帶來很好的經濟效益，并且它將帶來更大的是社會效益，周圍環湖四個鄉鎮的農牧民跟著我們來做，就能夠實現增收致富。對愿意參加我們合作社的這些農牧民技術指導，或者讓他干脆入股這種方式，我們來帶著他走這條路。

（www.bbwfish.com）

Study on combination of Chinese herbalmedicin against tilapia streptococcus disease in vitro

Wang Deqiang，Tong Yannan，Li Fangyuan，Liu Hongwei，Li Zhongqin
（1.Hainan Academy of Ocean and fisheries Sciences，Haikou 570100，China；2.National tilapia indu s t r ial t ech nolo gy sys t em，H ai k ou S tatio，H ai k ou 570100，Ch ina；3.E n g in eer in g Tech nolo gy Rese a rch Ce nt re o f F i sheryme di c in e f o rX ia me n，X ia me n 361021，Ch ina）

The pathogenic strain isolated from tilapia was identified asStreptococcus agalactiaby BIOLOG system.Then fourteen kinds of Chinese herbalmedicines such asPolygonum cuspidatum，Rhus chinensisMill，Sanguisorba officinalis，Coptis chinensisFranch，Rheum officinaleBaill，Radix Pulsatillae Chinensis，Baical Skullcap Root were chosen for the bacteriostasis test.The results showed herbs A，herbs B，herbal C，herbal D，herbs E and herbal F had obvious inhibiting effect.Then we investigated antibacterial effect of this six kinds of Chinese herbal medicine in combination with a double-linked，triple-linked and quadruple-linked.Among them，there is 2 kinds of double-linked with having significant synergies and 4 kindswith having synergies;thereis 8 kinds of triple-linked with having significant synergies and 3 kindswith having synergies;there is 1 kind of quadruple-linked with having significant synergies and 1 kind with having synergies.

tilapia；Streptococcus agalactia；Chinese herbalmedicine；alone；combined with

Q176

：A

：1004-2091（2017）01-0047-05

10.3969/j.issn.1004-2091.2017.01.010

2016-03-14）

海南省海洋與漁業廳項目；福建省教育廳項目（JA15260）

王德強（1957-），高級工程師，主要從事海淡水漁業育種及養殖研究.E-mail：wangyq789@163.com

李忠琴，副教授.E-mail:zhqinli@jmu.edu.cn