慕薩萊思酒發酵過程中氨基甲酸乙酯含量的變化研究

剛虎軍，王偉華*，苑貝貝，田木星，王文靜，謝麗靜

（塔里木大學生命科學學院新疆生產建設兵團南疆特色農產品深加工重點實驗室，新疆阿拉爾843300）

慕薩萊思酒發酵過程中氨基甲酸乙酯含量的變化研究

剛虎軍，王偉華*，苑貝貝，田木星，王文靜，謝麗靜

（塔里木大學生命科學學院新疆生產建設兵團南疆特色農產品深加工重點實驗室，新疆阿拉爾843300）

氨基甲酸乙酯（EC）是發酵食品中存在的一種致癌物質，該研究以新疆阿瓦提慕薩萊思酒為研究對象，檢測發酵過程中不同階段EC含量、尿素含量、酒精體積分數，探究EC的形成與尿素、酒精含量的關系。結果顯示，發酵結束后EC含量為25.6 μg/L，尿素與酒精含量越高，EC生成速率越快，慕薩萊思酒中EC含量越高，溫度對EC的生成影響較大。

慕薩萊思酒；氨基甲酸乙酯；尿素；高效液相色譜法

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是葡萄酒等發酵食品中產生的一種副產物。在1943年NEULESHIP A等[1]證明EC具有致癌作用。1971年L FROTH G等[2]在發酵酒中及一些飲料中發現了EC。EC在機體內代謝過程中可轉化為N-羥基-氨基甲酸乙酯，此物質可以誘導銅離子調控的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）發生損傷[3-5]，引起基因突變導致組織癌變。尿素與乙醇可生成EC，一些文獻報道，發酵酒中EC的產生絕大部分來源于酵母菌降解精氨酸（Arg）的尿素循環途徑[6]和乳酸菌的精氨酸脫亞胺基酶途徑（arginine deiminase pathway，ADI）[7]。黃酒中的EC主要由尿素和乙醇反應生成，楊建剛等[8]對黃酒酵母發酵過程中尿素的產生變化規律做了研究，結果表明黃酒酵母在生長過程中會產生尿素并且排放到細胞外，在培養27 h后細胞內尿素質量濃度為6.04 mg/L，培養51 h后細胞外尿素質量濃度為38.64 mg/L。瓜氨酸與乙醇反應生成EC。發酵酒在酒精發酵完成后，一般都要進行蘋果酸-乳酸發酵（malolactic fermentation，MLF），蘋-乳發酵對酒的酸度、風味等有重要意義。高年發等[9]對2種葡萄酒釀造過程中EC的產生含量進行研究發現，2種葡萄酒在進行蘋果酸-乳酸發酵時都會產生新的EC。范春艷[10]研究赤霞珠葡萄酒發酵過程中EC變化規律時發現，酒精發酵期間（7 d）變化不明顯，但在蘋果酸-乳酸菌發酵期間（23～28 d）EC的增長速度明顯加快。影響EC生成的因素還有乙醇濃度、酵母菌、溫度等[11]。譚波濤等[12-13]對固相萃取EC法的不確定度進行了評價，結果顯示當EC測量結果為21 ng/mL時，不確定度為8.7%（k=2），此方法可用于發酵食品中EC含量的測定。HERBERT P等[14]最先報道了采用高效液相色譜-熒光分析法（highperformance liquidchromato-graphyfluorescence detector，HPLC-FLD）檢測酒精飲料中EC含量，實驗結果顯示，此法檢測限為4.2 μg/L，平均回收率為96%，平均相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為6.3%，能夠滿足飲料中EC限量檢測。宋利軍等[15]采用氣相色譜-質譜（gas chromatography mass spectrometer，GCMS）法調查60份江西省內生產的黃酒產品中氨基甲酸乙酯（EC）殘留量。酒樣添加ds-EC同位素內標，經硅藻土層析住吸附，乙醚洗脫，用GC-MS測定，內標法定量。結果表明，黃酒中EC的污染水平中EC的中位數為24.4 μg/kg，均值為35.0μg/kg，檢出率為70%。該法與國標GB5009.223—2014《食品中氨基甲酸乙酯的測定》中的方法基本相同。

本研究采用高效液相色譜配熒光檢測器法（HPLC-FLD）檢測慕薩萊思酒發酵過程中EC含量的變化，對企業了解食品安全風險，指導消費者合理膳食等有理論指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基甲酸乙酯標準品（純度＞99%）、9-羥基噸標準品（純度＞99%）：上海安普實驗科技股份有限公司；尿素標準品（純度＞99%）、二乙酰一肟、安替比林、正丙醇、無水乙醇、正己烷、乙酸乙酯、乙醚（均為分析純）、甲醇（色譜純）：阿拉丁試劑公司；冰乙酸（分析純）、濃鹽酸、濃硫酸（均為分析純）：盛威試劑責任有限公司；慕薩萊思酒樣：阿瓦提刀郎穆塞萊斯有限責任公司。

1.2 儀器與設備

LC-20AD高效液相色譜儀（配熒光檢測器）：日本島津公司；TU-1900雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；DG-12D型固相萃取裝置：上海喬楓儀器有限公司；TDL-5-A型離心機：上海安亭科學儀器廠；YGC型氮吹儀：江蘇天鄰儀器公司；BSA224S型電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 尿素含量的測定

尿素含量的測定采用比色法。

尿素標準曲線的制作：準確稱取尿素標準品0.01 g（精確到0.000 1 g），溶解定容到100 mL容量瓶中，加0.1 mL三氯甲烷配成質量濃度為0.1 mg/mL尿素儲備液。吸取儲備液配制成質量濃度為1.00 mg/L、2.00 mg/L、3.00 mg/L、4.00 mg/L、5.00 mg/L、6.00 mg/L的尿素標準溶液。吸取標準溶液和一個空白各20 mL于7個棕色具塞試管中，加入0.02 g/mL 1.00 mL二乙酰一肟溶液，混勻；再加0.002 g/mL 2.00 mL安替比林溶液，混勻。沸水浴中加熱50 min，冷卻2 min。在波長460 nm處測定其吸光度值。以尿素標準溶液質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制尿素標準曲線。

慕薩萊思酒樣品前處理方法：采用D301-G的大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂柱，用5%HCl溶液浸泡2 h，然后用超純水逐級稀釋至中性；接著用4%的NaOH溶液浸泡2 h，用超純水逐級稀釋至中性。取20 mL慕薩萊思酒樣品于柱子中，吸附平衡后，用10 mL蒸餾水沖洗柱子，再用5 mL 15%NaCl溶液再次沖洗離子交換樹脂柱。觀察（葡萄酒有顏色）洗脫液無顏色變化時停止洗脫，收集洗脫液備用。按照尿素標準曲線回歸方程計算慕薩萊思酒樣品中尿素含量。

1.3.2 比色法方法學評價

精密度：選擇在酒精發酵期26℃條件下發酵7 d的慕薩萊思酒樣品進行尿素的測定，重復檢測，計算結果相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），分析尿素檢測方法的精密度。

加標回收率：對蘋果酸-乳酸發酵30 d的慕薩萊思酒樣品添加高、中、低（6 mg/L、3 mg/L、1 mg/L）不同質量濃度的尿素標準溶液，計算加標回收率，平均加標回收率和相對標準偏差。

1.3.3 氨基甲酸乙酯（EC）含量的測定

氨基甲酸乙酯（EC）含量的測定采用高效液相色譜-熒光分析法。

氨基甲酸乙酯標準曲線的制作：準確稱取氨基甲酸乙酯標準品0.01 g（精確到0.000 1 g），用無水乙醇溶解，定容到10 mL，配成質量濃度為1 mg/mL的儲備液；吸取儲備液配制成10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L、80 μg/L、100 μg/L、200μg/L的氨基甲酸乙酯標準溶液。然后各取1mL0.02mol/L加入9-羥基噸溶液600 μL和1.5 mol/L鹽酸溶液100 μL，混勻，置于暗處衍生30 min后，用孔徑為0.22 μm的有機微孔濾膜過濾到進樣瓶中待檢。以氨基甲酸乙酯標準溶液質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，繪制氨基甲酸乙酯標準曲線。

高效液相色譜-熒光分析法條件：色譜柱為C18反向色譜柱（250 mm×4.6 mm）衍生化反應時間30 min，進樣量40 μL；流速0.8 mL/min；柱溫30℃；流動相：甲醇和水；激發波長為233 nm，發射波長為600 nm。

慕薩萊思酒樣品前處理方法：采用固相萃取法，主要操作步驟如下：對弗羅里硅藻土小柱進行活化，用50 mL二氯甲烷沖洗小柱，接著用25 mL甲醇再次沖洗小柱，最后用50 mL蒸餾水沖洗，保持硅藻土濕潤狀態下加慕薩萊思酒樣20 mL；樣液在柱中停留一段時間（30 min），用2× 20 mL正己烷淋洗小柱，棄去廢液。然后加入5×30 mL丙酮:二氯甲烷（1∶9,V/V）洗脫目標化合物，收集洗脫液。最后在30℃條件下用氮氣吹至快干后，以甲醇與水的混合液75∶25（V/V）定容至5 mL，取1 mL樣液加入0.02 mol/L的9-羥基噸溶液600 μL和1.5 mol/L鹽酸溶液100 μL，混勻，用0.45 μm有機濾膜過濾，備用。

慕薩萊思酒樣品中氨基甲酸乙酯含量的檢測：檢測方法同標準曲線方法，根據標準曲線氨基甲酸乙酯的保留時間計算樣品中對應的氨基甲酸乙酯的峰面積，按照氨基甲酸乙酯標準曲線回歸方程計算慕薩萊思酒樣品中氨基甲酸乙酯含量。

1.3.4 高效液相色譜-熒光分析法方法學評價

精密度：選擇在酒精發酵期26℃條件下發酵7 d的酒樣進行EC含量測定，多次重復檢測，計算結果的RSD，分析EC測定方法的精密度。

加標回收率：對蘋果酸-乳酸發酵30 d的酒樣通過添加高、中、低（60 μg/L、30 μg/L、15 μg/L）質量濃度的EC標品，重復3次，計算加標回收率、平均加標回收率和RSD。

1.3.5 酒精含量的檢測方法

參照GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法測定樣品中酒精含量。

2 結果與分析

2.1 EC含量測定結果

2.1.1 衍生時間優化結果

圖1 衍生20 min(A)，25 min(B)，30 min(C)及35 min(D)條件下檢測EC含量的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of EC contents under the condition of derivative time 20 min(A),25 min(B),30 min(C)and 35 min(D)

衍生時間分別在20min、25min、30 min和35 min條件下，對質量濃度為40 μg/L的EC標準液進行高效液相色譜-熒光分析法測定，結果（圖1）可知，在衍生20min和25min后，EC的峰面積比衍生30 min的小，但和35 min相比差距不大，說明30 min反應效果較好。故最終選擇30 min為最佳熒光反應時間。

2.1.2 EC含量測定

EC標準品的高效液相色譜圖見圖2。以氨基甲酸乙酯標準溶液質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，繪制氨基甲酸乙酯標準曲線，結果見圖3。

圖2 氨基甲酸乙酯標準品色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of ethyl carbamate standard

圖3 氨基甲酸乙酯標準曲線Fig.3 Standard curve of ethyl carbamate

由圖2可知，氨基甲酸乙酯在保留時間為24.5 min左右出峰，響應值較高，出完峰后基線有漂移。由圖3可知，氨基甲酸乙酯標準溶液在10～200 μg/L范圍內呈良好線性關系，標準曲線回歸方程為y=9471.9x+20 711，相關系數為R2為0.996 8，檢出限為10 μg/L。

2.1.3 EC檢測方法的方法學評價

表1 HPLC-FLD法測定精密度實驗結果Table 1 Results of precision experiments analysis by HPLC-FLD

檢測酒精發酵期第7天26℃條件下的EC，重復6次，測得EC含量，結果（表1）可知，EC含量測定結果相對標準偏差（RSD）為2.34%，表明該方法精密度滿足要求。

在慕薩萊思酒中添加高、中、低三個水平（60 μg/L、30 μg/L、15 μg/L）EC標準溶液，進行回收率實驗，重復3次。結果見表2。

表2 HPLC-FLD法測定回收率實驗結果Table 2 Results of recovery rate experiments analysis by HPLC-FLD

由表2可知，EC含量的加標測定值有明顯的加強，加標回收率為95.5%～98.2%，RSD為2.1%～3.3%，結果表明該法準確度良好。

2.1.4 EC含量測定結果

以酒精發酵7 d的酒樣為例，測定結果見圖4。慕薩萊思酒發酵過程中EC含量的檢測結果見圖5。

圖4 發酵7 d的酒樣EC含量的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of EC contents in wine sample of fermentation 7 d

由圖5可知，酒精發酵前期A到B階段EC含量幾乎為零；C階段開始產生EC，從C到E階段EC含量不斷上升，此階段酒精發酵中期釀酒酵母容易利用谷氨酸、谷氨酰氨、氨類化合物等，氮源減少，代謝產物尿素增加與乙醇發生化學反應生成EC；E到F階段EC含量有所減少，酒精發酵結束，酵母菌體自溶釋放大量代謝物質進入酒體；F到G階段進行蘋果酸-乳酸發酵產生新的EC；到G階段達到最大，隨后又開始下降，H到M階段EC含量基本不變，發酵基本結束。

圖5 發酵過程中氨基甲酸乙酯含量變化Fig.5 Changes of EC contents during fermentation

2.2 尿素測定結果

2.2.1 尿素的標準曲線

圖6 尿素標準曲線Fig.6 Standard curve of urea

采用分光光度法檢測尿素，以尿素標準溶液質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制尿素標準曲線，結果見圖6。由圖6可知，該方法在1～6 mg/L范圍內呈良好線性關系，尿素標準曲線回歸方程為y=0.233 4x+0.065 1，回歸系數R2=0.997 6。檢出限為1.00 mg/L。

2.2.2 尿素檢測方法的評價

在酒精發酵期第7天，26℃條件下檢測尿素，重復6次，結果見表3。由表3可知，尿素含量測定結果相對標準偏差（RSD）為4.10%，精密度滿足要求。

表3 比色法測定精密度實驗結果Table 3 Results of precision experiments analysis by colorimetry

在慕薩萊思酒中添加高、中、低三個水平（6 mg/L，3 mg/L，1 mg/L）的尿素標準溶液，重復3次，結果見表4。

表4 比色法測定回收率試驗結果Table 4 Results of recovery rate experiments analysis by colorimetry

2.2.3 尿素含量的測定結果

慕薩萊思酒樣品在熬煮及酒精發酵階段不同溫度（22℃、26℃、30℃、34℃）條件下，每隔一段時間進行檢測，結果見圖7A；在蘋果酸-乳酸發酵階段前、中、后期檢測尿素含量，結果見圖7B。

圖7 不同溫度下酒精發酵（A）及蘋果酸-乳酸發酵（B）過程中尿素含量Fig.7 Urea contents in the alcoholic fermentation(A)and malic acidlactic acid fermentation(B)process at different temperatures

由圖7A可知，從葡萄汁熬煮到酒精發酵開始這一階段來看，原汁中有一定量的尿素。而在酒精發酵過程中尿素含量呈上升趨勢，釀酒酵母利用含氮物質，產物有尿素生成，發酵5 d左右尿素含量達到最大值，當發酵溫度升高時酒中的尿素含量會有所升高。由圖7B可知，在蘋果酸-乳酸發酵過程中隨著發酵天數的增加各不同溫度下尿素含量有所增加，發酵22 d時達到最高，隨后又開始下降，趨于穩定。結合各因素在生產發酵過程中溫度控制在26～28℃效果最好。

2.3 酒精含量的測定結果

在22℃、26℃、30℃、34℃條件下慕薩萊思酒在酒精發酵階段，不同發酵時期產生的酒精含量，結果見圖8。

圖8 不同溫度下酒精發酵過程中酒精含量Fig.8 Alcohol contents in the alcoholic fermentation process at different temperatures

由圖8可知，在慕薩萊思熬煮階段不產生酒精；在酒精發酵階段酒精不斷增加，第9天以后酒精含量趨于穩定。這與EC變化規律類似，說明了慕薩萊思酒中EC含量的變化規律受到酒精含量的影響，而在蘋果酸-乳酸發酵過程中酒精含量趨于穩定。溫度升高，酒精發酵速度加快，酒精含量升高，說明了溫度對慕薩萊思酒EC也有影響。

2.4 尿素、酒精含量與EC生成關系

各階段酒精、尿素與EC生成的含量變化結果見圖9。

圖9 酒精及尿素含量與EC含量的關系Fig.9 Relationship between alcohol and urea contents and ECcontents

由圖9可知，在葡萄汁熬煮和酒精發酵24 h，尿素質量濃度在0.91～0.95 mg/L左右，EC基本沒有；EC的增加或下降與尿素和酒精含量的變化基本同步，推測慕薩萊思酒中EC的形成可能是尿素途徑，說明了尿素和乙醇反應會生成EC。

3 結論

在慕薩萊思酒熬煮及酒精發酵前期，沒有檢測到EC，隨后開始檢測到EC，并且在酒精發酵其間含量一直上升。在蘋果酸-乳酸發酵前期EC含量稍有回落，中期到后期產生新的EC含量又有上升，到后期EC含量為25.6μg/L趨于穩定。

在慕薩萊思酒熬煮到開始酒精發酵這一過程中，葡萄汁中含有1.4 mg/L的尿素。而且在熬煮過程中尿素含量有輕微下降，在酒精發酵過程中尿素含量不斷上漲，發酵7 d左右達到最高。在蘋果酸-乳酸發酵前期到中期尿素含量緩慢上漲，到后期有所下降，最終達到3.24 mg/L趨于穩定。

在慕薩萊思酒熬煮及酒精發酵前2 d沒有酒精產生，發酵第3天開始到酒精發酵結束酒精含量不斷上升，上升趨勢為先快后慢，最終酒精度為9%vol趨于穩定。

綜上所述酒精和尿素與EC的生成有密切的關系，EC的上升或下降與尿素和酒精含量的變化基本同步，可知慕薩萊思酒中EC的形成可能是尿素途徑所產生，即尿素和乙醇反應會生成EC。

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Change of ethyl carbamate content during Musalaisi wine fermentation

GANG Hujun,WANG Weihua*,YUAN Beibei,TIAN Muxing,WANG Wenjing,XIE Lijing(Xinjiang Production&Construction Corps Key Laboratory of Deep Processing of Agricultural Products in South Xinjiang, College of Life Science,Tarim University,Alar 843300,China)

Ethyl carbamate(EC)is a kind of carcinogenic substance in fermented foods.Using the Xinjiang Awati Musalaisi wine as the research object,the EC,urea and alcohol content at different fermentation stages were detected.The relationship of EC formation with urea and alcohol content was researched.The results showed that after the fermentation,the EC content was 25.6 μg/L.The higher the contents of urea and alcohol,the faster formation rate of EC was.The higher the EC content in Musalaisi wine,the greater effect of the temperature on the formation of EC was.

Musalaisi wine;ethyl carbamate;urea;HPLC

O657.7

0254-5071（2017）01-0151-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.032

2016-10-24

國家自然科學基金（31360409，31471667）

剛虎軍（1989-），男，碩士研究生，研究方向為食品加工與安全。

*通訊作者：王偉華（1977-），女，副教授，博士，研究方向為食品營養與安全。