多孔殼聚糖固定酵母蛋白酶條件的優化及酶學性質分析

姚曉瑞寧，高飛飛，王 斌，肖 婧，賈晨坤，王順利，史學偉*

（1.石河子大學食品學院，新疆石河子，832000；2.石河子大學信息科學與技術學院，新疆石河子，832000；3.新疆唐庭霞露酒莊有限公司，新疆五家渠，831300）

多孔殼聚糖固定酵母蛋白酶條件的優化及酶學性質分析

姚曉瑞寧1，高飛飛1，王 斌1，肖 婧2，賈晨坤1，王順利3，史學偉1*

（1.石河子大學食品學院，新疆石河子，832000；2.石河子大學信息科學與技術學院，新疆石河子，832000；3.新疆唐庭霞露酒莊有限公司，新疆五家渠，831300）

以多孔殼聚糖微球固定酵母蛋白酶，通過對戊二醛含量、吸附時間、固定化溫度、pH進行了單因素試驗及正交試驗，以蛋白酶酶活回收率為評價指標，確定的固定化條件為戊二醛含量1.4%，吸附溫度27℃，pH值為10，吸附時間24 h。在此最佳條件下，固定化酵母蛋白酶酶活回收率為68.8%。酶學性質分析結果表明，固定化酶最佳反應溫度較游離酶升高10℃，最佳作用pH較游離酶向堿性方向偏移1個pH單位。因此，用多孔殼聚糖對酵母蛋白酶進行包埋可以提高蛋白酶活性。

多孔殼聚糖；蛋白酶；固定化；酶學性質

酶作為一種天然的高分子催化劑，因其具有極高的專一性、反應條件溫和、無污染等優點，在食品加工、醫藥等產業中有著極為廣闊的應用前景[1]。然而，游離酶的不穩定和容易變性等缺點限制了其在工業化生產中的應用。固定化酶的研究最早可以追溯到1916年，有學者首先發現被骨碳粉末吸附的酵母蔗糖酶仍具有催化活性[2]。由于傳統酶固定化技術存在缺陷，能用于規模生產的還僅限于葡萄糖異構酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等為數不多的幾個酶種。

盡管蛋白酶的來源廣泛，但是酶穩定性較差，在pH、溫度和無機離子等因素的影響下，易變性失活，酶在反應結束之后又難以重復利用，因此難于實現連續化酶反應[3]。固定化酶相比于游離酶穩定性有較大提高，對熱、pH等的穩定性也提高，對抑制劑的敏感性降低，易于分離，改善了后處理過程。本研究以多孔殼聚糖微球為載體，固定化酵母蛋白酶，以提高酶的利用率，并對吸附時間、戊二醛濃度、固定化pH、吸附溫度進行了探索，制定了蛋白酶固定化的最佳工藝，并對固定化酶特性進行了研究，為蛋白酶固定化研究提供了理論支持。固定化酶相比于游離酶對熱、pH等條件的穩定性有所提高，而且對酶抑制劑的敏感性降低，易于分離，改善了后處理過程[4-5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸銨、氯化鈣、福林酚試劑、三氯乙酸（均為分析純）：天津致遠化學試劑有限公司；氯化鉀、氯化銨、檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純）：天津永晟精細化工有限公司；醋酸、殼聚糖、戊二醇、無水乙醇、Span-80、Tween-60、液體石蠟、乙醚、干酪素、酪氨酸（均為分析純）：上海浦山化工有限公司；蛋白酶（3 000 U/g）天津市耀華化學試劑有限責任公司。

1.2 儀器與設備

UV-2802SH紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司、PHS-3C精密酸度計：上海精密科學儀器有限公司；DK-8D電熱恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市醫療儀器廠；JJ-1磁力攪拌器：上海國華電器有限公司；FD-1B冷凍干燥機：上海廈美生化科技發展有限公司；CX21FS1光學顯微鏡：日本Olympus公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 殼聚糖微球的制備

取2 g殼聚糖干粉充分溶于100 mL冰乙酸（1.7%），在室溫下攪拌殼聚糖完全溶解至溶液澄清透明，以100 mL殼聚糖溶液為水相，以488mL甲苯（含7mLSpan-80和2mL Tween-60）為有機相，邊攪拌邊滴加殼聚糖溶液，混合物1 100r/min攪拌60min形成乳液。隨后加入10mL戊二醛溶液繼續攪拌固定60 min。最后混合物用蒸餾水充分洗滌直至形成水凝膠狀微球，透明無異味為止[6]。收集的微球用不同體積分數（30%、50%、80%、95%、100%）的乙醇脫水，用乙醚干燥后存儲于密封袋。

1.3.2 固定化酶的制備

取適量的微球置于三角瓶中，加入pH 10.0硼酸鹽緩沖液10 mL，放置24 h，使其充分溶脹，然后抽干備用。添加一定量的蛋白酶溶液，于一定溫度吸附適量的時間，然后滴入pH 10.0的硼酸鹽緩沖液配制的一定濃度戊二醛溶液，并加入一定量的牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為保護劑，一定溫度下交聯一段時間，剩余的戊二醛溶液倒出[7]，吸干水分冷凍干燥后得到固定化酶。用去離子水洗去固定化蛋白酶中殘留的戊二醛，測定其酶活[8]，并計算酶活回收率（recoveryrateofenzymeactivity，RRA），其計算公式如下[9]：

1.3.3 蛋白酶酶活的測定

利用福林-酚法測定蛋白酶的活力[10]。蛋白酶酶活定義：在pH11，40℃條件下，1 min內產生1 mg酪氨酸所需的酶量（g）為一個酶活力單位（U）。

式中：A為樣品平行試驗的平均OD680nm值；K為吸光常數；4為反應試劑的總體積，mL；10為酶解反應時間，min；n為酶液稀釋總倍數。

酪氨酸標準曲線的繪制：將酪氨酸于105℃烘2 h，精確稱取0.100 0 g，加少量0.2 mol/L鹽酸加熱溶解，用蒸餾水定容到1 000 mL（每毫升含酪氨酸100.0 μg），取5支試管，按表1加樣，各加入0.4 mol/L碳酸鈉5 mL及已稀釋福林試劑1 mL，搖勻于40℃恒溫水浴鍋中發色20 min，以0號管為空白，在波長680 nm處進行比色。以吸光度值OD680nm為縱坐標，以酪氨酸含量（μg/mL）為橫坐標，繪制酪氨酸標準曲線。

表1 酪氨酸標準曲線繪制Table 1 Drawing of tyrosine standard curve

（2）樣品中蛋白酶酶活的測定

在試管中加入1 mL酶液，于40℃恒溫水浴鍋中預熱20 min，再加入同樣經過預熱酪蛋白溶液（精確稱取干酪素2.000 g，加入0.1 mol/L NaOH 10 mL，在水浴鍋中加熱使其溶解，然后用pH 7.2磷酸鹽定容至100 mL）1 mL，精確保溫10 min，再加入三氯乙酸2 mL以終止反應，繼續置于水浴鍋中保溫20 min，使蛋白質沉淀后離心或過濾，取濾液1 mL，按照標準曲線繪制方法測定樣液吸光度值OD680nm。空白對照測定方法同上。在加酪蛋白之前先加三氯乙酸使酶失活再加入酪蛋白溶液。

1.3.4 固定化條件優化單因素試驗

分別于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃條件下固定蛋白酶，加入10 mL、pH值分別為7、8、9、10、11、12硼酸鹽緩沖液使其充分溶脹，之后分別加入10 mL酶液，置于不同溫度下分別吸附4 h、8 h、14 h、18 h、24 h、28 h，分別加入50%（V/V）的戊二醛使其含量分別為0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%、2.2%，于4℃條件下交聯12 h后將燒杯中溶液倒出，用去離子水洗去殘留的戊二醛，測定其酶活并計算酶活回收率，3次平行試驗[11]。

1.3.5 固定化條件優化正交試驗

以固定化pH、吸附溫度、戊二醛含量和吸附時間為影響因素，以蛋白酶酶活回收率為評價指標，進行4因素3水平的正交試驗。正交試驗因素與水平見表2。

表2 固定化條件優化正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for immobilized conditions optimization

1.3.6 固定化蛋白酶酶學性質分析[12]

（1）最適pH

取適量的游離蛋白酶和固定化蛋白酶，在緩沖液0.2 mol/L、pH值分別為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的條件下。在40℃條件下測兩種酶活力，以游離酶和固定化酶活力最大值為100%，用酪蛋白作為底物，測定游離酶和固定化酶不同pH條件下的相對酶活。

（2）最適反應溫度

取適量游離蛋白酶和固定化蛋白酶各自最適pH環境中，不同的溫度依次為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃因素中。以游離酶和固定化酶活力最大值為100%，用酪蛋白作為底物，測定游離酶和固定化酶不同溫度條件下相對酶活。

（3）固定化酶儲存穩定性

稱取一定量蛋白酶和固定化蛋白酶，各自最適的溫度、最適的pH條件下，分別保存6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、11 d、12 d，用酪蛋白作為底物，測定游離酶和固定化酶不同保存時間的相對酶活。

2 結果與分析

2.1 酪氨酸標準曲線

以OD680nm值（y）為縱坐標，酪氨酸溶液的質量濃度（x）為橫坐標，繪制酪氨酸標準曲線見圖1。由圖1可知，L-酪氨酸標準曲線回歸方程為y=0.011 4x+0.001 7，相關系數R2為0.999 2，表明酪氨酸在0～50 μg/mL質量濃度范圍內吸光度值之間線性關系良好。

圖1 酪氨酸標準曲線Fig.1 Standard curve of tyrosine

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 吸附溫度的影響

圖2 吸附溫度對酶活回收率的影響Fig.2 Effect of adsorbent temperature on enzyme activity recovery rate

由圖2可知，吸附溫度在5～30℃時，酶活回收率表現為先增高后下降的現象。當吸附溫度在0～25℃時，酶活回收率隨著吸附溫度的增加而升高；當固定化溫度達到25℃時，酶活回收率達到最大64.6%；當吸附溫度＞25℃之后，酶活回收率出現降低的現象。因此，最佳吸附溫度為25℃。

2.2.2 固定化pH的影響

圖3 固定化pH對酶活回收率的影響Fig.3 Effect of immobilized pH on enzyme activity recovery rate

由圖3可知，在pH在7～11時，酶活回收率也隨著pH值的增大而增加；當pH達到11時，酶活回收率達到最大62%，當pH為11～12時，酶活回收率呈現為下降趨勢，可能是因為殼聚糖受pH影響，過高pH會導致殼聚糖的完整性受到破壞。因此，最佳固定化pH值為11。

2.2.3 吸附時間的影響

圖4 吸附時間對酶活回收率的影響Fig.4 Effect of adsorbent time on enzyme activity recovery rate

由圖4可知，吸附時間在4～18 h時，酶活回收率隨著時間增加而增大；吸附時間為24 h時，酶活回收率到達最高值64.6%；吸附時間在18～24 h時，酶活回收率隨吸附時間的延長而出現下降。隨著交聯時間的不斷延長，戊二醛與二者的交聯反應逐漸達到平衡，載體上的酶蛋白結合位點也不斷被飽和，當交聯時間進一步增加，固定到載體上的酶蛋白的基本恒定[13]，但是戊二醛對固定化酶蛋白的變性作用依舊存在，并起著主導作用，從而降低了固定到殼聚糖微球上的蛋白酶的活性，最終使得酶活回收率降低。因此，最佳吸附時間為24 h。

2.2.4 戊二醛含量的影響

圖5 戊二醛含量對酶活回收率的影響Fig.5 Effect of glutaraldehyde content on enzyme activity recovery rate

由圖5可知，戊二醛含量為0.2%～2.2%時，酶活回收率先增高后下降。當戊二醛含量0.2%～1.4%，酶活回收率隨戊二醛含量增加有不同程度升高，這是因為戊二醛溶液可以將微球表面和酶分子互相緊密交聯，形成酶分子及微球表面牢固的連接在一起，所以酶活回收率增高；當戊二醛含量為1.4%時，酶活回收率為最高64%；當戊二醛含量＞1.4%時，酶活回收率出現降低，這可能因為過高濃度的戊二醛，高濃度的戊二醛溶液中戊二醛內部羥醛縮合反應，產物將會附于微球表面，導致酶的固定化過程難以進行，因而導致酶活回收率下降。因此，最佳戊二醛含量為1.4%[14]。

2.3 正交試驗結果

以固定化pH、吸附時間、戊二醛含量和吸附時間為影響因素，以蛋白酶酶活回收率為評價指標，進行4因素3水平的正交試驗，其結果與分析見表3。

表3 固定化條件優化優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for immobilized conditions optimization

由表3可知，各因素對結果影響由大到小順序為C＞D＞A＞B，即戊二醛含量＞吸附溫度＞固定化pH＞吸附時間，最優水平組合為A2B3C2D2，即固定化pH值為10、吸附時間24h、戊二醛含量1.4%、吸附溫度27℃，在此最佳條件下進行3次驗證試驗，固定化蛋白酶的酶活回收率是68.6%。

2.4 酶學性質分析

2.4.1 固定化酶的最適pH

圖6 固定化酶的最適pHFig.6 Optimum pH of immobilized enzyme

由圖6可知，固定化酶和游離酶在以酪蛋白為底物進行反應時的最適pH分別為9和10，游離酶的最適pH比固定化酶的最適pH高了1個值。這可能是因為固定化酶的過程中，殼聚糖分子中含有大量的羥基和氨基，所以制備的殼聚糖微球帶有大量的正電荷，這一性質將影響溶液中的負離子集中在擴散層，致使酶分子穩定結構之間的作用力（疏水相互作用力、氫鍵、離子相互作用等）減弱，所以導致固定化酶的pH值有所降低[15]。

2.4.2 固定化酶的最適反應溫度

圖7 固定化酶的最適反應溫度Fig.7 Optimum reaction temperature of immobilized enzyme

由圖7可知，游離酶和固定化酶在30～50℃溫度區間，隨著溫度的上升，酶的活力均表現為增加。但在70～90℃溫度區間游離酶活力出現大幅度的降低，所以游離蛋白酶最適溫度為50℃，固定化酶最適溫度為60℃。由此可知，固定化酶比游離酶的最適溫度高了10℃，說明固定化酶的耐熱性更高。

2.4.3 固定化酶的儲存穩定性

圖8 固定化酶的儲存性Fig.8 Storage of immobilized enzyme

由圖8可知，于4℃、儲存11 d對，游離酶以及固定化酶活力分別剩余為15%、48%。由此可知，在相同條件下，顯然固定化酶的儲存能力大于游離酶，固定化酶儲存性得到了明顯提高。這是由于固定化酶構象緊密程度升高，減少酶分子內部間的反應過程，并且還可以阻擋外部的環境破壞，所以固定化酶比游離酶具有較高儲存性。

3 結論

試驗結果表明，固定化蛋白酶最優培養條件為吸附溫度27℃，固定化pH值為10，吸附時間24 h，戊二醛含量1.4%。在此最佳條件下，蛋白酶酶活回收率為68.6%。游離酶的最適pH比固定化酶的最適pH提高了1個單位，因此固定化酶表現出更好耐酸性；固定化酶比游離酶的最適溫度提高了10℃，因此固定化酶的耐熱性較游離酶較高；固定化酶的熱穩定性較游離酶有了顯著提高；在相同條件下，固定化酶的儲存能力大于游離酶，固定化酶儲存性得到了明顯提高。

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Optimization of immobilized conditions of yeast protease by porous chitosan and analysis of its enzymatic properties

YAO Xiaoruining1,GAO Feifei1,WANG Bin1,XIAO Jing2,JIA Chenkun1,WANG Shunli3,SHI Xuewei1*(1.College of Food Science,Shihezi University,Shihezi 832000,China;2.College of Information Science and Technology,Shihezi University, Shihezi 832000,China;3.Xinjiang Tang-Ting-Xia-Lu Chateau Co.,Ltd.,Wujiaqu 831300,China)

The yeast protease was immobilized by porous chitosan microspheres.The glutaraldehyde content,adsorption time,immobilization temperature and pH were determined by single factor and orthogonal experiments.Using the protease activity recovery as evaluation index,the immobilized conditions were as follows:glutaraldehyde content 1.4%,adsorption temperature 27℃,pH 10 and adsorption time 24 h.Under the optimal conditions,the recovery rate of immobilized yeast protease activity was 68.8%.The results of enzymatic properties analysis showed that the optimum reaction temperature of immobilized enzyme was 10℃higher than that of free enzyme,and its optimal pH moved to alkaline direction by 1 pH unit compared with the free enzyme.Therefore,embedding of yeast protease by porous chitosan could improve the protease activity.

porous chitosan;protease;immobilization;enzymatic properties

Q814.2

0254-5071（2017）01-0146-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.031

2016-10-19

兵團科技攻關計劃（2015AB016）；科技和金融結合財政貼息類項目（2016TX49）

姚曉瑞寧（1994-），女，碩士研究生，研究方向為食品安全生物技術。

*通訊作者：史學偉（1980-），男，副教授，博士，研究方向為食品科學生物技術。