Illumina高通量測序技術分析中周羌稞養生酒窖泥細菌多樣性

覃榮周，王琪林,2，任朝琴,3，戴先芝,3，劉 通，曾權高

（1.阿壩師范學院藏羌醫藥研究所，四川阿壩藏族羌族自治州623001；2.成都體育學院運動醫學與健康研究所，四川成都610041；3.阿壩師范學院化學化工與生命科學系，四川阿壩藏族羌族自治州623001；4.四川省阿壩州中周酒業有限公司，四川阿壩藏族羌族自治州624000）

Illumina高通量測序技術分析中周羌稞養生酒窖泥細菌多樣性

覃榮周1，王琪林1,2，任朝琴1,3，戴先芝1,3，劉 通1，曾權高4

（1.阿壩師范學院藏羌醫藥研究所，四川阿壩藏族羌族自治州623001；2.成都體育學院運動醫學與健康研究所，四川成都610041；3.阿壩師范學院化學化工與生命科學系，四川阿壩藏族羌族自治州623001；4.四川省阿壩州中周酒業有限公司，四川阿壩藏族羌族自治州624000）

以不同窖齡（5年、10年、20年和30年）的中周羌稞養生酒窖泥為研究對象，利用Illumina高通量測序技術對窖泥細菌16S rRNA V4～V5區進行測序，分析其細菌多樣性。結果表明，窖泥中細菌多樣性（Shannon指數）和豐富度（Chao指數）隨著窖齡的增加而顯著提高（P＜0.05）。不同窖齡窖泥的細菌群落組成存在差異，鹽扁菌科（Haloplasmataceae）、乳酸桿菌科（Lactobacillaceae），瘤胃球菌屬（Ruminococcaceae）和梭菌屬（Clostridium）為不同窖齡窖泥的共有細菌；類芽孢桿菌屬（Paemibacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、消化球菌科（Peptococcaceae）、喜鹽芽孢桿菌屬（Haloballus）和鏈球菌屬（Streptococcus）只出現在30年窖齡窖泥中；PCA結果分析表明，相同窖齡窖泥中的細菌具有更高的相似性，說明窖齡是影響窖泥細菌群落組成的重要因素之一。

中周羌稞養生酒；濃香型；窖泥；細菌多樣性；Illumina高通量測序技術

白酒是我國特有的一種由糧食發酵而來的蒸餾酒，其中以濃香型白酒的產量最多，占白酒總量的70%左右[1-2]。中周羌稞養生酒是四川阿壩地區著名的濃香型白酒之一，生產過程中以中高溫大曲配合窖泥發酵，由于其原料為青稞而呈現出其特有的風味，并深受當地人民的喜愛[3]。窖泥經過不同時間的演化具有其獨特的微生物特性[4]，因此，對中周羌稞養生酒不同窖齡的窖泥進行微生物多樣性的研究有助于揭示窖泥的演變過程。

傳統的培養方法只能對窖泥中少數的微生物進行鑒定，研究表明，窖泥中不易培養或者不能培養的微生物（如厭氧或者兼性厭氧微生物）在濃香型白酒生產中也發揮了重要的作用[5-6]。目前，變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）是微生物多樣性研究中最常用的方法之一，它能夠對環境中不能培養的微生物進行鑒定，但是此技術并不能用于定量，且通量小，只能鑒定環境中的少部分微生物[7-8]。Illumina高通量測序技術是近年來興起的分析微生物多樣性的技術，具有一定的優越性，可準確的對環境中的微生物進行定量，且具有較高的通量，能夠較為全面的揭示環境中微生物的特性[9-10]。因此，本研究利用Illumina高通量測序技術對窖齡為5年、10年、20年和30年的中周羌稞養生酒窖泥進行細菌的多樣性分析，以期揭示不同窖齡中周羌稞養生酒窖泥微生物的多樣性，為優質濃香型白酒的生長提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 窖泥樣品

本試驗中的窖泥均為阿壩中周羌稞養生酒優質窖泥，采自四川省阿壩州中周酒業有限公司，窖齡分別為5年、10年、20年和30年。每個窖齡的窖泥分別采自5口窖池，分別編號為5年（1、2）、10年（3、4）、20年（5、6）、30年（7、8）。取樣方法為從每個窖齡窖池的上層、中層和底部分別取樣，混合均勻后于-20℃保藏待用[11]。

1.1.2 主要試劑

土壤DNA提取試劑盒、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）純化試劑盒、DNA Marker D2000：北京天根生化科技有限公司；無水乙醇（分析純）：鄭州中天實驗儀器有限公司；瓊脂糖（分析純）：北京沃比森科技有限公司。細菌16S rRNA V4～V5區引物515F和907R 149：北京諾禾致源生物信息科技有限公司。

1.2 儀器與設備

TGL-16M臺式高速冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；PL203型電子分析天平：唐山藍箭電子衡器有限公司；DZKW-S-8恒溫水浴鍋：北京市永光明醫療儀器有限公司；DYY-10C型電泳儀：北京市六一儀器廠；illumina Miseq PE250高通量測序儀：上海美吉生物醫藥科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥細菌DNA提取及PCR擴增

根據鄧杰等[12]的報道采利用DNA提取試劑盒（MIBIO UltraClean Soil DNA Isolation Kit）對不同窖齡的窖泥細菌DNA進行提取。以不同窖齡窖泥細菌總DNA為模板，引物采用細菌16S rRNA V4～V5區引物515F（5′-148-GTGCCA GCMGCCGCGG-3′）和907R 149（5′-CCGTCAAATTCMT TTRAGTTT-3′）[13]進行TouchDownPCR擴增，TouchDown PCR反應條件參考TIAN W等[14]的方法。

1.3.2 PCR產物純化

利用PCR純化試劑盒對擴增產物進行純化，之后利用2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR純化產物進行檢測，并在紫外凝膠成像系統中觀察條帶，利用分光光度計檢測DNA擴增產物在波長230 nm、260 nm和280 nm處的吸光度值，并計算OD260nm/OD280nm和OD260nm/OD230nm，確定擴增產物的濃度和純度，滿足純度要求后用于后續試驗。

1.3.3 Illumina高通量測序

利用Illumina高通量測序儀對窖泥細菌DNA PCR擴增產物進行測序分析，為了確保實驗數據的準確性及普遍性，需對獲得的原始序列進行適當的篩選，去掉低質量的序列，進而獲得滿足后續分析要求的高質量序列。通過與核糖體數據庫（ribosomal database project，RDP）已知序列的比對，修剪適配器和核糖體標簽來減少測序錯誤率[15]。利用Mothur軟件識別和消除嵌合體來改善序列質量。

1.3.4 生物信息學分析

利用微生物生態學的定量分析（quantitative insights into microbial ecology，QIIME）平臺對窖泥細菌DNA序列進行高級生物信息分析，每個樣品剩余的高質量序列用于劃分操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。在97%相似度的OTUs進行同源性比對的基礎上，評估窖泥樣品細菌的豐富度（Chao指數）和多樣性（Shannon指數）[16]。此外，主成分分析（principal component analysis，PCA）用來反映不同窖泥樣本之間細菌組成的差異。

1.3.5 數據分析

實驗結果以平均數±標準偏差表示，并利用SPSS17.0軟件對實驗數據進行分析，選擇Tukey's檢驗，當P＜0.05時可視為具有統計學意義，表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 窖泥樣品DNA擴增產物質量檢驗

圖1 窖泥樣品PCR擴增產物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplification products of pit mud samples

表1 窖泥樣品PCR產物檢測結果Table 1 Detection results of PCR amplification products of pit mud samples

由圖1可知，窖泥樣品PCR擴增產物條帶清晰單一，不存在拖帶或者引物二聚體，條帶大小在500 bp左右，符合16S rRNA V4～V5區擴增產物要求。同時由表1可知，8個窖泥樣品DNA擴增產物的OD260nm/OD280nm值都在1.8～2.0之間，OD230nm/OD260nm值都＞2.0，說明PCR產物的濃度和純度都較高，可以滿足Illumina高通量測序分析的要求。

2.2 測序數據的合理性分析

為了進一步分析測序數據的合理性，對窖泥樣品進行稀疏曲線分析，以樣本中隨機抽取測序序列數為橫坐標，OTU數為縱坐標，繪制出稀疏曲線，結果如圖2所示，圖中稀疏度是一定測序數量中所測出的OTU數量的多少，是通過高通量測16s RNA相關序列，比對序列的同源性，由軟件分析得到。由圖2可知，隨著測序數量增加，各窖泥樣品的稀疏曲線先經過陡坡期，然后趨于平坦，說明繼續增加測序的數量對產生的OTU數量的影響較少，樣品的測序條數能夠滿足試驗的后續要求，可以用于進一步的樣品細菌多樣性分析。

圖2 窖泥樣品的稀疏曲線分析Fig.2 Rarefaction curves analysis of pit mud samples

2.3 不同窖齡窖泥中細菌豐富度和多樣性分析

表2 不同窖齡窖泥樣品細菌多樣性和豐富度比較Table 2 Comparison of bacterial diversity and abundance of pit mud with different cellar ages

由表2可知，8個樣品共有548 313條序列，進行抽平（subsample）后，計算alpha多樣性和beta多樣性，經過深度抽平處理后，每個樣品最后的序列為19 353條，此序列的數量能夠覆蓋整個樣品序列的98%以上，這說明得到的樣品序列質量較高，能夠用于窖泥中細菌多樣性的研究。在97%相似度水平下，所有窖泥樣品序列總共被歸類為7 925個OTUs。其中5年、10年、20年和30年窖泥中細菌的OTUs分別為254±5.41、321±13.11、452±13.23和558±17.59，隨著窖泥窖齡的增加，樣品中OTUs的數量顯著增加（P＜0.05）。

通過對不同窖齡窖泥樣品細菌多樣性（Shannon指數）和豐富度（Chao指數）分析可知，所有窖泥樣本中細菌的多樣性和豐富度都較高，這說明窖泥中的細菌群落特征較為復雜。此外，Shannon指數和Chao指數都隨著窖泥窖齡的增加而顯著增加（P＜0.05）。

2.4 不同窖齡窖泥中細菌種群結構分析

利用Illumina Miseq高通量測序技術對窖泥細菌DNA PCR產物進行測序分析，通過數據庫比對得到窖泥細菌的種類，并進一步計算各種細菌所占細菌總數的比例（即相對含量），結果如圖3所示。

圖3 不同窖齡窖泥中細菌群落結構分析Fig.3 Analysis of bacterial community structure in pit mud with different cellar ages

8個樣品中的細菌共包含7個門，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、互養菌門（Synergistaceae）、綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）和黏膠球形菌門（Lentisphaerae），其中厚壁菌門，互養菌門和綠彎菌門為優勢菌門，占細菌總數的90.22%。此外，其他相對含量小于0.01%的所有屬的總和用“Others”表示。隨著窖齡的增加，窖泥中“Others”的比例也隨之增加，這也表明了窖泥中細菌的多樣性隨著窖齡的增加而增加。

由圖3可知，具有相同窖齡的窖泥中細菌構成較為相似，不同窖齡窖泥之間的群落構成存在一定的差異。5年窖齡的窖泥中優勢的細菌為：梭菌屬（Clostridium）（26.32± 1.92）%、鹽扁菌科（Haloplasmataceae）（16.72±1.72）%、乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）（10.31±0.82）%、互養菌科（Synergistaceae）（9.31±0.32）%和瘤胃球菌屬（Ruminococcaceae）（9.02±0.18）%；10年窖齡的窖泥中優勢的細菌為：梭菌屬（Clostridium）（20.15±1.36）%、鹽扁菌科（Haloplasmataceae）（12.35±0.92）%、乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）（10.07±1.12）%、瘤胃球菌屬（Ruminococcaceae）（7.22± 1.21）%、互養菌科（Synergistaceae）（7.12±0.81）%、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）（7.12±0.48）%和類芽孢桿菌屬（Paemibacillus）（6.56±0.37）%；20年窖齡的窖泥中優勢的細菌為：梭菌屬（Clostridium）（20.43±1.09）%、鹽扁菌科（Haloplasmataceae）（13.47±0.76）%、瘤胃球菌屬（Ruminococcaceae）（8.88±0.81）%、喜熱菌屬（Caloramator）（7.66± 0.83）%、乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）（7.12±0.63）%、類芽孢桿菌屬（Paemibacillus）（6.92±0.84）%、假單胞菌科（Pseudomonadaceae，5.81±0.64%）、互養菌科（Synergistaceae）（5.32±0.83）%和芽孢桿菌（Bacillus）（1.01±0.03）%；30年窖齡的窖泥中優勢的細菌為：梭菌屬（Clostridium）（14.98± 0.84）%、鹽扁菌科（Haloplasmataceae）（9.35±0.73）%、乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）（6.05±0.73）%、類芽孢桿菌屬（Paemibacillus）（5.99±0.44）%、喜熱菌屬（Caloramator）（5.91± 0.76）%、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）（5.63±0.36）%、瘤胃球菌屬（Ruminococcaceae）（3.16±0.21）%、互養菌科（Synergistaceae）（2.89±0.23）%、喜鹽芽孢桿菌屬（Haloballus）（2.44±0.16）%、鏈球菌屬（Streptococcus）（2.11±0.16）%和消化球菌科（Peptococcaceae）（2.01±0.17）%?？梢婋S著窖齡的增加，窖泥中細菌的群落結構也發生了變化。而通過不同窖齡窖泥優勢細菌的比較可知厚壁菌門中的鹽扁菌科、乳酸桿菌，瘤胃球菌屬和梭菌屬為不同窖齡窖泥的共有細菌，而類芽孢桿、芽孢桿菌屬、消化球菌科、喜鹽芽孢桿菌屬和鏈球菌屬等可能在高窖齡（30年）中周羌稞養生酒的發酵中發揮重要的作用。

2.5 PCA分析

圖4 不同窖齡窖泥細菌群落結構PCA分析Fig.4 PCA analysis of bacterial community structure in pit mud with different cellar ages

圖4 為不同窖齡窖泥細菌群落結果的PCA分析圖，由圖4可知，8個窖泥樣品共分為了4個組，不同窖齡的4個窖泥樣品聚成一組，分別為A（1和2號樣品）、B（3和4號樣品）、C（5和6號樣品）和D（7和8號樣品），這顯示具有相同窖齡的窖泥中具有相似的細菌群落結構，而不同窖齡的窖泥中細菌的群落結果則為分散和遠離現象，說明群落之間有明顯的差異。表明窖泥中細菌群落的組成與窖泥的窖齡密切相關。

3 結論

利用Illumina高通量測序技術能夠較為全面的分析中周羌稞養生酒不同窖齡窖泥中細菌的多樣性。窖泥中細菌的生物多樣性和豐富度隨著窖泥窖齡的增加而顯著增加。細菌的組成也發生了改變，其中鹽扁菌科、乳酸桿菌、瘤胃球菌屬和梭菌屬為4種窖齡窖泥的共有細菌，而類芽孢桿、芽孢桿菌屬、消化桿菌科、喜鹽芽孢桿菌屬和鏈球菌屬只出現在高窖齡中周羌稞養生酒窖泥中，PCA分析進一步表明中周羌稞養生酒窖泥中細菌群落的組成與窖泥的窖齡密切相關。

[1]王明躍，張文學.濃香型白酒兩個產區窖泥微生物群落結構分析[J].微生物學通報，2014，41（8）：1498-1506.

[2]謝玉球，謝旭.濃香型白酒“淡雅”與“濃郁”流派的差異分析[J].釀酒，2007，34（5）：112-114.

[3]樓惠新.青藏高原青稞生產發展與對策[J].柴達木開發研究，2000（2）：28-31.

[4]劉森.中國濃香型白酒窖池窖泥中原核微生物群落空間異質性研究[D].成都：西華大學，2013.

[5]岳元媛，張文學，劉霞，等.濃香型白酒窖泥中兼性厭氧細菌的分離鑒定[J].微生物學通報，2007，34（2）：251-255.

[6]胡曉龍.濃香型白酒窖泥中梭菌群落多樣性與窖泥質量關聯性研究[D].無錫：江南大學，2015.

[7]費鵬，白洪健，程述震，等.PCR-DGGE法分析嬰兒腸道菌群多樣性[J].食品與機械，2013，29（2）：60-63.

[8]NEILSON J W,JORDAN F L,MAIER R M.Analysis of artifacts suggests DGGE should not be used for quantitative diversity analysis[J].J Microbiol Method,2013,92(3):256-263.

[9]LI R,ZHU H,RUAN J,et al.De novo assembly of human genomes with massively parallel short read sequencing[J].Genome Res,2010,20(2): 265-272.

[10]秦楠，栗東芳，楊瑞馥.高通量測序技術及其在微生物學研究中的應用[J].微生物學報，2011，51（4）：445-457.

[11]鄧杰.基于高通量測序的濃香型白酒窖泥微生物群落結構研究[D].自貢：四川理工學院，2015.

[12]鄧杰，黃治國，衛春會，等.基于高通量測序的濃香型白酒窖池細菌群落結構分析[J].現代食品科技，2015，31（7）：205-210.

[13]XIONG J,LIU Y,LIN X,et al.Geographic distance and pH drive bacterial distribution in alkaline lake sediments across Tibetan Plateau[J]. Environ Microbiol,2012,14(9):2457-2466.

[14]TIAN W,ZHANG Z,HU X,et al.Short-term changes in total heavy metal concentration and bacterial community composition after replicated and heavy application of pig manure-based compost in an organic vegetable production system[J].Biol Fert Soils,2015,51(5):1-11.

[15]WANG Q,GARRITY G M,TIEDJE J M,et al.Na ve bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy[J].Appl Environl Microbiol,2007,73(16):5261-5267.

[16]ECKBURG P B,BIK E M,BERNSTEIN C N,et al.Diversity of the human intestinal microbial flora[J].Science,2005,308(5728):1635-1638.

Analysis of bacterial diversity in pit mud of Zhong-Zhou highland barley health liquor by Illumina high-throughput sequencing

QIN Rongzhou1,WANG Qilin1,2,REN Chaoqin1,3,DAI Xianzhi1,3,LIU Tong1,ZENG Quangao4(1.Tibetan-Qiang's Medicine Research Institute,ABA Normal University,Aba Tibetan and Qiang Autonomous Prefecture 623001, China;2.Sports Medicine and Health Research Institute,Chengdu Sports University,Chengdu 610041,China;3.Department of Chemical Engineering and Life Science,ABA Normal University,Aba Tibetan and Qiang Autonomous Prefecture 623001,China; 4.Zhong-Zhou Highland Barley Wine Industry Co.,Ltd.,Aba Tibetan and Qiang Autonomous Prefecture 624000,China)

Using pit mudfrom different cellars with the ages(5 years,10 years,20 years and 30 years)of Zhong-Zhou highland barley health liquor as the research objects,16S rRNA V4-V5 sequence of bacteria in the pit mud was detected by Illumina high-throughput sequencing,and the diversity of bacteria was analyzed.The results showed that the diversity(Shannon index)and abundance(Chao index)of bacteria in pit mud with increasing of cellar age were increased significantly(P＜0.05).The bacterial community composition of pit mud with different cellar ages had difference.Haloplasmataceae,Lactobacillaceae,RuminococcceaeandClostridiumwere the common bacteria of pit mud with different cellar ages.Paemibacillus,Bacillus,Peptococcaceae,HaloballusandStreptococcusonly appeared in the pit mud with 30 years cellar age.PCA analysis indicated that the bacteria in the pit mud with the same cellar ages had a higher similarity,which showed that cellar age was one of the important factors that affected the bacterial community of pit mud.

Zhong-Zhou highland barley health liquor;Luzhou-flavor;pit mud;bacterial diversity;Illumina high-throughput sequencing

TS255

0254-5071（2017）01-0138-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.029

2016-07-05

四川省哲學社會科學重點研究基地2014年度課題(QXJ1401)；阿壩師范學院2014專項基金課題(JY14-02)；四川省羌學學會藏羌地區醫藥研究所2015年度資助項目(LYH15-01)

覃榮周(1977-)，男，副教授，碩士，研究方向為民族傳統醫學與公共衛生。