鏈霉菌Streptomycessp.FJS31-2產鹵化二型聚酮類化合物的發酵條件優化

王蔭蔭，王 苗，錢聲艷，呂玉紅，保玉心，胡永林，岳昌武*

（1.遵義市第一人民醫院遵義市基因遺傳病精準診斷及藥物靶向治療重點實驗室，貴州遵義563003；2.遵義醫學院第三附屬醫院中心實驗室，貴州遵義563003；3.遵義醫學院微生物資源及藥物開發特色重點實驗室，貴州遵義563003；4.遵義醫學院檢驗系，貴州遵義563003）

鏈霉菌Streptomycessp.FJS31-2產鹵化二型聚酮類化合物的發酵條件優化

王蔭蔭1,2,3，王 苗3，錢聲艷3，呂玉紅3，保玉心3，胡永林4，岳昌武1,2,3*

（1.遵義市第一人民醫院遵義市基因遺傳病精準診斷及藥物靶向治療重點實驗室，貴州遵義563003；2.遵義醫學院第三附屬醫院中心實驗室，貴州遵義563003；3.遵義醫學院微生物資源及藥物開發特色重點實驗室，貴州遵義563003；4.遵義醫學院檢驗系，貴州遵義563003）

以產zunyimycin A及BE-24566B類鹵化天然化合物的Streptomycessp.FJS31-2為研究對象，分別利用高分辨質譜（HRMS）和高效液相色譜（HPLC）為檢測手段，對不同的碳源、氮源組合的培養基在不同的培養時間和萃取條件下獲得的目標化合物進行定性和產量的分析。在基礎培養基內添加10 g/L無水乙醇浸泡24 h后的腐殖酸，培養17 d，采取乙酸乙酯萃取可以使目標化合物產量提高。

鏈霉菌；zunyimycin A；發酵條件；優化

人們已分離到約4 500個結構復雜多樣的天然鹵化物，對于大部分微生物天然產物而言，鹵化后其生物活性會發生很大的改變，往往具有較好的生物活性和臨床應用潛力[1-2]，如土壤鏈霉菌來源的鹵化產物BE-19412A及其甲基化修飾后的BE-19412B都表現出很好的抗腫瘤活性[3]。目前臨床應用的絕大部分鹵化抗生素都是來自微生物或其骨架經人工修飾的半合成產物，且化合物主骨架上鹵化取代位置及取代基的種類和數目對抗生素的生物活性有不同程度的影響[4-5]。目前臨床廣泛使用的鹵化抗生素大部分是微生物天然產物或其人工修飾的半合成天然產物，近年來新開發的抗生素中，鹵化天然產物依然占據重要地位，如2014年美國食品和藥物管理局（food and drug administration，FDA）批準上市的用于治療耐藥菌感染的4種新型抗生素中達巴萬星（dalbavancin）、奧利萬星（oritavanci）、磷酸泰地唑胺（tedizolid）3種抗生素為鹵化物[6]。隨著在普通生境分離的放線菌中發現新鹵化抗生素越來越困難，人們開始把目光轉向特殊生境或典型生境，并在沙漠、海洋、植物內生菌等特殊生境中發現了新鹵化活性天然產物[7-9]。目前已在不同來源的鏈霉菌中分離到的二型聚酮類化合物Anthrabenzoxocinones家族成員見圖1。Anthrabenzoxcinone家族成員主要包括（+）-anthrabenzoxocinone（又名（+）-ABX、BE-24566B26或1.264C等）以及其結構類似物(-)-anthrabenzoxocinone（-）-ABX，1a)、（-）-bischloroanthrabenzoxocinone（（-）-BABX，1b）和zunyimycin等[10-12]。其中，zuunyimycin A為本課題組首次從鏈霉菌Stre-ptomycessp.FJS31-2發酵產物中分離獲得的一個新鹵化二型聚酮化合物，受限于該菌在原始培養基中發酵產率較低，zunyimycin A和BE-24566B及衍生物的活性分析和活性分子機制的解析進展緩慢。

圖1 zunyimycin A及結構類似物Fig.1 Zunyimycins and its structural analogue A

本研究通過優化Streptomycessp.FJS31-2發酵培養基組成、培養時間等條件，提高zunyimycin類化合物的產量，為其后續研究以及相關鏈霉菌天然產物的開發提供物質基礎和技術積累。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

鏈霉菌Streptomycessp.FJS31-2：由本實驗室分離自貴州梵凈山土壤（海拔高度800 m,東經108°47′50″，北緯27°56′32″），保存于中國普通菌種保存中心（菌株號CGMCC4.7321），該菌已由本課題組進行基因組測序（no.PRJNA320463）。

1.1.2 主要試劑

甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠；甲醇、乙腈（均為色譜純）：邁瑞達（北京）公司；微量元素預混液：ZnSO4·7H2O 2 g，FeSO4·7H2O 2 g，MnCl2·4H2O 2 g，CuSO4·5H2O 2 g，Na2B4O7·10H2O 2 g，（NH4)6MO7O24·4H2O 2 g，定容至1 000 mL；腐殖酸A為雙蒸水浸泡24 h過濾取濾液，腐殖酸B為無水乙醇浸泡24 h過濾取濾液。

1.1.3 培養基

基礎培養基：碳酸鈣2 g/L，葡萄糖4 g/L，麥芽抽提物10 g/L，酵母粉4 g/L，瓊脂粉18 g/L（液體培養基不含瓊脂粉），微量元素預混液0.05%，天然pH值，雙蒸水定容至1 L，分裝于250 mL（裝100 mL）或500 mL三角瓶（裝200 mL），121℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

Winpat-WP-30L自動滅菌發酵罐：美國Major Science公司；STRIKE300旋轉蒸發儀：意大利Steroglass公司；LC-20A高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：日本島津公司；JJ-CJ-2FD雙人超凈臺：蘇州市金凈凈化設備有限公司；BSP-400生化培養箱、YXQ-LS-75SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業有限公司；Milli-Q Reference超純水機：德國Merck Millipore公司；DZ-900雙層大容量落地式振蕩器：蘇州培英實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養

菌種活化：取出斜面保存的Strepotomycessp.FJS31-2菌種，接種環刮取菌體接種到基礎培養基上28℃培養，挑取單菌落培養至第三代可放大培養。

1.3.2 發酵培養基成分優化

課題組前期對培養基種類進行篩選，確定出基礎培養基所產目標化合物比較穩定但含量較低。在此基礎上，試通過調整碳源、氮源比例及添加腐殖酸提高代謝產物的產量。設計23種培養基（見表1）用于Strepotomyces.sp. FJS31-2發酵條件優化，每種培養基發酵400 mL，在接種量相同相同培養條件下培養15 d，乙酸乙酯等體積搖床萃取2次、140 r/min振蕩12 h，HPLC檢測發酵產物中目標化合物紫外吸收峰值及峰面積，并與10號基礎培養基做對照，比較不同培養基對化合物產量的影響。

表1 23種發酵培養基的組分Table 1 Components of 23 kinds of fermentation media g/L

1.3.3 培養時間優化

菌體培養至7 d、9 d、11 d、13 d、15 d、17 d、19 d、21 d，200 mL乙酸乙酯等體積搖床萃取2次，140 r/min振蕩12 h，HPLC檢測zunyimycin A峰面積變化，確定最佳培養時間。

1.3.4 萃取劑優化

采用極性由小到大的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇等體積萃取200 mL，HPLC檢測目標化合物比較峰面積的大小考察萃取劑對產物的影響。

1.3.5 發酵產物定性[13-14]

菌株FJS31-2抽提物37℃旋蒸得浸膏，取1 mg浸膏用3 mL色譜甲醇溶解，微孔濾膜過濾，設定HPLC進樣體積統一為10 μL，根據化合物在HPLC上的出峰時間、峰型峰值與HRMS對比進行定性。

2 結果與分析

2.1 培養基組分對zunyimycin A和BE-24566B類化合物產量的影響

通過改變培養基成分，根據HPLC檢測目標化合物吸收峰面積的大小，比較發酵產物的變化，結果見圖2。

圖2 培養基組成對鹵化二型聚酮類化合物發酵產量的影響Fig.2 Effect of medium components on the fermentation yields of halogenated typeⅡpolyketides

由圖2可知，當酵母粉含量高時可提高BE-24566B的產量，酵母粉含量＜4 g/L時不利于化合物產生，酵母粉可作為該化合物發酵的最佳有機氮源；而葡萄糖作為碳源對次級代謝產物的影響不及氮源的重要，當葡萄糖含量為4 g/L而酵母粉被硝酸銨或甘露醇代替時，化合物產量仍較低；碳源氮源以一定的比例添加體積分數1%乙醇浸泡過的腐殖酸，可提高次級代謝產物的產生，原始培養基BE-24566B產生峰面積為200，優化后峰面積達525，zunyimycin A峰面積由原來52提高至250，并優化出BE-24566B-1Cl化合物，所以將22號作為該菌發酵的最佳培養基。HPLC檢測次級代謝產物存在BE-24566B、一氯取代衍生物（BE-24566B-Cl），發酵液的質譜信息中證實此化合物紫外吸收峰，zunyimycin A是鹵化二型聚酮類二氯取代衍生物，三者之間基本母核相同僅取代基不同，推測發酵過程中三者是一個動態相互轉化的過程[15]。

2.2 培養時間對zunyimycin A和BE-24566B類化合物產量的影響

菌株FJS31-2產生的鹵化二型聚酮類化合物在生物體內是相互轉化的過程，對此菌株而言培養時間是一個重要的影響因素，因此本次試驗從發酵的第10天開始至第20天結束，每天以200 mL等體積萃取的分析方法考察培養時間的影響，結果見圖3。

圖3 培養時間對鹵化二型聚酮類化合物發酵產量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on the yield of halogenated typeⅡpolyketides

由圖3可知，BE-24566B及其氯代衍生物在發酵至17 d時含量最高，以BE-24566B為主。在7 d同時檢測到3種化合物，繼續培養至11 d時含量均發生較大改變；17 d后迅速下降，21 d時BE-24566B-1Cl降至為0，可推測一、二氯取代的衍生物受菌體內部環境影響較大不穩定，因此將發酵17 d為該菌培養的最佳時間。

2.3 萃取劑對zunyimycin A和BE-24566B類化合物產量的影響

zunyimycin A和BE-24566B及BE-24566B-1Cl化合物母核結構相同，而氯原子取代的位置不同將會影響到化合物的極性，不同極性的溶劑萃取的產物將有差別。實驗選取不同極性溶劑對發酵產物等體積萃取，通過HPLC檢測目標產物峰面積的變化，結果見圖4。

圖4 萃取劑對鹵化二型聚酮類化合物發酵產量的影響Fig.4 Effect of extraction agent on the yield of halogenated typeⅡpolyketides

由圖4可知，以乙酸乙酯作為萃取時得到的目標化合物含量較高，因此選擇乙酸乙酯劑作為萃取劑。

3 結論

實驗通過改變培養基成分、培養時間、培養方式及發酵產物萃取溶劑的選擇等因素，對鏈霉菌（Streptomycessp.）FJS31-2發酵條件進行優化，可以得出較優培養基組成為基礎培養基內添加10 g/L無水乙醇浸泡24 h后的腐殖酸，培養17 d，采取乙酸乙酯萃取可以使目標化合物產量提高。固體培養除周期長，操作繁瑣，影響發酵的因素難以檢測外，目標化合物的產量要高于液體培養；液體發酵方式可以縮短發酵周期、對發酵影響因素可以實現在線考察，降低勞動力等優點，但產生目標化合物種類和含量都較低，后續實驗還需進一步優化液體發酵條件，使目標化合物產量及效率得以進一步提升。

[1]GRIBBLE G W.Biological activity of recently discovered halogenated marine natural products[J].Marine Drugs,2015,13(7):4044-4136.

[2]NEWMAN DJ,CRAGG GM,SNADER KM.Natural Products as sources of new drugs over the period 1981-2002[J].J Nat Prod,2003,66(7): 1022-1037.

[3]TSUKAMOTO M,NAKAJIMA S,ARAKAWA H,et al.A new antitumor antibiotic BE-19412A produced by aStreptomcete[J].J Anantibiotics,1998,51(10):908-914.

[4]RENNER M K,JENSEN P K,FENICAL W.Neomangicols:structure and absolute stereochemistries of unprecedented halogenated sesterterpenes from a marine fungus of the geneFusarium[J].Org Chem,1998, 63(23):6346-6354.

[5]ODEH R A,AI-QAWASMEH R A,SINNOKROT M O,et al.Synthesis and qualitative structure activity relationship evaluations of quinoline-based bisarylimidazoles as antibacterial motifs[J].Med Chem,2016, 12(6):563-573.

[6]岳昌武.鹵化酶陽性鏈霉菌天然產物發現及生物合成基因簇鑒定[M].北京：金瑯學術出版社，2016：14-21.

[7]王蔭蔭，邵美云，岳昌武.微生物來源鹵化天然產物研究進展[J].遵義醫學院學報，2016，39（4）：439-444.

[8]李園園，保玉心，呂玉紅，等.梵凈山保護區土壤放線菌分離及其次級代謝產物初步研究[J].長江大學學報：自科版，2013（8）：60-65.

[9]YUE C,NIU J,LIU N,et al.Cloning and identification of the lobophorin biosynthetic gene cluster from marineStreptomyces olivaceusstrain FXJ7.023[J].Pakistan J Pharm Sci,2016,29(1):287-293.

[10]LIAO L,CHEN R,JIANG M,et al.Bioprospecting potential of halogenases from Arctic marine actinomycetes[J].BMC Microbiol,2016,16: 34-43.

[11]YIN X,CHEN Y,ZHANG L,et al.Enduracidin analogues with altered halogenation patterns produced by genetically engineered strains of Streptomyces fungicidicus[J].J Nat Pro,2010,73(4):583-589.

[12]KOJIRI K,NAKAJIMA S,FUSA A,et al.BE-24566B,a new antibiotic produced byStreptomyces violaceusniger[J].J Antibiot,1995,48(12): 1506-1508.

[13]田延軍，張家祥，楊麗萍，等.黑曲霉SFGT601產葡萄糖酸鈉發酵培養基及工藝條件的研究[J].中國釀造，2015，34（1）：89-93.

[14]孫健，馬吉勝，金瑾，等.黃連解毒湯各成分的HPLC-UV/MS定性與定量測定方法研究[J].藥學學報，2006，41（4）：380-384.

[15]LU Y,YUE C,SHAO M,et al.Molecular genetic characterization of an anthrabenzoxocinones gene cluster inStreptomycessp.FJS31-2 for the biosynthesis of BE-24566B and zunyimycin ale[J].Molecules,2016,21 (6):771-779.

Optimization of fermentation conditions for halogenated type II polyketides production from Streptomycessp.FJS31-2

WANG Yinyin1,2,3,WANG Miao3,QIAN Shengyan3,L Yuhong3,BAO Yuxin3,HU Yonglin4,YUE Changwu1,2,3*(1.Zunyi Key Laboratory of Genetic Diagnosis&Targeted Drug Therapy,The First People's Hospital of Zunyi City,Zunyi 563003,China; 2.The Third Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi 563003,China;3.Guizhou Key Laboratory of Microbial Resources& Drug Development,Zunyi Medical University,Zunyi 563003,China;4.Department of Clinical Laboratory Medicine,Zunyi Medical University, Zunyi 563003,China)

TakingStreptomycessp.FJS31-2 which produces zunyimycin A and BE-24566B halogenated natural compound as research object,the target compound obtained from the fermentation medium with different carbon and nitrogen sources at different culture time and extraction conditions were qualitatively and quantitatively analyzed by high resolution mass spectrum(HRMS)and high performance liquid chromatography(HPLC).Results showed when adding humic acid which soaked in the basic medium with 10 g/L absolute ethyl alcohol for 24 h,the target compound yield could be improved by ethyl acetate extraction at 17 d.

Streptomycetessp.;zunyimycin A;fermentation conditions;optimization

Q93-3

0254-5071（2017）01-0066-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.013

2016-07-25

國家自然科學基金(31160004，31460006)；貴州省科技學技術基金項目(黔科合J字[2010]2156，黔科合J字[2012]2348，黔科合SY字[2013]3013)

王蔭蔭（1989-），女，碩士研究生，研究方向微生物與天然產物資源開發。

*通訊作者：岳昌武(1975-)，男，教授，博士，研究方向為微生物天然產物發現與生物合成。