蚌毒靈散中黃芩的整體定量分析研究

文│樊克鋒 湯法銀（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院）

孫素琴 周群（清華大學(xué)）

王新杰（北京億森寶生物科技有限公司）

蚌毒靈散中黃芩的整體定量分析研究

文│樊克鋒 湯法銀（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院）

孫素琴 周群（清華大學(xué)）

王新杰（北京億森寶生物科技有限公司）

項(xiàng)目來(lái)源：河南省青年骨干教師項(xiàng)目基金：2013GGJS-191，河南省教育廳自然基金資助項(xiàng)目“近紅外（NIR）對(duì)復(fù)方中黃芩藥材快速定量分析的研究（2008A230010）

目前，中獸藥散劑在臨床應(yīng)用中仍占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)（《獸藥典》中85%以上的中獸藥制劑仍然是散劑），其復(fù)雜多樣的化學(xué)成分及作用機(jī)理仍然無(wú)法完全明晰，這給評(píng)價(jià)中獸藥藥理藥效和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定帶來(lái)了極大的困難。目前慣用方法仍然是模仿化學(xué)藥物的質(zhì)量控制模式，即以已知單一或幾個(gè)指標(biāo)成分作為質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)單一的定性和定量分析，判斷中獸藥（復(fù)方）是否“合格”并制定非客觀質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。這樣做似乎是找到了一種合理的方法來(lái)評(píng)價(jià)中獸藥（復(fù)方）質(zhì)量，但是這種方法忽視了中獸藥的整體性和復(fù)方協(xié)同作用。所以不能簡(jiǎn)單說(shuō)其中一個(gè)或幾個(gè)成分對(duì)疾病起作用，為了更好地對(duì)中獸藥（復(fù)方）進(jìn)行全面整體的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)，本實(shí)驗(yàn)利用近紅外光譜技術(shù)和化學(xué)計(jì)量學(xué)，將中藥散劑中的某種“中藥整體”作為一個(gè)質(zhì)量指標(biāo)，即無(wú)論含有多少成分都將這種中藥材看作一個(gè)整體。這樣既避免了樣品復(fù)雜前處理對(duì)物質(zhì)造成的流失，也較好的符合了中獸醫(yī)藥整體觀，同時(shí)更適合中獸藥散劑原狀態(tài)直接“無(wú)損快速”測(cè)定。

近紅外光譜同計(jì)算機(jī)和化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合可對(duì)物質(zhì)進(jìn)行非破壞分析。如在對(duì)藥物的定量分析方面，將近紅外光譜與偏最小二乘法（PLS）、主成分分析（PCA）及非線性人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法等相結(jié)合非侵入地測(cè)量了銀杏葉片、黃連浸膏粉、元胡止痛散等中藥活性成分的含量和分布，及對(duì)甲璜酸加替沙星、頭孢氨芐膠囊、撲熱息痛片劑、甲氧芐胺嘧啶等進(jìn)行了定量分析，均取得了滿意的預(yù)測(cè)結(jié)果。

◎圖1 70份蚌毒靈散劑樣品的近紅外光譜疊加圖

◎圖2 70份蚌毒靈散劑樣品原始光譜預(yù)處理后的光譜圖

一、實(shí)驗(yàn)

1.儀器設(shè)備及測(cè)試條件。儀器設(shè)備：近紅外光譜儀采用布魯克公司的VECTOR22-NIR型傅立葉變換近紅外光譜儀，配有PbS和InGaAs檢測(cè)器、外接積分球、樣品旋轉(zhuǎn)器和固體光纖探頭；PentiumⅢPC機(jī)。

測(cè)試條件：樣品粉末分別取適量放入石英樣品杯中，分布均勻，輕輕壓平。

測(cè)樣方式：積分球漫反射；分辨率為8厘米-1；掃描次數(shù)：64次；掃描范圍：12000～4000厘米-1；溫度：20℃；空氣濕度：60%；每個(gè)樣品重復(fù)3次，求平均光譜。

2.實(shí)驗(yàn)樣品材料來(lái)源及制備方法。樣品材料來(lái)源：以2010年版《中國(guó)獸藥典》二部中“蚌毒靈散”為研究對(duì)象，處方為：黃芩60克，黃柏20克，大黃10克，大青葉10克，即主藥黃芩含量為60%，藥材飲片購(gòu)于北京同仁堂（鄭州店）。

樣品制備方法：分別取各味藥材適量，低溫干燥，取黃芩單獨(dú)粉碎100目細(xì)粉，黃柏、大黃和大青葉按處方比例混合粉碎100目細(xì)粉，備用。依據(jù)處方要求，分別精密稱量、等量遞增混合制備黃芩含量5%～70%的70份樣品，得訓(xùn)練集（用于建立模型）和預(yù)測(cè)集（評(píng)估模型的預(yù)測(cè)等能力）樣本。其編號(hào)見(jiàn)表1。

表1 黃芩不同含量70份散劑樣品編號(hào)

◎圖3 訓(xùn)練集測(cè)定值與真實(shí)值之間的相關(guān)圖（Rank:4 R2＝99.77 RMSECV＝0.963）

3.樣品近紅外光譜采集。將70份樣品粉末分別取適量放入石英樣品杯中，混合均勻，輕輕壓平，按上述測(cè)試條件進(jìn)行掃描，每個(gè)樣品重復(fù)3次，求平均光譜，70份蚌毒靈散樣品的近紅外光譜疊加見(jiàn)圖1。

4.定量校正模型的建立。

（1）光譜預(yù)處理方法的選擇。通過(guò)比較不同預(yù)處理方法對(duì)RMSECV（均方差，即交叉驗(yàn)證誤差均方根）和R2（相關(guān)系數(shù)）的影響，最終選擇了VectorNormalization（矢量歸一化）預(yù)處理的方法對(duì)70分樣品進(jìn)行建模。此時(shí)RMSECV分別為0.963；R2分別為99.77。預(yù)處理圖譜如圖2。

（2）建模譜段的選擇。選擇合適的波段對(duì)于建立定量模型來(lái)說(shuō)是非常重要的。本文以RMSECV和R2為衡量的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)選出模型最合適的波段。結(jié)果選擇波段為6102～5446厘米-1，rank＝4。

（3）樣品定量模型的建立。運(yùn)用BrukerOPUS/QUANT22定量分析軟件中PLS法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，其中60份樣品作為校正樣品集，8份樣品作為預(yù)測(cè)樣品集。訓(xùn)練集樣品通過(guò)軟件分析，36、38號(hào)樣品為建模溢出值，將其刪除后，建立模型更為準(zhǔn)確。用校正樣品集進(jìn)行內(nèi)部交叉驗(yàn)證RMSECV＝0.963，R2＝99.77（圖3），確定最佳主成分?jǐn)?shù)為4（圖4）。近紅外光譜法測(cè)得值與真實(shí)值之間的絕對(duì)誤差在±1%（圖5）。

二、結(jié)果

將前述所建立的定量校正模型用于對(duì)8份樣品進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如表2。檢驗(yàn)集預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，在黃芩的投藥量相差10%的范圍內(nèi)預(yù)測(cè)結(jié)果還是比較準(zhǔn)確的，可以成功的分出不同投藥量的樣品。

三、討論

第一，在模型建立的過(guò)程中，取樣和混合是非常重要的，藥材混合是否均勻直接影響到模型建立的好壞。為了盡量消除混合不均勻的問(wèn)題，首先在制樣時(shí)按等量遞增法混合，再者測(cè)定時(shí)從混合樣品的不同部位取樣，另外在測(cè)定過(guò)程中，采取多次測(cè)量取平均圖譜的方法，盡量消除混合不均勻和顆粒大小不均勻?qū)y(cè)量的影響。

第二，由于樣品只是添加的黃芩量多少不同，在近紅外原始光譜圖上很難看出差異。但將近紅外光譜技術(shù)與計(jì)算機(jī)技術(shù)和化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合，對(duì)原始圖譜進(jìn)行必要的預(yù)處理之后，就會(huì)在處理過(guò)的圖譜中顯示出各個(gè)樣品的不同，這種不同與化學(xué)值（稱量值）是一一對(duì)應(yīng)的。

第三，在建立模型的時(shí)候，本試驗(yàn)將黃芩作為一個(gè)整體，這是一種新的嘗試。按不同的比例投入黃芩，不再測(cè)定指標(biāo)成分黃芩苷的含量，而是將黃芩整體的投入量直接作為基礎(chǔ)值。因此訓(xùn)練集測(cè)定值與真實(shí)值之間的相關(guān)圖呈非常好的線性關(guān)系。雖然樣品的含量不是分散的而是等比例增加的，但預(yù)測(cè)結(jié)果令人滿意。

表2 檢驗(yàn)集樣品預(yù)測(cè)結(jié)果

◎圖4 訓(xùn)練集RMSECV與Rank之間的相關(guān)圖（Rank:4 R2＝99.77 RMSECV＝0.963）

◎圖5 訓(xùn)練集絕對(duì)誤差與真實(shí)值之間的相關(guān)圖（Rank:4 R2＝99.77 RMSECV＝0.963）

四、結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)將復(fù)方蚌毒靈散劑中“黃芩整體”當(dāng)作一種指標(biāo)，采用PLC法建立近紅外光譜方模型，內(nèi)部交叉驗(yàn)證RMSECV=0.963，R2=99.77，確定最佳主成分?jǐn)?shù)為4。近紅外光譜法測(cè)得值與真實(shí)值之間的絕對(duì)誤差在±1%，基本上可以分出5%～70%的樣品。通過(guò)預(yù)測(cè)值結(jié)果可以看出，樣品近紅外光譜與黃芩藥材量之間存在一定的相關(guān)性，因此將該方法用于黃芩原藥材占有量的測(cè)定基本可行，在擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)樣品集的數(shù)量后，有望獲得結(jié)果更可靠的數(shù)學(xué)模型。如果模型能夠建立就可以很方便地監(jiān)督投藥量是否合乎處方，監(jiān)督是否減少了貴重藥材的投藥量。

利用近紅外光譜技術(shù)對(duì)中藥復(fù)方中單味藥材“整體定量”進(jìn)行初步研究，嘗試了將整體藥材作為指標(biāo)性成分，建立了快速定量檢測(cè)處方中某種藥材占有量的新方法。在建立模型的時(shí)候，按不同的比例將黃芩的投入量整體直接作為基礎(chǔ)值，訓(xùn)練集測(cè)定值與真實(shí)值之間的相關(guān)圖呈非常好的線性關(guān)系，模型的建立是成功的。可以將投藥量的密度進(jìn)一步減小，建立的模型可能會(huì)更好，這種新的嘗試值得進(jìn)一步研究。