蚌毒靈散中黃芩的整體定量分析研究

文│樊克鋒 湯法銀（河南牧業經濟學院）

孫素琴 周群（清華大學）

王新杰（北京億森寶生物科技有限公司）

蚌毒靈散中黃芩的整體定量分析研究

文│樊克鋒 湯法銀（河南牧業經濟學院）

孫素琴 周群（清華大學）

王新杰（北京億森寶生物科技有限公司）

項目來源：河南省青年骨干教師項目基金：2013GGJS-191，河南省教育廳自然基金資助項目“近紅外（NIR）對復方中黃芩藥材快速定量分析的研究（2008A230010）

目前，中獸藥散劑在臨床應用中仍占絕對優勢（《獸藥典》中85%以上的中獸藥制劑仍然是散劑），其復雜多樣的化學成分及作用機理仍然無法完全明晰，這給評價中獸藥藥理藥效和質量標準制定帶來了極大的困難。目前慣用方法仍然是模仿化學藥物的質量控制模式，即以已知單一或幾個指標成分作為質量控制和評價標準，通過單一的定性和定量分析，判斷中獸藥（復方）是否“合格”并制定非客觀質量標準。這樣做似乎是找到了一種合理的方法來評價中獸藥（復方）質量，但是這種方法忽視了中獸藥的整體性和復方協同作用。所以不能簡單說其中一個或幾個成分對疾病起作用，為了更好地對中獸藥（復方）進行全面整體的質量控制和評價，本實驗利用近紅外光譜技術和化學計量學，將中藥散劑中的某種“中藥整體”作為一個質量指標，即無論含有多少成分都將這種中藥材看作一個整體。這樣既避免了樣品復雜前處理對物質造成的流失，也較好的符合了中獸醫藥整體觀，同時更適合中獸藥散劑原狀態直接“無損快速”測定。

近紅外光譜同計算機和化學計量學相結合可對物質進行非破壞分析。如在對藥物的定量分析方面，將近紅外光譜與偏最小二乘法（PLS）、主成分分析（PCA）及非線性人工神經網絡方法等相結合非侵入地測量了銀杏葉片、黃連浸膏粉、元胡止痛散等中藥活性成分的含量和分布，及對甲璜酸加替沙星、頭孢氨芐膠囊、撲熱息痛片劑、甲氧芐胺嘧啶等進行了定量分析，均取得了滿意的預測結果。

◎圖1 70份蚌毒靈散劑樣品的近紅外光譜疊加圖

◎圖2 70份蚌毒靈散劑樣品原始光譜預處理后的光譜圖

一、實驗

1.儀器設備及測試條件。儀器設備：近紅外光譜儀采用布魯克公司的VECTOR22-NIR型傅立葉變換近紅外光譜儀，配有PbS和InGaAs檢測器、外接積分球、樣品旋轉器和固體光纖探頭；PentiumⅢPC機。

測試條件：樣品粉末分別取適量放入石英樣品杯中，分布均勻，輕輕壓平。

測樣方式：積分球漫反射；分辨率為8厘米-1；掃描次數：64次；掃描范圍：12000～4000厘米-1；溫度：20℃；空氣濕度：60%；每個樣品重復3次，求平均光譜。

2.實驗樣品材料來源及制備方法。樣品材料來源：以2010年版《中國獸藥典》二部中“蚌毒靈散”為研究對象，處方為：黃芩60克，黃柏20克，大黃10克，大青葉10克，即主藥黃芩含量為60%，藥材飲片購于北京同仁堂（鄭州店）。

樣品制備方法：分別取各味藥材適量，低溫干燥，取黃芩單獨粉碎100目細粉，黃柏、大黃和大青葉按處方比例混合粉碎100目細粉，備用。依據處方要求，分別精密稱量、等量遞增混合制備黃芩含量5%～70%的70份樣品，得訓練集（用于建立模型）和預測集（評估模型的預測等能力）樣本。其編號見表1。

表1 黃芩不同含量70份散劑樣品編號

◎圖3 訓練集測定值與真實值之間的相關圖（Rank:4 R2＝99.77 RMSECV＝0.963）

3.樣品近紅外光譜采集。將70份樣品粉末分別取適量放入石英樣品杯中，混合均勻，輕輕壓平，按上述測試條件進行掃描，每個樣品重復3次，求平均光譜，70份蚌毒靈散樣品的近紅外光譜疊加見圖1。

4.定量校正模型的建立。

（1）光譜預處理方法的選擇。通過比較不同預處理方法對RMSECV（均方差，即交叉驗證誤差均方根）和R2（相關系數）的影響，最終選擇了VectorNormalization（矢量歸一化）預處理的方法對70分樣品進行建模。此時RMSECV分別為0.963；R2分別為99.77。預處理圖譜如圖2。

（2）建模譜段的選擇。選擇合適的波段對于建立定量模型來說是非常重要的。本文以RMSECV和R2為衡量的標準來選出模型最合適的波段。結果選擇波段為6102～5446厘米-1，rank＝4。

（3）樣品定量模型的建立。運用BrukerOPUS/QUANT22定量分析軟件中PLS法進行數據處理，其中60份樣品作為校正樣品集，8份樣品作為預測樣品集。訓練集樣品通過軟件分析，36、38號樣品為建模溢出值，將其刪除后，建立模型更為準確。用校正樣品集進行內部交叉驗證RMSECV＝0.963，R2＝99.77（圖3），確定最佳主成分數為4（圖4）。近紅外光譜法測得值與真實值之間的絕對誤差在±1%（圖5）。

二、結果

將前述所建立的定量校正模型用于對8份樣品進行預測，結果如表2。檢驗集預測結果顯示，在黃芩的投藥量相差10%的范圍內預測結果還是比較準確的，可以成功的分出不同投藥量的樣品。

三、討論

第一，在模型建立的過程中，取樣和混合是非常重要的，藥材混合是否均勻直接影響到模型建立的好壞。為了盡量消除混合不均勻的問題，首先在制樣時按等量遞增法混合，再者測定時從混合樣品的不同部位取樣，另外在測定過程中，采取多次測量取平均圖譜的方法，盡量消除混合不均勻和顆粒大小不均勻對測量的影響。

第二，由于樣品只是添加的黃芩量多少不同，在近紅外原始光譜圖上很難看出差異。但將近紅外光譜技術與計算機技術和化學計量學相結合，對原始圖譜進行必要的預處理之后，就會在處理過的圖譜中顯示出各個樣品的不同，這種不同與化學值（稱量值）是一一對應的。

第三，在建立模型的時候，本試驗將黃芩作為一個整體，這是一種新的嘗試。按不同的比例投入黃芩，不再測定指標成分黃芩苷的含量，而是將黃芩整體的投入量直接作為基礎值。因此訓練集測定值與真實值之間的相關圖呈非常好的線性關系。雖然樣品的含量不是分散的而是等比例增加的，但預測結果令人滿意。

表2 檢驗集樣品預測結果

◎圖4 訓練集RMSECV與Rank之間的相關圖（Rank:4 R2＝99.77 RMSECV＝0.963）

◎圖5 訓練集絕對誤差與真實值之間的相關圖（Rank:4 R2＝99.77 RMSECV＝0.963）

四、結論

本實驗將復方蚌毒靈散劑中“黃芩整體”當作一種指標，采用PLC法建立近紅外光譜方模型，內部交叉驗證RMSECV=0.963，R2=99.77，確定最佳主成分數為4。近紅外光譜法測得值與真實值之間的絕對誤差在±1%，基本上可以分出5%～70%的樣品。通過預測值結果可以看出，樣品近紅外光譜與黃芩藥材量之間存在一定的相關性，因此將該方法用于黃芩原藥材占有量的測定基本可行，在擴大標準樣品集的數量后，有望獲得結果更可靠的數學模型。如果模型能夠建立就可以很方便地監督投藥量是否合乎處方，監督是否減少了貴重藥材的投藥量。

利用近紅外光譜技術對中藥復方中單味藥材“整體定量”進行初步研究，嘗試了將整體藥材作為指標性成分，建立了快速定量檢測處方中某種藥材占有量的新方法。在建立模型的時候，按不同的比例將黃芩的投入量整體直接作為基礎值，訓練集測定值與真實值之間的相關圖呈非常好的線性關系，模型的建立是成功的。可以將投藥量的密度進一步減小，建立的模型可能會更好，這種新的嘗試值得進一步研究。