文│樊克鋒 湯法銀(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院)
孫素琴 周群(清華大學(xué))
王新杰(北京億森寶生物科技有限公司)
蚌毒靈散中黃芩的整體定量分析研究
文│樊克鋒 湯法銀(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院)
孫素琴 周群(清華大學(xué))
王新杰(北京億森寶生物科技有限公司)
項(xiàng)目來(lái)源:河南省青年骨干教師項(xiàng)目基金:2013GGJS-191,河南省教育廳自然基金資助項(xiàng)目“近紅外(NIR)對(duì)復(fù)方中黃芩藥材快速定量分析的研究(2008A230010)

目前,中獸藥散劑在臨床應(yīng)用中仍占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(《獸藥典》中85%以上的中獸藥制劑仍然是散劑),其復(fù)雜多樣的化學(xué)成分及作用機(jī)理仍然無(wú)法完全明晰,這給評(píng)價(jià)中獸藥藥理藥效和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定帶來(lái)了極大的困難。目前慣用方法仍然是模仿化學(xué)藥物的質(zhì)量控制模式,即以已知單一或幾個(gè)指標(biāo)成分作為質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),通過(guò)單一的定性和定量分析,判斷中獸藥(復(fù)方)是否“合格”并制定非客觀質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。這樣做似乎是找到了一種合理的方法來(lái)評(píng)價(jià)中獸藥(復(fù)方)質(zhì)量,但是這種方法忽視了中獸藥的整體性和復(fù)方協(xié)同作用。所以不能簡(jiǎn)單說(shuō)其中一個(gè)或幾個(gè)成分對(duì)疾病起作用,為了更好地對(duì)中獸藥(復(fù)方)進(jìn)行全面整體的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià),本實(shí)驗(yàn)利用近紅外光譜技術(shù)和化學(xué)計(jì)量學(xué),將中藥散劑中的某種“中藥整體”作為一個(gè)質(zhì)量指標(biāo),即無(wú)論含有多少成分都將這種中藥材看作一個(gè)整體。這樣既避免了樣品復(fù)雜前處理對(duì)物質(zhì)造成的流失,也較好的符合了中獸醫(yī)藥整體觀,同時(shí)更適合中獸藥散劑原狀態(tài)直接“無(wú)損快速”測(cè)定。
近紅外光譜同計(jì)算機(jī)和化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合可對(duì)物質(zhì)進(jìn)行非破壞分析。如在對(duì)藥物的定量分析方面,將近紅外光譜與偏最小二乘法(PLS)、主成分分析(PCA)及非線性人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法等相結(jié)合非侵入地測(cè)量了銀杏葉片、黃連浸膏粉、元胡止痛散等中藥活性成分的含量和分布,及對(duì)甲璜酸加替沙星、頭孢氨芐膠囊、撲熱息痛片劑、甲氧芐胺嘧啶等進(jìn)行了定量分析,均取得了滿意的預(yù)測(cè)結(jié)果。

◎圖1 70份蚌毒靈散劑樣品的近紅外光譜疊加圖

◎圖2 70份蚌毒靈散劑樣品原始光譜預(yù)處理后的光譜圖
1.儀器設(shè)備及測(cè)試條件。儀器設(shè)備:近紅外光譜儀采用布魯克公司的VECTOR22-NIR型傅立葉變換近紅外光譜儀,配有PbS和InGaAs檢測(cè)器、外接積分球、樣品旋轉(zhuǎn)器和固體光纖探頭;PentiumⅢPC機(jī)。
測(cè)試條件:樣品粉末分別取適量放入石英樣品杯中,分布均勻,輕輕壓平。
測(cè)樣方式:積分球漫反射;分辨率為8厘米-1;掃描次數(shù):64次;掃描范圍:12000~4000厘米-1;溫度:20℃;空氣濕度:60%;每個(gè)樣品重復(fù)3次,求平均光譜。
2.實(shí)驗(yàn)樣品材料來(lái)源及制備方法。樣品材料來(lái)源:以2010年版《中國(guó)獸藥典》二部中“蚌毒靈散”為研究對(duì)象,處方為:黃芩60克,黃柏20克,大黃10克,大青葉10克,即主藥黃芩含量為60%,藥材飲片購(gòu)于北京同仁堂(鄭州店)。
樣品制備方法:分別取各味藥材適量,低溫干燥,取黃芩單獨(dú)粉碎100目細(xì)粉,黃柏、大黃和大青葉按處方比例混合粉碎100目細(xì)粉,備用。依據(jù)處方要求,分別精密稱量、等量遞增混合制備黃芩含量5%~70%的70份樣品,得訓(xùn)練集(用于建立模型)和預(yù)測(cè)集(評(píng)估模型的預(yù)測(cè)等能力)樣本。其編號(hào)見(jiàn)表1。

表1 黃芩不同含量70份散劑樣品編號(hào)

◎圖3 訓(xùn)練集測(cè)定值與真實(shí)值之間的相關(guān)圖(Rank:4 R2=99.77 RMSECV=0.963)
3.樣品近紅外光譜采集。將70份樣品粉末分別取適量放入石英樣品杯中,混合均勻,輕輕壓平,按上述測(cè)試條件進(jìn)行掃描,每個(gè)樣品重復(fù)3次,求平均光譜,70份蚌毒靈散樣品的近紅外光譜疊加見(jiàn)圖1。
4.定量校正模型的建立。
(1)光譜預(yù)處理方法的選擇。通過(guò)比較不同預(yù)處理方法對(duì)RMSECV(均方差,即交叉驗(yàn)證誤差均方根)和R2(相關(guān)系數(shù))的影響,最終選擇了VectorNormalization(矢量歸一化)預(yù)處理的方法對(duì)70分樣品進(jìn)行建模。此時(shí)RMSECV分別為0.963;R2分別為99.77。預(yù)處理圖譜如圖2。
(2)建模譜段的選擇。選擇合適的波段對(duì)于建立定量模型來(lái)說(shuō)是非常重要的。本文以RMSECV和R2為衡量的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)選出模型最合適的波段。結(jié)果選擇波段為6102~5446厘米-1,rank=4。
(3)樣品定量模型的建立。運(yùn)用BrukerOPUS/QUANT22定量分析軟件中PLS法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,其中60份樣品作為校正樣品集,8份樣品作為預(yù)測(cè)樣品集。訓(xùn)練集樣品通過(guò)軟件分析,36、38號(hào)樣品為建模溢出值,將其刪除后,建立模型更為準(zhǔn)確。用校正樣品集進(jìn)行內(nèi)部交叉驗(yàn)證RMSECV=0.963,R2=99.77(圖3),確定最佳主成分?jǐn)?shù)為4(圖4)。近紅外光譜法測(cè)得值與真實(shí)值之間的絕對(duì)誤差在±1%(圖5)。
將前述所建立的定量校正模型用于對(duì)8份樣品進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果如表2。檢驗(yàn)集預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,在黃芩的投藥量相差10%的范圍內(nèi)預(yù)測(cè)結(jié)果還是比較準(zhǔn)確的,可以成功的分出不同投藥量的樣品。
第一,在模型建立的過(guò)程中,取樣和混合是非常重要的,藥材混合是否均勻直接影響到模型建立的好壞。為了盡量消除混合不均勻的問(wèn)題,首先在制樣時(shí)按等量遞增法混合,再者測(cè)定時(shí)從混合樣品的不同部位取樣,另外在測(cè)定過(guò)程中,采取多次測(cè)量取平均圖譜的方法,盡量消除混合不均勻和顆粒大小不均勻?qū)y(cè)量的影響。
第二,由于樣品只是添加的黃芩量多少不同,在近紅外原始光譜圖上很難看出差異。但將近紅外光譜技術(shù)與計(jì)算機(jī)技術(shù)和化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合,對(duì)原始圖譜進(jìn)行必要的預(yù)處理之后,就會(huì)在處理過(guò)的圖譜中顯示出各個(gè)樣品的不同,這種不同與化學(xué)值(稱量值)是一一對(duì)應(yīng)的。
第三,在建立模型的時(shí)候,本試驗(yàn)將黃芩作為一個(gè)整體,這是一種新的嘗試。按不同的比例投入黃芩,不再測(cè)定指標(biāo)成分黃芩苷的含量,而是將黃芩整體的投入量直接作為基礎(chǔ)值。因此訓(xùn)練集測(cè)定值與真實(shí)值之間的相關(guān)圖呈非常好的線性關(guān)系。雖然樣品的含量不是分散的而是等比例增加的,但預(yù)測(cè)結(jié)果令人滿意。

表2 檢驗(yàn)集樣品預(yù)測(cè)結(jié)果

◎圖4 訓(xùn)練集RMSECV與Rank之間的相關(guān)圖(Rank:4 R2=99.77 RMSECV=0.963)

◎圖5 訓(xùn)練集絕對(duì)誤差與真實(shí)值之間的相關(guān)圖(Rank:4 R2=99.77 RMSECV=0.963)
本實(shí)驗(yàn)將復(fù)方蚌毒靈散劑中“黃芩整體”當(dāng)作一種指標(biāo),采用PLC法建立近紅外光譜方模型,內(nèi)部交叉驗(yàn)證RMSECV=0.963,R2=99.77,確定最佳主成分?jǐn)?shù)為4。近紅外光譜法測(cè)得值與真實(shí)值之間的絕對(duì)誤差在±1%,基本上可以分出5%~70%的樣品。通過(guò)預(yù)測(cè)值結(jié)果可以看出,樣品近紅外光譜與黃芩藥材量之間存在一定的相關(guān)性,因此將該方法用于黃芩原藥材占有量的測(cè)定基本可行,在擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)樣品集的數(shù)量后,有望獲得結(jié)果更可靠的數(shù)學(xué)模型。如果模型能夠建立就可以很方便地監(jiān)督投藥量是否合乎處方,監(jiān)督是否減少了貴重藥材的投藥量。
利用近紅外光譜技術(shù)對(duì)中藥復(fù)方中單味藥材“整體定量”進(jìn)行初步研究,嘗試了將整體藥材作為指標(biāo)性成分,建立了快速定量檢測(cè)處方中某種藥材占有量的新方法。在建立模型的時(shí)候,按不同的比例將黃芩的投入量整體直接作為基礎(chǔ)值,訓(xùn)練集測(cè)定值與真實(shí)值之間的相關(guān)圖呈非常好的線性關(guān)系,模型的建立是成功的。可以將投藥量的密度進(jìn)一步減小,建立的模型可能會(huì)更好,這種新的嘗試值得進(jìn)一步研究。