固定化酶新技術
——釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶技術

孔軍，李子杰，中西秀樹，高曉冬

(江南大學 生物工程學院糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

固定化酶新技術
——釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶技術

孔軍，李子杰，中西秀樹，高曉冬*

(江南大學 生物工程學院糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

隨著固定化酶技術的日新月異，微膠囊技術得到了長足的發展。與傳統微膠囊生產技術不同，文章介紹了一種“天然的”微膠囊固定化酶生產新技術——釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶技術，詳述了該固定化技術原理及實例。該技術優點在于：固定化酶的組裝“自然”完成，具有天然抗逆性，大小均一，可重復使用，綠色環保，可實現多種酶的共同固定。最后，對其應用前景進行了展望。

固定化酶；微膠囊技術；釀酒酵母孢子固定化酶；“一孢多酶”法

固定化酶技術已成為酶工程研究的重點和熱點之一。與游離酶相比，固定化酶提高了酶的穩定性，并使酶能夠反復回收利用。微膠囊技術推動了固定化酶的廣泛應用。微膠囊固定化酶采用高分子材料將酶包裹在介質周圍形成微小顆粒，被包裹的物質稱為囊心或芯材，壁殼稱為囊壁或壁材[1]。微膠囊固定化酶能夠提供一種特定的反應微環境，使反應物或產物選擇性進入或釋出[2]。微膠囊固定化酶最大的特色在于其能將囊內和囊外空間隔離，提高了酶的穩定性，并且可對囊內外的物理化學性質進行有效調控。如今該技術已廣泛應用于食品、醫藥、化妝品、化工、紡織、生物、農業等領域[3]。然而傳統的微膠囊固定化酶技術不足之處在于：純酶和載體的準備以及對組裝設備的依賴增加了生產成本，尤其是對產量要求不大，但仍需要昂貴設備進行加工的酶微膠囊，其成本更高；微膠囊顆粒均一性欠佳，產品性能差異較大[4]；固定化過程產生有害物質[5]，給人身安全、環境等帶來隱患；等等。因而研究探索新的酶固定化技術，開發穩定、高效、生產便利的生產方式，改善微膠囊固定化酶產品性能、降低生產成本、減少生產過程中的資源消耗和環境污染等，是微膠囊固定化酶技術的主要研究內容，符合當今工業綠色環保、可持續發展的要求[6-7]。

對于釀酒酵母孢子的研究很早之前就有報道，但是將孢子應用于酶的固定化卻鮮有報道。近些年來，隨著對釀酒酵母孢子的深入研究[8-9]，孢子的應用領域逐步得到拓寬，釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶(Saccharomycescerevisiaespore microencapsulated enzyme)技術應運而生。該技術是利用基因工程技術，將可溶性分泌蛋白(即目標酶類)基因在孢子中進行表達，在產孢過程中實現對該蛋白的微膠囊固定化。該技術生產平臺僅需發酵設備，生產規模可根據產品需求量靈活調節。基于對釀酒酵母孢子壁結構的研究，本研究室已經成功實現了多種目標酶類的酵母孢子微膠囊固定化[10-12]。本綜述對釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶(以下簡稱孢子固定化酶)的原理、孢子的組裝過程以及孢子固定化酶的優勢進行詳細闡述，并對其應用前景進行展望。

酵母孢子固定化酶的方法主要有以下兩種：生物學方法和化學方法。殼聚糖[13]是固定化酶的常用載體，也是野生型酵母孢子壁的重要組成成分，化學方法即通過交聯劑將目標酶固定在“殼聚糖球”上，與目前常用的殼聚糖固定化酶操作基本相似；不同之處首先是利用孢子形成大小均一、性狀穩定的天然的“殼聚糖球”，然后將目標酶通過理化處理固定在“殼聚糖球”上。因此，本文對化學法孢子固定化酶的原理不做詳細闡述，僅舉例說明。生物學方法是通過基因工程技術，將需要表達的可溶性分泌類酶在孢子形成過程中直接固定在孢子壁中，形成天然的孢子固定化酶微膠囊。該技術的重要物質基礎是孢子壁中的殼聚糖層和二酪氨酸層。以下，將對孢子固定化酶技術的生物學原理及實例進行詳細闡述。

1 釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶原理

釀酒酵母二倍體細胞在營養豐富的條件下通常進行有絲分裂產生子代個體。在受到環境脅迫時，比如氮源缺乏，會迫使酵母營養細胞從有絲分裂進入減數分裂[14-18]，啟動產孢程序并最終形成一個含有4個單倍體細胞的子囊，每個單倍體細胞即為孢子。在產孢過程中，形成了前孢子膜這個特殊的膜結構，胞內的分泌系統通過重構，將可溶性分泌蛋白轉運至前孢子膜內；在前孢子膜內形成孢子壁時，可溶性分泌蛋白被保留在孢子壁內部。雖然，前孢子膜的外膜在孢子壁的組裝過程中消失，但是，成熟的孢子壁仍然能夠將可溶性分泌蛋白截留固定在壁內，這主要是由于殼聚糖層和二酪氨酸層的存在。SUDA等[19]在孢子壁完整的野生型釀酒酵母孢子內表達分泌型綠色熒光蛋白GFP時發現，其能被固定在孢子壁內；但是缺少了二酪氨酸層的dit1Δ孢子卻不能。因此，在孢子中，二酪氨酸層能夠阻擋分泌型蛋白的擴散。

釀酒酵母孢子壁包含有四種形態學上不同的結構層次，從內側到外側依次為甘露糖層(Mannan)、β-葡聚糖層(β-glucan)、殼聚糖層(Chitosan)和二酪氨酸層(Dityrosine)[9]。這4層結構的合成是以從內到外的順序依次進行的。比如，最外層二酪氨酸層的合成只有在次外層殼聚糖層合成完畢后才開始合成[20]。對于殼聚糖層缺失或其合成有嚴重缺陷的菌株，二酪氨酸層將不能合成。源于孢子壁特有的結構層次，酵母孢子具有高度的抗逆性，比如抗蛋白酶、抗有機試劑、抗熱等[21-22]，因此，在孢子將可溶性分泌蛋白固定在孢子壁的同時也將抗逆性賦予了固定在孢子壁內部的蛋白。酵母孢子產孢過程中可溶性蛋白的分泌表達機制及孢子壁的特殊結構層次，尤其是殼聚糖層和二酪氨酸層的存在是實現孢子固定化酶技術的基礎；相比于二酪氨酸層，殼聚糖層對于酶的固定更加必不可少。而釀酒酵母營養細胞細胞壁疏松，結構簡單，從內而外依次由β-葡聚糖層(β-glucan)和甘露糖層(Mannan)組成，殼聚糖含量很少，不具備二酪氨酸層，因此對可溶性分泌蛋白的固定比孢子要少很多[10]。釀酒酵母孢子壁和營養細胞細胞壁結構如圖1所示。

圖1 釀酒酵母孢子壁和營養細胞細胞壁結構Fig.1 Saccharomyces cerevisiae spore wall and vegetative cell wall structure

釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶技術指：通過分子生物學手段在孢子中表達的可溶性分泌蛋白，在被轉運至孢子外部時經過孢子壁，被孢子壁的某些層次所截留：一部分鑲嵌在殼聚糖層中，一部分被截留在葡聚糖層和二酪氨酸層之間的空間中；隨著孢子的成熟，形成了天然、均一、穩定的孢子固定化酶。同時，由于孢子壁最外層二酪氨酸層是網狀半透性膜，大分子物質如蛋白質等不能通過，而小分子物質如底物和產物等可以自由通過，底物與固定在孢子壁內部的酶蛋白結合，從而實現孢子固定化酶對底物的酶解。

2 孢子的組裝過程

在孢子的形成過程中，孢子質膜和孢子壁都是在母體細胞的細胞質以從頭合成的方式進行的[8]。孢子的形成需要2個重要的步驟：第一是前孢子膜的形成并包裹減數分裂Ⅱ期的子細胞核形成前孢子；第二是孢子壁的組裝。

2.1 前孢子膜及前孢子的形成

如圖2所示，在減數分裂Ⅱ期，在核被膜的外側對稱形成了4個紡錘極體SPB(spindle pole bodies)[23-24]。囊泡開始形成并定位在SPB的外側，在可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感蛋白受體SNARE(soluble N-ethylmaleimide- sensitive protein receptor)[25]幫助下逐漸融合，形成扁平的雙層膜結構，這個結構便是前孢子膜形成的開端。隨著減數分裂Ⅱ期核分裂的進行，囊泡不斷地融入雙層膜結構，最終擴大并包裹各自的子細胞核。核分裂完成后，雙層膜最終將各自的細胞核和部分母細胞中的細胞質封閉在內部。這樣在原來的母細胞中，最終形成含有四個前孢子的子囊。在每個核外部形成的雙層膜結構稱之為前孢子膜[23-24, 26]。

圖2 前孢子膜的形成Fig.2 Formation of prosproe membrane

2.2 孢子壁的組裝

孢子壁的組裝即在前孢子膜雙層膜之間的內腔填充孢子壁材料，該過程的起始發生在雙成膜結構的內腔[27]。在填充孢子壁的過程中，前孢子膜包裹的部分細胞質進行蛋白質的合成和分泌，可溶性分泌蛋白經過前孢子膜分泌到孢子壁外側。在反饋機制的協調作用下，孢子壁從內而外依層組裝，只有靠內的一層完成組裝后，靠外的一層才開始組裝(圖3)：首先是最內層甘露糖層，其次為β-葡聚糖層，再次為殼聚糖層，最后為二酪氨酸層[20]。一旦組裝完成，孢子壁便賦予孢子一系列抗逆性能[28]。

圖3 孢子壁的組裝Fig.3 Assembly of yeast spore wall

2.2.1 孢子壁合成的起始

孢子壁合成起始所必需的基因一般被認為是GIP1基因，同時有學者發現AMA1基因也是孢子壁合成起始所必需的[29-31]。和GIP1的突變相似，AMA1突變后將導致孢子壁無法合成[32-33]。研究表明，AMA1可能在孢子壁形成的起始和減數第二次分裂完成的銜接中起協調作用。

2.2.2 甘露糖層和β-葡聚糖層的形成

前孢子膜閉合之后，分泌性囊泡將甘露糖蛋白運送至前孢子膜雙層膜內腔并大量積累以形成甘露糖層。

β-1,3-葡聚糖層的形成需要β-葡聚糖合成酶的參與，該酶在孢子質膜上合成β-葡聚糖鏈后將其釋放入前孢子膜的內腔，然后這些糖鏈進一步連接組裝形成β-葡聚糖層。在釀酒酵母中，該β-葡聚糖合成酶由3個亞基組成，其中，FKS1基因編碼的亞基主要在營養生長時起作用，GSC2/FKS2基因編碼的亞基主要在孢子壁組裝中起作用，Fks2是負責該層合成的主要蛋白[34]。FKS3基因編碼的亞基對孢子組裝起一定作用[35]，而fks3Δ缺陷菌株展現出孢子壁缺陷的性狀[19]。還有研究表明，多個基因對β-葡聚糖層的正常組裝都起到重要作用，如SPO77，SPS2，SPS22，CRR1，SSP2[36-39]。其中許多基因是序列簇產孢特有成員，例如，SPS2，SPS22分別與ECM33，PST1相關，CRR1與葡糖水解酶基因CRH1和CRH2相關，GAS與營養細胞壁蛋白合成基因PIR相關[40]。這些成孢特有蛋白在組裝甘露糖層和β-葡聚糖層時發揮的作用等同于相應基因在營養細胞壁構建時發揮的作用。在β-葡聚糖層組裝完畢后，前孢子膜外膜消失；雖然其具體機制尚不清楚；但是該膜的消失可以使某些孢子壁組裝因子如Osw1進入，從而形成孢子外壁[36, 39]；同時孢子裝配好甘露糖層和β-葡聚糖層后可捕獲折射光，使得孢子在光學顯微鏡下可見。

2.2.3 殼聚糖層的形成

β-葡聚糖層組裝完成后，孢子進行殼聚糖(脫乙酰幾丁質)層的合成。殼聚糖聚合物的自組裝與β-葡聚糖類似，首先幾丁質合酶CSⅢ催化亞基Chs3p將幾丁質(β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖單體)兩兩結合形成聚合物，輸送至孢子質膜外；此時存在于孢子壁中的特異性脫乙酰酶Cda1p和Cda2p將其脫乙酰化，形成殼聚糖(β-1,4-氨基葡萄糖)[41-43]。營養細胞中變構調節蛋白Chs4p作為幾丁質合酶的正向調控蛋白，在產孢過程中其功能被同源的Shc1所取代[44]。一旦殼聚糖聚合物形成，則被精確定位到孢子壁中，定位相關基因至少包括MUM3和OSW1；Mum3蛋白與酰基轉移酶同源，這可能與孢子壁組裝的催化機制一致[45]，然而Mum3蛋白的功能尚不明確；Osw1蛋白定位在孢子壁中，并可能直接參與殼聚糖層的組裝[36, 39]。同時由于殼聚糖在包裹孢子的過程中形成分支后與相鄰孢子的殼聚糖連接，因此在殼聚糖層形成的過程中，孢子橋連形成[32]；即使將子囊膜去除，由于這種橋連的存在，4個孢子仍然連接在一起。

2.2.4 二酪氨酸層的形成

該層既不是由糖類組成，也不是由蛋白質組成，而是由含量大約為50%的非肽類N,N-二甲酰基二酪氨酸組成[46-47]；然而其他成分以及二酪氨酸單體如何定位在孢子壁上仍然未知。該層的形成分為兩步：首先是二酪氨酸的形成，其次是二酪氨酸的轉運及定位。位于孢子基質中的DIT1和DIT2基因參與二酪氨酸的形成[48]。首先具有甲酰基轉移酶活性的Dit1p，將甲基轉移至L-酪氨酸上；作為細胞色素P450家族成員的Dit2p將2個N-甲基-酪氨酸的苯環連接在一起[48]形成二酪氨酸。新合成的二酪氨酸在ATP依賴的、位于前孢子膜上的轉運蛋白Dtr1p的作用下由孢子胞質運送至孢子壁進行組裝[49]。像前幾層的合成一樣，二酪氨酸需要在胞外酶的作用下組裝為聚合體的形式，但是對這些酶的具體功能還有待研究。

形成的二酪氨酸層網狀孔徑大小、松散程度可以通過某些基因的突變進行調節，如OSW2基因的敲除，使得二酪氨酸層孔徑增大。對于缺失了二酪氨酸層的dit1Δ孢子和同時缺失了二酪氨酸層與殼聚糖層的chs3Δ孢子，可溶性蛋白則滲漏到孢子壁外部的子囊胞質中[19]。以上突變，對孢子固定化酶酶學性質改進提供了物質基礎。

3 釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶實例

根據不同的實驗要求，本研究室已利用酵母孢子固定化酶技術成功地固定了多種可溶性酶，下面的實例中將分別予以介紹。

3.1 酵母孢子固定化酶的成功先例——釀酒酵母孢子微膠囊固定化α-半乳糖苷酶

施李兵等[10]為了研究二酪氨酸層對于α-半乳糖苷酶的固定是否必需及其在孢子中的定位情況，將α-半乳糖苷酶(MEL1基因編碼)與紅色熒光蛋白RFP在孢子中進行融合表達。在此之前，研究者首先將RFP連接在信號肽C端構建spRFP融合蛋白，并在不同孢子突變體上進行表達(孢子固定化酶生物法)：釀酒酵母野生型孢子(孢子壁完整)、osw2Δ孢子(二酪氨酸層疏松)和dit1Δ孢子(不含有二酪氨酸層)。通過熒光共定位發現：野生型孢子由于二酪氨酸層的存在，在孢子壁邊緣有清晰的紅色熒光輪廓；osw2Δ孢子的二酪氨酸層雖然有一定程度的缺陷，但孢子壁周圍仍具有較強的清晰紅色熒光；dit1Δ缺陷型孢子由于不含有二酪氨酸層，RFP不能被固定在孢子壁上，因此彌散在子囊胞質中，從而證實二酪氨酸層能夠作為“擴散屏障”阻止可溶性蛋白的擴散。

隨后，研究者為了證明殼聚糖層在孢子固定化α-半乳糖苷酶中的作用，將α-半乳糖苷酶與RFP在孢子中進行融合表達。與單獨表達RFP的結果一致，野生型孢子和osw2Δ孢子均能夠將融合蛋白表達定位在孢子壁上；但值得注意的是，與單獨表達RFP不同，dit1Δ孢子表達的α-半乳糖苷酶-RFP融合蛋白也能夠定位在孢子壁上；而chs3Δ孢子(不含有二酪氨酸層和殼聚糖層)表達的融合蛋白不能表達定位在孢子壁上。說明對于α-半乳糖苷酶，不需要二酪氨酸層的存在，殼聚糖層就可以將該酶表達定位在孢子壁上。

研究者為了確定最優的表達固定體系，對不同突變株固定的α-半乳糖苷酶的活性進行檢測。同野生型孢子和osw2Δ孢子相比，dit1Δ孢子表達的α-半乳糖苷酶的活性最高，可能的原因是由于“擴散屏障”二酪氨酸層的缺失，使得底物更易于與酶接觸發生反應；osw2Δ孢子表達的α-半乳糖苷酶的活性比野生型高，可能的原因是osw2Δ孢子的二酪氨酸層較野生型松散、孔徑更大，底物更容易穿過二酪氨酸層與酶接觸發生反應。

雖然dit1Δ孢子表達的α-半乳糖苷酶的活性最高，但由于“擴散屏障”二酪氨酸層的缺失，導致dit1Δ孢子表達固定的α-半乳糖苷酶更易釋放。為了驗證這種可能性，對各種突變體孢子用含有去污劑的高鹽溶液(0.6 mol/L NaCl和0.1% Triton X-100)進行洗滌，然后測定洗滌后的活性。結果顯示：同野生型孢子和osw2Δ孢子相比，dit1Δ孢子表達的酶活下降得最為明顯；又經過4次洗滌，dit1Δ孢子表達的酶活下降了約50%，wt孢子和osw2Δ孢子表達的酶活下降了約25%。由此可以說明，二酪氨酸層的存在對于阻止α-半乳糖苷酶從孢子壁上的釋放起到重要作用。

為了研究孢子固定化α-半乳糖苷酶對蛋白酶的抗逆性，使用蛋白酶K對不同孢子壁缺陷型孢子固定化α-半乳糖苷酶進行處理，并以釀酒酵母營養細胞分泌到培養基中并濃縮的α-半乳糖苷酶作為對照。結果顯示：野生型孢子和osw2Δ孢子固定的α-半乳糖苷酶對蛋白酶K展現出很強的抗逆性。這是由于：二酪氨酸層作為“擴散屏障”只能允許小分子物質(如底物和產物)通過，不允許大分子物質(如蛋白酶K、固定在孢子壁中的酶)通過。蛋白酶K與α-半乳糖苷酶隔離，從而展現出抗蛋白酶K降解的能力；dit1Δ孢子固定的α-半乳糖苷酶經蛋白酶K處理后，雖然酶活下降較野生型和osw2Δ多，但仍有很高的相對酶活，說明殼聚糖層對α-半乳糖苷酶也有一定的保護作用；而游離的α-半乳糖苷酶由于不受到任何保護作用，經蛋白酶K處理后，相對酶活僅為35%左右。此外還發現孢子固定的α-半乳糖苷酶具有比游離酶具有更高的溫度耐受性；同時，經多次洗滌后，孢子固定化酶殘留酶活仍然很高。

3.2 釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶在稀少糖合成中的應用

以葡萄糖為底物，在木糖異構酶(XI)和D-阿洛酮糖-3-差向異構酶(DPE)的聯合作用下合成具有廣泛應用前景的D-阿洛酮糖(Psicose)是目前稀少糖研究的重點。為避免直接使用游離酶，本研究室李子杰和李毅[12]利用生物法和化學法兩種方法對木糖異構酶和D-阿洛酮糖-3-差向異構酶進行了孢子固定化。在生物法的研究中，將XI與GFP在孢子中進行融合表達，通過GFP的熒光定位來確定XI在孢子中的定位。對于野生型孢子和osw2Δ孢子，能夠清晰地看到GFP綠色熒光信號完好地包裹在孢子壁上，說明XI成功地固定在了孢子壁上。相對于野生型孢子和osw2Δ孢子，dit1Δ孢子由于二酪氨酸層的缺失導致GFP信號強度稍弱，但仍可以觀察到融合蛋白表達定位到孢子壁上。為了確定XI在孢子上是否具有催化活性，通過HPLC檢測固定化XI將D-葡萄糖轉化為D-果糖的能力。結果顯示，底物D-葡萄糖在孢子固定化酶的催化作用下可以轉化為D-果糖。之后對不同孢子壁缺陷型孢子固定化XI進行了酶活比較、重復利用率、最適溫度和最適pH等實驗，結果與施李兵研究相似，osw2Δ孢子是較野生型和dit1Δ孢子最適合用于固定化酶的載體。值得注意的是，野生型和osw2Δ孢子固定化酶在95℃高溫下的相對酶活都能達到最高酶活的60%。綜合考慮，孢子壁中二酪氨酸層的存在，一方面能有效地阻止酶的釋放，另一方面提高了酶對高溫的耐受性。

在化學法固定化酶的研究中，李毅[50]用缺少了二酪氨酸層的殼聚糖球-dit1Δ孢子作為固定化載體，對D-阿洛酮糖-3-差向異構酶進行了固定化研究。結果顯示，孢子殼聚糖球固定化的D-阿洛酮糖-3-差向異構酶展現出較游離酶更廣闊的溫度和pH耐受區間。在重復利用8次后，相對酶活仍然高達80%。最后，又利用一鍋兩酶法進行了實驗：首先利用osw2Δ孢子固定的木糖異構酶將D-葡萄糖轉化成D-果糖，然后利用dit1Δ孢子固定的D-阿洛酮糖-3-差向異構酶將D-果糖轉化成D-阿洛酮糖。通過工藝的改進，最終使得阿洛酮糖的轉化率達到12%，比利用游離酶高出2倍。至此，利用酵母孢子固定化酶并進行生產已經在實驗室水平取得成功。

在以上2個實例中，研究者均以營養細胞為對照，通過檢測帶有RFP或GFP標簽的目的蛋白在孢子中的定位，證實了酵母孢子可以將可溶性分泌蛋白表達固定在孢子壁中；有學者利用酵母營養細胞進行酶的固定化[51]，但相對于細胞壁簡單的營養型細胞，孢子固定的酶量更多[10]。同時，為了比較不同孢子壁缺陷型孢子固定化酶量高低，將帶有3×HA標簽的目的蛋白在相應孢子中表達。野生型孢子和osw2Δ孢子表現出相對于dit1Δ更高的酶固定量，這與在dit1Δ孢子中表達的MEL1-RFP或GFP-XI融合蛋白熒光信號較弱相一致，說明二酪氨酸層的存在一定程度上阻止了酶的泄漏。二酪氨酸層作為保護屏障，可以保護固定在孢子壁中的酶免受蛋白酶的降解，在研究中也得到了證實[10]。之后對固定在孢子壁內部的酶的催化活性進行了確認，并對不同孢子壁缺陷菌株固定化酶的酶學性質進行了研究。總之，以上兩個實驗從各個方面證明了酵母孢子微膠囊固定化酶的可行性。

3.3 酵母孢子固定化酶的優點

通過酵母孢子固定化原理及已有實驗結果可以看出，該方法的優點在于酶的固定化“自然”完成，具有天然抗逆性，大小均一，可重復使用，綠色環保，可實現1個孢子對多個酶共同固定：

(1)成本低廉：酵母孢子固定化酶隨著孢子的形成而“自然”完成，只要在孢子內部表達所需固定化酶的基因，便可得到孢子固定化酶微膠囊；無需考慮芯材和壁材的兼容性，避免了對純酶、固定化材料和組裝設備的依賴，降低了生產成本；不需要理化過程介入，避免了理化處理對產品性能的影響；生產平臺僅需發酵設備，生產規模可根據產量要求靈活調節；

(2)抗逆性強：由于酵母孢子壁的特殊結構層次，其較強的天然抗逆性可以保護固定在其中的酶抵抗外界不利條件的影響；

(3)產品質量均一：酵母產孢為嚴格的自然生理過程，因此，孢子固定化酶微膠囊大小一致，性狀穩定；

(4)生產簡便：孢子一經產出無需純化，便于產品與酶的分離，可重復使用；

(5)安全：酵母產孢過程為自然生理過程，生產過程能耗低、污染少，產品作為生物質可自然降解，綠色環保。

(6)“一孢多酶”體系初步建立：筆者已成功將肌酐降解酶系中的2種酶共表達、固定在同一孢子內部。實驗證實，“一孢兩酶”法是可行的，較分別固定后再聯合使用表現出更優越的酶學性能。下一步，筆者將對“一孢三酶”法進行研究。

“一孢多酶法”是本研究室目前正在進行的酵母孢子固定化酶研究項目之一，目的是實現多酶體系的孢子微膠囊固定化，即在一個孢子內部同時表達、固定兩種或兩種以上的酶。對于共表達雙酶體系的優點，有報道[51-52]稱：2種酶的共表達在空間上十分接近，形成的微環境利于第二種酶與第一種酶解產物的迅速結合，節省了第一種酶酶解產物擴散到第二種酶的時間，并為第二種酶解反應提供持續的底物濃度。有學者實現了D-葡糖異構酶和D-阿洛酮糖異構酶在大腸桿菌中的共表達[53]，且產率達到16%。在肌酐檢測中，肌酐經肌酐酶水解為肌酸，肌酸被肌酸酶水解為肌氨酸和尿素，肌氨酸被肌氨酸氧化酶水解產生雙氧水，通過檢測雙氧水的生成量來確定肌酐的濃度[54-55]。目前，筆者已將“一孢兩酶法”成功應用到肌酸酶和肌酐酶在孢子壁中的共表達、固定，這為“一孢多酶法”的研究和肌酐檢測試劑盒的研發打下理論基礎。屆時，酵母孢子對多酶體系的微膠囊固定化將成為另一優勢。

4 討論與展望

截止目前，本研究室已經成功地將多種固定在釀酒酵母孢子中，為孢子微膠囊固定化酶的應用奠定了堅實的理論和實踐基礎。綜合考察酵母孢子對不同酶的固定化效果后不難發現：各突變株孢子中，dit1Δ孢子固定化酶活性最高，但是經反復使用后其酶活下降較快，不宜重復使用；這是由于dit1Δ的孢子壁缺失最外層二酪氨酸層，導致一部分固定不牢固的酶失去擴散屏障而損失，同時抗逆性能減弱。而osw2Δ的酶活雖然比dit1Δ略低，但其經過反復使用后仍有較高的酶活；而且，osw2Δ比dit1Δ抗逆性更強，比如經蛋白酶K、SDS處理后殘留酶活更高，對溫度、pH的耐受性更強；這是由于該突變株受到二酪氨酸層保護，同時osw2Δ孢子壁的二酪氨酸層網孔較野生型松散，增加了底物與固定化酶的結合機會。因此，osw2Δ孢子是比較理想的固定化酶載體。因此，通過調節二酪氨酸層孔徑大小，開發固定化酶性能優于osw2Δ的酵母孢子突變株是該研究的下一個目標。

目前，本研究室利用酵母孢子固定化技術正在進行的研究項目有：肌酸酶和肌酐酶的固定化，以期開發肌酐檢測用試劑盒；固定化稀有糖酶，用于功能性稀有糖的生產；其他研究項目，如腸胃道給藥載體的研究。雖然人的腸胃道環境和果蠅不同，但是孢子的抗逆性使其可以穿過果蠅腸胃道[56]，這為利用孢子的強抗逆性開發一般藥物難以到達的腸胃道中末端藥物提供了思路。因此，將孢子微膠囊固定化酶用于藥用試劑盒和功能性藥物的研發具有極大的潛力。

在研究酵母孢子固定化酶的同時，我們發現：由于殼聚糖具有吸附性的特點，作為殼聚糖球的dit1Δ孢子可以吸附金屬離子和負電性化合物。例如，本研究室張海妮[11]將二酪氨酸層缺失的dit1Δ孢子用作殼聚糖球，用來吸附Cu2+，并與孢子壁完整的野生型和同時缺失二酪氨酸層和殼聚糖層的chs3Δ孢子進行比較。結果顯示，作為殼聚糖球的dit1Δ孢子，吸附Cu2+能力最強；其次是孢子壁完整的野生型；而缺失了二酪氨酸層和殼聚糖層的chs3Δ孢子吸附Cu2+能力最弱。之后，又對孢子吸附Cr3+、Ni2+、Zn2+、Cd2+、Pb2+等離子的能力進行了研究。同樣，作為殼聚糖球的dit1Δ孢子，對各種離子的吸附量是所有細胞類型中最高的，而營養細胞是最低的；即便是缺失了最外2層的chs3Δ孢子，其吸附量也是營養細胞的2倍多。由此說明，缺失了二酪氨酸層的dit1Δ孢子作為殼聚糖球用于重金屬離子的吸附是最佳選擇。同時，由于殼聚糖帶正電，又對作為殼聚糖球的dit1Δ孢子吸附帶有負電荷的牛磺膽酸能力進行研究。與吸附金屬離子結果相似，dit1Δ孢子吸附牛黃膽酸能力優于野生型孢子和chs3Δ孢子。上述兩個實驗說明dit1Δ孢子作為殼聚糖球對重金屬及某些負電荷分子的吸附是可行的。該研究將釀酒酵母孢子的應用從固定化酶領域進一步拓展到了環保領域，為釀酒酵母孢子的應用開拓了道路。

綜上所述，除了對孢子吸附能力的研究外，本實驗室對于酵母孢子固定化酶的研究是酵母孢子應用研究的重點。隨著微膠囊固定化酶技術的發展，釀酒酵母孢子固定化酶作為微膠囊固定化酶技術的新成員，以其獨特的優點首次展現在大家面前：固定化酶的組裝“自然”完成，具有天然抗逆性，大小均一，可重復使用，綠色環保，“一孢多酶體系”已經初步建立，等等。基于以上優點及研究結果，相信，酵母孢子固定化酶將會為酶的微膠囊固定化增光添彩！

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A novel way for enzyme immobilization——Saccharomycescerevisiaespore microencapsulated enzyme

KONG Jun, LI Zi-jie, Nakanishi Hideki, GAO Xiao-dong

(Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry & Biotechnology Ministry of Education,Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The technologies for enzyme microencapsulation are making great progress due to development of enzyme immobilization. A novel way encapsulating enzymes “naturally” is introduced herein, i.e.,Saccharomycescerevisiaespore microencapsulated enzyme. Principles and example of this method s are exposed to readers. There are many advantages such as unnecessary preparation of core materials and wall materials, natural assembly of spore microcapsule is, without physicochemical treatment, no rely on expensive production equipments, strong stress resistance, easily manufacture, uniform and stable size. Finally, the application the yeast spore encapsulated enzyme in future was prospected herein.

immobilized enzyme; microencapsulation;Saccharomycescerevisiaespore encapsulated enzyme; “colocalization of multiple enzymes in one spore” skill

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701043

博士研究生(高曉冬教授為通訊作者,E-mail: xdgao@jiangnan.edu.cn)。

2015年國家自然科學基金(21576118)

2016-05-31，改回日期：2016-06-27