白肉枇杷白蘭地原酒發酵條件優化

趙欠，王巧碧，袁敏，周才瓊

(西南大學 食品科學學院暨重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400716)

白肉枇杷白蘭地原酒發酵條件優化

趙欠，王巧碧，袁敏，周才瓊*

(西南大學 食品科學學院暨重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400716)

采用西南大學具有自主知識產權的“華白1號”白肉枇杷為實驗材料，對枇杷白蘭地原酒發酵工藝參數進行了優化。通過單因素實驗研究發酵溫度、糖度、酸度、菌種及含量等因素對白蘭地原酒質量的影響，并在單因素實驗基礎上進行3因素3水平的響應面優化實驗，確定最優的發酵條件。發酵結果表明，0.1%的菌種Y3為所選酵母中最優發酵菌種量，在pH 4.0，糖量23%，發酵溫度25 ℃時發酵質量最好，各因素對發酵品質影響的主次順序為糖量>pH>溫度，發酵白肉枇杷白蘭地原酒酒精度為12.4%，殘糖為7.5%，總酯為0.151 g/L，滴定酸為5.425 g/L。

白肉枇杷；發酵工藝；響應面優化；白蘭地原酒

枇杷原產于我國四川省大渡河中下游，在我國南方有大面積栽培[1]；全世界枇杷屬植物種類有34個，共600多個品種，其中140個具有經濟價值[2-4]。枇杷果實肉質柔軟多汁，味道鮮美可口，含有大量碳水化合物，維生素及多種礦物質[5-6]，除了富含胡蘿卜素等，還含包括山梨醇、蘋果酸和綠原酸等功能成分[7-8]，苯乙醛是枇杷鮮果中最有效的揮發性香味物質[9]。近年來，我國在枇杷的馴化改良，栽培，儲藏保存等方面進行了大量的研究[10-12]， 但現有的保藏技術不能較長時間進行保藏，且儲藏成本較高。枇杷沒有后熟過程且貯藏期較短，亟需對枇杷的加工利用進行研究[4]。本文以“華白一號”白肉枇杷為原料，采用單因素實驗和響應面優化探索枇杷白蘭地原酒釀造工藝，尋求適合枇杷白蘭地的發酵工藝，為白蘭地的蒸餾和陳釀提供技術基礎，為生產枇杷白蘭地提供優質原酒。

1 材料與設備

1.1 實驗材料及處理

白肉枇杷：西南大學農業綜合開發研究室實驗基地。白砂糖(北碚,永輝超市)。

枇杷汁制備：枇杷分選，清洗，去籽，用0.05%NaHSO3溶液護色，打漿時用0.05%NaHSO3溶液和0.01%異抗壞血酸混合護色榨汁。枇杷原汁中添加0.17 g/kg果膠酶，于40 ℃下水浴4.0 h，然后水浴鍋加熱到90 ℃滅酶15 min。得發酵用枇杷汁，出汁為率86%。

1.2 主要試劑和儀器

NaHSO3，異抗壞血酸，檸檬酸，檸檬酸鈉，NaOH，H2SO4，酚酞等均為分析純；果膠酶活力≥500 000 U/g。

惠爾普斯果蔬破壁料理機，中山市惠爾普斯電器有限公司；FA2004A電子天平，上海精天電子儀器有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海齊欣科學儀器有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母的活化[13]

稱取蔗糖5 g于250 mL燒杯中，加入100 mL蒸餾水，溶解后于電爐上加熱煮沸，冷卻至35～40 ℃。準確稱取一定量的釀酒活性干酵母，溶解于上述冷卻的蔗糖水溶液中，在40 ℃水浴鍋中靜置活化20～30 min，每10 min振蕩1次，至有大量氣泡產生時即活化完畢。

1.3.2 枇杷白蘭地原酒發酵環境單因素實驗[14]

(1)糖度的影響：取200 g枇杷汁，分別調整含糖量至19%、22%、25%、28%，pH 4.0，再取于樣液量0.05%的Y3菌種進行活化，在22 ℃下發酵7 d，檢測。

(2)pH的影響：取200 g枇杷汁于燒杯中；分別用檸檬酸鈉和檸檬酸調整pH為3.2、3.6、4.4、4.4、4.8，添加糖量至22%，再稱取于樣液量0.05%的Y3菌種進行活化，在22 ℃下發酵7 d，檢測。

(3)發酵溫度的影響：取200 g枇杷汁于燒杯中；調整含糖量為22%，pH 4.0，稱取0.05%的Y3菌種活化接種，分別在16、19、22、25、28 ℃下發酵7 d，檢測。

1.3.3 枇杷白蘭地原酒發酵中產香及產酒酵母的選擇

1.3.3.1 不同酵母菌種的影響

取200 g枇杷汁于燒杯中；調整含糖量為22%，pH 4.0，再分別稱取汁液量0.05%的Y1、Y2、Y3、Y4和Y5五種酵母菌種進行活化，在25 ℃下發酵7 d，檢測。

1.3.3.2 發酵酵母量的影響

取200 g枇杷汁于燒杯中；分別調整含糖量為22%，pH為 4.0，分別取發酵性能最好的菌種Y3量為枇杷汁的0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%進行活化，接種，在25 ℃下發酵7 d，檢測。

1.3.3.3 釀酒酵母與產香酵母結合的影響

取200 g枇杷汁于燒杯中；調整含糖量為22%，pH為4.0。再取-18 ℃保存下的產香酵母進行預處理并在25 ℃下發酵枇杷液，分別在產香酵母發酵的第0、1、2 d加入活化的Y3，發酵至無氣泡產生，測其酒精度和總酯含量。

1.3.4 響應面法優化枇杷白蘭地原酒發酵條件

在1.3.2和1.3.3試驗基礎上，設計Box-Benhnken響應面3因素3水平實驗方案，在固定發酵菌種和接種量基礎上，選擇初始pH(A)、初始糖度(B)、發酵溫度(C)為響應面優化考察因素，以酒精度(20 ℃)和總酯含量為響應值設計中心組合實驗設計，用Design-Expert8.0軟件進行數據處理以確定枇杷白蘭地原酒釀造的最佳工藝條件參數，各因素編碼及水平編碼見表1。

1.3.5 測定方法

酒精度：GB/T 15038—2006；總酸：GB/T 15038—2006；總酯：GB/T 15038—2006；殘糖量：手持折糖儀測定。

表1 響應面試驗自變量因素及水平編碼表

1.3.6 數據分析

每個樣品重復測定3次，試驗結果以 mean±SD 表示，用Origin 8.6作圖，用SPSS 19.0進行單因素方差分析及Duncan法做多重比較，分析數據間的顯著性差異，用Design-Expert8.0軟件對響應面數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 枇杷白蘭地原酒發酵環境因素單因素實驗

2.1.1 發酵糖度的影響

實驗結果如表1，隨枇杷汁糖度升高，殘糖量逐漸增加，酒精度呈現先增后略降趨勢;糖度在22%時酒精度最高，顯著高于其他各處理(P<0.05)，糖度增加酒精含量反而降低，可能與高糖抑制酵母產酒代謝有關。

圖1 不同糖度對發酵酒質的影響Fig.1 Influence on the quality of fermented wine in different sugar

2.1.2 發酵pH的影響

實驗結果如圖2，隨著發酵枇杷汁pH增加，酒精度和殘糖均呈現先增后降趨勢，酒精度在pH4.0～4.4時較高，顯著高于其他處理。滴定酸則隨著pH升高而逐漸下降，考慮一定的酸度可抑制雜菌，還能賦予基酒以良好的風味，將pH值為4.0設為最佳發酵pH值。

圖2 不同酸度對發酵酒質的影響Fig.2 Influence on the quality of fermented wine in different acidity

2.1.3 發酵溫度的影響

實驗結果如圖3，16 ℃發酵7 d后，由于溫度低，發酵不完全，酒精度低，殘糖量高。發酵溫度在19～25 ℃時，隨著溫度的升高，酒精度隨之升高。25～28 ℃下酒精度顯著高于其他溫度處理，滴定酸含量波動變化明顯?？紤]溫度過高時，釀酒酵母自身生長繁殖過快，可消耗過多糖量，易于衰老和死亡，以25 ℃為最佳發酵溫度。

圖3 不同溫度對發酵酒質的影響Fig.3 Influence on the quality of fermented wine in different temperature

圖4 不同菌種發酵期間失重量Fig.4 Lose weight in fermented time with different species

2.2 產香及產酒酵母對枇杷白蘭地原酒發酵的影響

2.2.1 不同菌種的影響

不同菌種發酵期間失重情況如圖4。Y3、Y4和Y5菌種前期發酵速度快，發酵時間短；Y1，Y2發酵時間長，前期發酵強度小。Y3在第2天失重最大，發酵在第6天完成。Y3、Y4和Y5發酵液酒精度顯著高于其他發酵菌種，滴定酸顯著低于其他菌種；殘糖量在7%～8%之間(表2)。綜合比較，選Y3為發酵酵母菌種。

2.2.2 發酵菌種接種量的影響

實驗結果如圖5示，菌種接種量對發酵液的滴定酸沒有顯著性差異(P>0.05)；接種量的0.1%～0.3%時殘糖量顯著低于0.025%～0.05%接種量的殘糖量(P<0.05)；酒精度之間差異不大，峰值則是0.1%接種量。綜合比較，菌種接種量選擇在0.1%。

表2 不同菌種對發酵酒質的影響

注：*表中的數據以平均數±SD表示，每列中的不同字母代表在0.05水平上差異顯著。

圖5 不同菌種量對發酵質量的影響Fig.5 Influence on the quality of fermented wine with different contents of species

2.2.3 產香酵母與釀酒酵母復合對發酵的影響

先取-18 ℃保存下的產香酵母進行預處理并接種發酵，分別在產香酵母發酵的第0、 1、2天加入活化的釀酒酵母Y3，發酵至無氣泡產生。結果如圖6。釀酒酵母Y3單獨發酵時酒精度最高；酯含量以產香酵母處理后第2天加入活化酵母發酵為高，但不同處理產酯量間無顯著性差異(P>0.05)。從經濟和實驗操作綜合比較，釀酒酵母Y3單獨發酵為最合適的發酵方式。

圖6 產香酵母與釀酒酵母復合的影響Fig.6 Influence on the quality of fermented wine with different combine ways of Saccharomyces cerevisiaes and fragrant grains

2.3 枇杷白蘭地原酒發酵條件的響應面優化

由以上實驗可知，選擇菌種Y3，以接種量0.1%為基礎，對枇杷白蘭地原酒發酵環境條件(pH、糖度、溫度)進行響應面優化，以A=(X-4)/0.4，B=(X-22)/3，C=(X-25)/3 為自變量, 以酒精度及酯含量為響應值進行實驗。實驗方案及結果見表3，試驗號1～12 是析因試驗，試驗號13～15 是中心試驗。15個試驗點分為析因和零點，其中析因點為自變量取值在A、B、C所構成的三維頂點；零點為區域的中心點，零點實驗重復3次，用以估計實驗誤差。多項式模型方程擬合可靠性由R2表達，統計學上的顯著性由F值檢驗。影響因素的線性效應、平方效應及其交互效應的顯著性由模型系數的P值檢驗。

表3 枇杷酒發酵的響應面試驗方案及結果

2.3.1 以酒精度為響應值的結果分析

以酒精度為響應值的精簡模型方差分析見表4，酒精度回歸方程(模型)的回歸效果極顯著，模型R2=91.93%，說明這種實驗方法可靠，使用該方程模擬真實的3因子3水平的分析是可行的。B、A2、B2對響應值酒精度的影響極顯著，說明糖度，pH是發酵酒精度生成的重要控制因素；各因素對酒精度影響的大小順序為糖度>pH >溫度，AB，AC，BC均P>0.05，表明3個因素之間無交互作用。

各因子交互作用的響應面3D圖和等值線圖見圖7～圖9。由圖可知在所選范圍內存在極值。圖7表明，溫度和pH交互作用較強；與溫度方向比較，pH效應面曲線較陡，沿溫度方向的等高線密度低于沿pH方向的等高線密度，表明溫度對酒精度的影響小于pH對酒精度的影響；在一定范圍內，當溫度達到25 ℃，pH 4.0左右時為此響應面頂點。圖8表明溫度和糖度的交互作用較強, 且與溫度方向比較，糖度效應面曲線較陡，沿溫度方向的等高線密度小于沿糖度方向的等高線密度，表明溫度對酒精度的影響小于糖度對酒精度的影響；在一定范圍內，當溫度達到24 ℃，糖度為22%左右時為此響應面頂點。圖9表明糖度和糖度的交互作用不顯著，在一定范圍內，當pH達4.0，糖度為22%左右時為此響應面頂點。

表4 響應面試驗結果的精簡模型方差分析

圖7 溫度和pH對發酵酒精度影響的響應面和等值線圖Fig.7 Three-dimensional response surface diagram and Contour plot showing the alcoholic strength influented by temperature and pH

圖8 溫度和糖度對發酵酒精度影響的響應面和等值線圖Fig.8 Three-dimensional response surface diagram and Contour plot showing the alcoholic strength influented by temperature and suger

圖9 糖度和pH對發酵酒精度影響的響應面和等值線圖Fig.9 Three-dimensional response surface diagram and Contour plot showing the alcoholic strength influented by suger and pH

根據精簡模型建立二次響應面回歸方程為:酒精度=12.06+0.095A+0.53B+0.047C-0.083AB-7.500E-003AC-0.012BC-0.61A2-0.72B2-0.12C2

2.3.2 以酯含量為響應值的結果分析

以酯含量為響應值的精簡模型方差分析見表5。由精簡模型的方差分析可知,酯含量回歸方程(模型)的回歸效果不顯著，模型R2=41.83%，說明這種方法不可靠，使用該方程模擬真實的3因子3水平的分析不可行。

因變量酒精度和酯含量經軟件Design Expert8.0優化分析可知，酒精度可作為響應值優化試驗工藝，而酯含量由于回歸效果不顯著，R2、模型P值過小，不能作為響應值優化試驗工藝。由酒精度作為響應值得到發酵實驗的最佳工藝參數：pH為4.01，糖度為22.07%，溫度為25.52 ℃，預測理論酒精度為12.17%。

為檢驗模型預測的準確性，采用得到的發酵條件進行枇杷原酒發酵的驗證實驗，同時考慮到實際操作和生產的便利，以發酵條件pH4.0，糖量22%，發酵溫度25℃進行驗證，3 次平行實驗得到的實際平均酒精度12.4%，與理論值接近。因此, 響應面法對枇杷原酒發酵條件的優化是可行的。

2.3.3 白肉枇杷白蘭地原酒主要品質指標

對影響枇杷白蘭地發酵的各因素進行優化，得到最佳的發酵條件為：0.1%的釀酒酵母Y3在pH4.0，糖量22%，發酵溫度25 ℃下發酵7 d，得到較好的枇杷白蘭地原酒。對最佳條件發酵后的枇杷白蘭地原酒進行各項指標檢測，得到：pH值為4.3，滴定酸含量為5.425 g/L，殘糖量為7.5%，酒精度為12.4%，酯含量為0.151 g/L。

表5 響應面試驗結果的精簡模型方差分析

3 討論與結論

本實驗以“華白1號”白肉枇杷為實驗材料，研究菌種及發酵環境對枇杷原酒質量的影響。對5種不同菌種發酵枇杷汁的失重量和發酵后殘糖量，酒精度和滴定酸進行檢測，找到相對適合發酵枇杷白蘭地原酒的酵母為Y3；對影響發酵質量的各因素進行優化并在單因素的基礎上進行響應面優化實驗得到發酵條件pH 4.0，糖量22%，發酵溫度25 ℃為最適合的發酵環境。采用優化工藝發酵得到的枇杷白蘭地原酒酒精度12.4%，酯含量為0.151 g/L，pH值為4.3，滴定酸含量為5.425 g/L，殘糖量為7.5%。由于已對酒精度進行單因素實驗而未對酯含量進行爬坡實驗導致酯含量作為響應面的因變量不能得到較好的回歸效果。本研究為下一步對白蘭地原酒進行蒸餾以及陳釀奠定了良好的基礎，為研究優質枇杷白蘭地的釀造提供依據。

[1] 章恢志,方德秋.中國枇杷屬種質資源及普通批把起源研究[J].園藝學報,1990,17(1):5-12.

[2] 劉國強,林志清,林文忠.我國枇杷種質資源及選育種研究進展(綜述)[J].亞熱帶植物通訊, 2000,29(2):65-70.

[3] 吳錦程.枇杷的生產與科研[J].莆田學院學報,2004,11(30):31-37.

[4] 林順權.枇杷種質資源、品種改良和成花誘導研究的一些情況[C].全國枇杷學術研討會論文集, 2004:32-33.

[5] 張玉,王建清.枇杷的營養及功能成分研究進展[J].食品科學,2005,26(9)：602-603.

[6] 胡又厘,林順權.世界枇杷研究與生產[J].世界農業, 2002, 1：18-20.

[7] 張婷婷,令楨民,趙旺生.枇杷的研究現狀和應用前景進展[J].農產品加工, 2005, 70(7)：51-53.

[8] DING C K, CHACHIN K, UEDA Y, et al.Metabolism of phenolic compounds during loquat fruit development[J].Physioligia Plantarum,2005,154(3):329-348.

[9] TAKAHASHI H, SUMITANI H, INADA Y, et al.Potent aroma volatiles in fresh loquat and its canned produet[J].Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi,2000,47(4):302-310.

[10] 陳俊偉,馮健君,秦巧平,等.GA3誘導的單性結實‘寧海白’白沙枇杷糖代謝的研究[J].園藝學報，2006, 33 (3): 471-476.

[11] 陳發河,張美姿,吳光斌. NO處理延緩采后枇杷果實木質化劣變及其與能量代謝的關系[J].中國農業科學,2014(12): 2 425-2 434.

[12] 金鵬,呂慕雯,孫萃萃,等. MeJA與低溫預貯對枇杷冷害和活性氧代謝的影響[J].園藝學報, 2012(3): 461-468.

[13] 向準,王瑩,賀紅早.三種酵母用于火棘發酵果酒的對比研究[J].釀酒科技, 2014,243(9)：26-32.

[14] 王孝榮.獼猴桃白酒釀造工藝研究[D].重慶：西南大學, 2014.

Researches on response surface methodology for optimizing fermentation process of brandy raw wine made by white flesh loquat

ZHAO Qian,WANG Qiao-bi,YUAN Min,ZHOU Cai-qiong*

(Engineering & Technology Research Centre of Characteristic Food,Food Science College,Southwest University, Chongqing 400716,China)

White flesh loquat named Huabai No.l with independent intellectual property rights from Southwest University was used as experimental material to optimize fermentation process in this paper. The effects of fermentation temperature, strains of sugar, acidity, species ,the contents of species and other factors on quality of brandy raw wine were studied by single factor experiment. Response surface optimization experiments with three factors and three levels based on single factor experiments were carried out to determine the optimal fermentation conditions. Results showed that fermentation quality is the best at pH4.0, 25 ℃ when 0.1% Y3 was selected as yeast strains and content of sugar was 23%. The fermented wine possessed 12.4% oalcoholic strength, 7.5% sugar，0.151g/L total ester，5.425 g/L total acid . The order of factors influencing fermentation quality was as follow: content of sugar >pH>temperature.

white flesh loquat；fermentation process；brandy raw wine；response surface methodology

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701018

碩士研究生(周才瓊教授為通訊作者,E-mail：zhoucaiqiong@swu.edu.cn)。

重慶市特色食品工程技術研究中心能力提升項目(cstc2014pt-gc8001)

2016-06-07，改回日期：2016-08-15