脊柱結核患者TNF-α基因多態性研究

張玉坤，周綱，黃衛民

(新疆醫科大學第六附屬醫院脊柱二科，新疆 烏魯木齊 830002)

臨床研究

脊柱結核患者TNF-α基因多態性研究

張玉坤，周綱，黃衛民*

(新疆醫科大學第六附屬醫院脊柱二科，新疆 烏魯木齊 830002)

目的 探討腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)基因啟動子區-238A/G、-308A/G位點的基因多態性與脊柱結核的關系。方法 隨機抽取新疆醫科大學第六附屬醫院2015年1月至12月收治的脊柱結核患者58例及對照組50例作為研究對象，采取病例-對照方法對兩組TNF-α-238 A/G、-308A/G位點的基因多態性進行比較，并使用統計學方法進行分析。結果 病例組與對照組TNF-α-238位點GG、GA基因型頻率比較差異有統計學意義，P<0.05；兩組-238位點G、A等位基因型頻率比較差異無統計學意義，P>0.05；兩組TNF-α-308位點GG、GA基因型頻率比較差異無統計學意義，P>0.05；兩組-308位點G、A等位基因頻率比較差異均有統計學意義，P<0.05。結論 TNF-α基因參與了脊柱結核的發生發展過程，且基因多態性和和結核易感性有關，其中-308A等位基因和-238位點GA基因可能參與了脊柱結核的發生。

脊柱結核；TNF-α；基因；等位基因

結核病是由結核桿菌感染引起的慢性傳染病，雖然結核病自20世紀60年代以來已經得到有效控制，但近年來結核病卷土重來，結核桿菌仍然是嚴重威脅人類健康的病原體之一。骨關節結核是發病率最高的肺外結核，其中脊柱結核是發病率最高的骨關節結核，而且較易導致脊柱畸形，引起殘疾[1]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是巨噬細胞產生的一種細胞因子，可以誘導巨噬細胞抑制體內結核桿菌的生長速度，使機體產生肉芽腫樣效應，在對抗結核桿菌中起著重要的保護性防御作用。本研究擬對我院58例脊柱結核患者進行TNF-α基因啟動子區-238A/G、-308A/G位點基因多態性的檢測，探討其與脊柱結核易感性是否存在相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機抽取2015年1月至12月在新疆醫科大學第六附屬醫院住院治療的脊柱結核患者58例作為研究對象，所有患者均經臨床表現、影像學檢查、病理學檢查、病灶結核菌培養及有效的抗結核等綜合方式確診。患者年齡13～61歲，平均(37.21±13.15)歲，其中男性40例，女性18例，維吾爾族33例，漢族25例。同時隨機抽取我院健康體檢者50例作為對照組，年齡21～60歲，平均(39.25±8.22)歲，其中男33例，女17例，維吾爾族30例，漢族20例。所有研究對象知情同意，排除合并其他感染、惡性腫瘤、艾滋病等疾病的患者。病例組及對照組患者年齡、性別、民族比較差異無統計學意義，P>0.05，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 基因多態性檢驗方法 采集患者及體檢者空腹外周靜脈血2 mL，加入乙二胺四乙酸(EDTA-K2)抗凝的試管。使用改良的碘化鈉-氯仿法提取白細胞中DNA，后溶于TE緩沖液，凍存于-20℃冰箱備用。采用特異性引物聚合酶鏈反應(PCR-SSP)設計兩套引物，上游引物為5’-GCTAGGAGGGAGAGCAGCAA-3’，下游引物5’-TGAGAGAGGAAGACGGCACA-3’，分別用兩個引物進行特異性引物聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增，擴增程序為：94℃預變性5 min后，94℃變性3 min，65℃退火100 s，72℃延伸2 min，反應35個循環，最后72℃延伸為5 min，取7 μL產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳并觀察電泳條帶以確定分子量的大小。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0中文統計軟件包進行數據錄入和統計分析，基因型和等位基因頻率分布均符合Hard-Weinberg平衡定律，基因型、等位基因頻率的比較采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 TNF-α基因型判定 每份樣本PCR反應物均以340 bp的內對照(CYP1A1)基因條帶參照，TNF-α-308位點PCR擴增片段201 bp為GG基因型(純合子)，240 bp為AA基因型(突變純合子)，201 bp及240 bp條帶同時出現為GA基因型(雜合子)；TNF-α-238位點PCR擴增片段178 bp為GG基因型(純合子)，186 bp為AA基因型(突變純合子)，178 bp及186 bp條帶同時出現為GA基因型(雜合子)，詳見圖1。

注：Mark為DL-600，分別為100-600 bp的DNA片段；1：TNF-α-308位點GG基因型；2：TNF-α-308位點AA基因型；3：TNF-α-308位點GA基因型；4：空白對照；5：TNF-α-238位點GG基因型；6：TNF-α-238位點AA基因型；7：TNF-α-238位點GA基因型；8：內對照基因；9：空白對照

圖1 TNF-α基因電泳鑒定圖

2.2 TNF-α基因在脊柱結核患者中的分布 研究結果顯示，308位點GG基因占總脊柱結核患者的93.10%，GA占6.90%，等位基因G占96.56%，A占3.52%；238位點的GG基因占93.10%，GA占6.09%，等位基因G占96.56%，A占3.52%。本研究脊柱結核患者中未檢出AA型突變純合子。

2.3 病例組和對照組TNF-α-308、-238位點基因型及等位基因頻率比較 本研究中病例組和對照組均未檢出AA型突變純合子。脊柱結核患者和健康體檢者TNF-α-308位點G、A等位基因頻率比較差異有統計學意義，P<0.05，病例組等位基因A的頻率高于對照組；TNF-α-238位點的基因型頻率比較差異有統計學意義，P<0.05，病例組GA基因型頻率高于對照組，其他無統計學意義，詳見表1～2。

表1 病例組和對照組TNF-α-308、-238位點基因型頻率比較(例/%)

表2 病例組和對照組TNF-α-308、-238位點等位基因頻率比較(例/%)

3 討 論

脊柱結核同其他部位的結核一樣也是以肉芽腫為其典型炎癥反應，通常機體抗結核免疫包括細胞免疫和變態反應兩種，其中細胞免疫發揮著重要的保護機制，可通過免疫調控殺滅巨噬細胞吞噬的結核桿菌，研究顯示[2-3]，包括白細胞介素(interleukin，IL)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、金屬蛋白酶(metalloproteinase，MMP)、轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)等細胞因子均在結核病變中起著重要的作用。同時，同樣背景下的不同種族結核病發病率存在差異，說明基因類型在結核病發生發展的過程中扮演重要的角色[4]。至今發現，人類組織相容性抗原(human leukocyte antigen，HLA)基因、TNF-α基因、核體蛋白sp110、MCP-1-2518[5-6]等基因參與了結核的遺傳易感性。

TNF-α是由巨噬細胞激活后產生的一種具有促炎癥左右的細胞因子，可以顯著誘導巨噬細胞抑制結核桿菌的生長并引起肉芽腫反應[7]。TNF-α可以誘導產生多種細胞因子并間接調節其免疫活性而增加保護功能，對其他細胞因子有趨化和黏附作用，可使其黏附在結核感染部位而促進形成肉芽腫，對防止結核桿菌的擴散起到積極作用[8]。TNF基因主要位于人體的相容性抗原復合體(HLA)Ⅲ類抗原區的一個7kbDNA片段內，由5個小衛星序列與多個單核苷酸多態性啟動區構成，具有高度的多態性并共同調節TNF-α的表達。目前TNF-α基因和結核病相關性的研究熱點是其-238A/G與-308A/G位點，本研究對58例脊柱結核及50例對照組進行對照研究。結果顯示，脊柱結核患者-238及-308位點基因類型均以GG基因為多(約占93.10%)，脊柱結核患者TNF-α-308位點等位基因A的頻率高于對照組、G的頻率低于對照組；脊柱結核患者TNF-α-238位點GA基因型頻率高于對照組、GG基因型頻率低于對照組，提示新疆脊柱結核患者TNF-α-308位點A等位基因存在過度表達、TNF-α-238位點GA人群和脊柱結核發病有關。李得春[9]對中國青海地區藏族骨關節結核患者TNF-α-238及TNF-α-308位點的研究顯示，藏族人群TNF-α-308A存在過度表達，且TNF-α-238位點多態性可能與藏族骨關節結核發病有關。但Selvaraj、Vejbaesya[10-11]在印度人群及泰國人群的研究中并沒有發現TNF-α基因多態性與結核有關。我國林春燕等[12]對我國46例漢族脊柱結核患者TNF-α-238、-308位點基因多態性的研究也未見其相關性。本研究結果也提示新疆地區TNF-α基因多態性和骨關節結核發生有關聯，可能與民族有關(本研究樣本來源于維漢兩個民族)。由于本研究樣本量較少，未對維漢患者分開討論，希望后期擴大樣本量對維漢骨關節結核患者TNF-α基因多態性進行比較分析。

以上研究結果提示，TNF-α基因參與了脊柱結核的發生發展過程，其多態性和脊柱結核的易感性可能存在一定關聯，表現為TNF-α-308位點A等位基因-238位點GA基因可能參與了脊柱結核的發生。但本研究為小樣本量研究，結果是否具有代表性尚需要進一步證實。同時，細胞因子的調節系統是一個非常復雜的體系，細胞因子此消彼長的可能性極大，研究對象體內微小的改變有可能會影響結果的穩定性，故需要多次進行重復試驗，以得到最為科學的結論。

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Polymorphismsin Analysis of TNF-α Gene in the Patients with Spine Tuberculosis

Zhang Yukun，Zhou Gang，Huang Weiming

(Spine Department of the Sixth Affiliated Hospital in Xinjiang Medical University，Urumqi 830002，China)

Objective To investigate the association of TNF-α gene polymorphisms at position -238A/G and -308A/G with spine tuberculosis.Methods We randomly selected 58 cases of spinal tuberculosis patients and 50 normal people as control group from January to December in 2015 of Sixth Affiliated Hospital in Xinjiang Medical University.Gene polymorphisms with the -308A/G and-238A/G of TNF alpha were studied.Results There was significant difference in genotype frequencies of region at position -238GG and GA in TNF- α gene between spinal tuberculosis patients and control group，P<0.05.There was no significant difference in allele frequencies of region at position -238G and A between two groups，P>0.05.There was no significant difference in genotype frequencies of region at position -308GG and GA in TNF- α gene between two groups，P>0.05.There was significant difference in allele frequencies of region at position -308G and A between two groups，P<0.05.Conclusion TNF-α genes involved the development process of spinal tuberculosis，and gene polymorphism was susceptibility with TB，-308 A allele and -238 GA gene may be involved with the occurrence of spinal tuberculosis.

spinal tuberculosis；TNF-α；gene；allele

1008-5572(2017)01-0025-03

新疆醫科大學創新基金(XJC2013222)；*本文通訊作者：黃衛民

張玉坤，周綱，黃衛民.脊柱結核患者TNF-α基因多態性研究[J].實用骨科雜志，2017，23(1)：25-27.

R529.2

B

2016-05-19