大豆根際促生菌的分離篩選及其對大豆和百脈根生長與品質的影響

曾慶飛，王茜，陸瑞霞，劉正書，吳佳海，王小利

(貴州省草業研究所，貴州 貴陽550006)

大豆根際促生菌的分離篩選及其對大豆和百脈根生長與品質的影響

曾慶飛，王茜，陸瑞霞，劉正書，吳佳海，王小利*

(貴州省草業研究所，貴州 貴陽550006)

從貴州畢節地區大豆根際土壤中分離溶磷菌株，從大豆根瘤中分離根瘤菌株。對分離出的溶磷圈直徑與菌落直徑的比值(D/d值)在2.20以上的溶磷菌株分別進行溶磷能力、生長素(IAA)及有機酸分泌能力、產酸產堿性能測定，篩選出優良溶磷菌4株；對分離出的根瘤菌通過大豆試管苗回接及促生效應試驗，篩選出高效根瘤菌2株。將篩選出的6株菌經拮抗反應試驗后分別按單一溶磷菌接種劑、單一根瘤菌接種劑、溶磷菌+根瘤菌復合接種劑3種處理制備菌懸液，采用盆栽方法分別對大豆和百脈根進行促生效應試驗。結果表明，與對照相比，除單一根瘤接種劑對增加大豆株高無效果外，另外2個處理對大豆株高有提升效果，所有處理對大豆莖粗、生物量、結莢數、莢重、單粒數及單粒重都有明顯的促進作用。其中溶磷菌+根瘤菌復合菌液對大豆株高、莖粗、幼苗地上生物量和地下生物量的促進效果最好，分別比對照高出21.26%，40.79%，15.88%和42.19%。3個處理對百脈根的第一、二茬株高及地上生物量、全氮、全磷和粗蛋白含量均有明顯的提升效應，其中依然是溶磷菌+根瘤菌復合菌液的處理效果最好，分別比對照高出20.82%，54.88%，106.14%，148.78%，19.34%，61.88%和19.34%，與對照差異均達極顯著水平(P<0.01)。說明所篩選的菌株組合能產生良好的促生互作效應。

大豆根際溶磷菌；大豆根瘤菌；分離篩選；大豆和百脈根；促生效應

植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)是一類自由生活在土壤或定殖于植物根際具有固氮、解磷、釋鉀、形成鐵載體或產生植物激素等能力的有益微生物。PGPR種類繁多，廣泛存在于植物根際與根系，其中根瘤菌和溶磷菌是研究最早、經生產開發對農業系統貢獻最大的兩類促生菌，也是新型生物肥料研究與應用的熱點之一[1]。

根瘤菌可將空氣中的分子氮轉化為有機氮，供自身和植物利用。根瘤菌與豆科植物形成的共生體系是生物固氮體系中最強的共生系統，在改善土壤質量、促進植物的生長過程中起著極其重要的作用[2]。溶磷菌也是農業生態系統中一類具有解磷功能的重要微生物，能將土壤中以無機或有機態結合的難溶性磷化物轉化為可被植物吸收利用的水溶性磷酸鹽。此外，溶磷菌還能產生有機酸及活性酶類、分泌植物生長所需的植物激素，在改善植物根際環境及營養條件的同時，促進植物的營養生長和生殖生長，進而提高農作物的產量和品質[3]。因此，尋找開發利用具有解磷能力的根際溶磷菌來挖掘土壤中潛在的磷庫資源，增加土壤中速效磷的含量及供磷能力，以及篩選利用高效根瘤菌株，改善植物的氮素營養，并降低化肥過量施用所造成的環境污染，已成為發展現代綠色農業的重要任務之一[4-5]。

溶磷菌廣泛存在于農業土壤和自然土壤中，但以植物根際土壤中出現較多，而且不同土壤及不同植物根際，其溶磷微生物的數量與種類也存在著較大的差異[6]。研究者們已先后從春小麥(Triticumaestivum)及夏玉米(Zeamays)等禾本科作物、苜蓿(Medicagosativa)與披堿草(Elymusdahuricus)等牧草、杉木(Cunninghamialanceolata)和馬尾松(Pinusmassoniana)等林木植物的根際土壤中分離篩選到了不同的溶磷菌株，并進行了溶磷特性、溶磷機理方面的相關研究[7-9]，但關于大豆(Glycinemax)根際溶磷菌的研究報道卻相對較少。另一方面，根瘤菌接種劑的研制與應用雖在各國已廣泛開展，但根瘤菌接種劑的推廣應用普遍存在著接種效果不穩定的問題，根瘤菌接種劑效率的發揮存在著區域適用性[10]，從地方豆科植物根瘤中搜集分離優良菌株，進而開發研制適合在本地區推廣使用的有效根瘤接種劑，具有重要的生產價值及現實意義。本研究從地方大豆根瘤中分離篩選出了具有較強促生性能的根瘤菌株，從大豆根際土壤中分離篩選出了具有較強溶磷能力的溶磷菌株，對優良溶磷菌株的產酸產堿性能、有機酸與生長素的分泌能力進行了測定，并就篩選出的優良溶磷菌和根瘤菌對大豆和百脈根(Lotuscorniculatus)的促生增質效果進行了具體試驗，以期為牧草高效溶磷菌肥的研制提供物質保證并奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 根際土樣的采集 大豆根際土壤于2012年5-7月分別采自貴州省畢節市大方縣雙山鎮平原村和東關鄉金坪村、黔西縣錦星鎮白泥村和雨朵鎮蒿芝村以及威寧彝族回族苗族自治縣草海鎮黃倉村和爐山鎮青竹村的大豆種植地，按五點取樣法采集附著于大豆健康根系的根際土壤，常規方法混合后裝入無菌封口袋，低溫保存后帶回實驗室用于溶磷菌的分離。

1.1.2 大豆根瘤的采集 在與采集大豆根際土壤相同的大豆種植地，于大豆的分枝期或成熟期，選擇生長良好的植株挖取根瘤，采集新鮮健壯、顏色鮮艷的成年根瘤，剪時稍帶一段根，將采集樣品保藏于裝有變色硅膠的離心管中密封，低溫保存用于根瘤菌的分離。

1.1.3 盆栽種子 用作肥效試驗的大豆(品種名：黔豆1號)及百脈根(品種名：歌德)種子由貴州省草業研究所資源育種室提供。菌株處理對大豆和百脈根生長與品質的影響測定于2014年4月中旬至8月上旬進行。

1.2 培養基

PKO(Pikovaskaia’s)無機磷培養基[11]：用于溶磷菌的分離及溶磷能力測定；YMA(酵母膏甘露醇)培養基[11]：用于根瘤菌的分離；NFM(無氮液體培養基)[12]：用于分離菌株的產酸產堿性能測定；Hoagland半固體有氮培養基[13]：用于根瘤菌回接與試管苗促生性能測試；無色氨酸King培養基[11]：用于菌株生長素分泌能力測定；LB(溶菌肉湯培養基)[13]：用于菌株的活化及菌種保存。

1.3 優良促生菌株的分離篩選

1.3.1 溶磷菌株的分離及初篩 按照常規分離細菌法[14]制備土樣懸液，逐級稀釋后涂布于含有難溶性磷酸鈣的PKO平板培養基上，28 ℃恒溫箱中倒置培養，挑取平板上有明顯透明圈的分離物純化保存，再將純化菌株分別點接于PKO固體培養基上，每個菌株4次重復，測定各菌株的溶磷圈直徑(diameter of phosphorus-solubilizing halo,D值)和菌落直徑(diameter of colony, d值)，計算D/d值，根據比值大小對溶磷菌株進行初步篩選[15]。

1.3.2 溶磷菌株的溶磷能力及分泌有機酸量的測定 制備初篩出的各溶磷菌株菌懸液至濃度為107～108cuf/mL，分別取0.5 mL菌懸液接種于盛有50 mL已滅菌PKO液體培養基的三角瓶中，以不接菌的培養基作對照，每個處理3次重復。28 ℃、150 r/min恒溫搖床上振蕩培養7 d后，培養液于4 ℃、10000 r/min轉速下離心10 min，取適量上清液用鉬銻抗比色法[16]測定處理液在700 nm處的吸光度。扣除對照值后計算各菌株的溶磷量，以P mg/L計；同時使用雷磁PHS-3C型pH計按儀器操作說明測定菌懸液的pH值。

菌株分泌有機酸的含量采用酸堿滴定法[17]測定。每個菌株取5 mL離心后的上清液，加1滴酚酞作指示劑，用0.1 mol/L NaOH滴定各上清液，有機酸總量(C)用下列公式計算：C=0.1×R÷5×1000,式中：R為NaOH滴定數量，減去CK值得到各菌株的有機酸分泌量，單位用mmol/L表示[11]。

1.3.3 溶磷菌株的產酸、產堿性能測試 分別取0.5 mL已制備好的各菌株的菌懸液接種于盛有30 mL已滅菌NFM液體培養基的三角瓶中，以不接菌的培養基作對照，每個處理3次重復。28 ℃、125 r/min恒溫搖床上振蕩培養72 h后，觀察記錄培養基的顏色變化。若培養液顏色不變(綠色或草綠色)為中性菌株，變成黃色為產酸菌株，變成藍色為產堿菌株。同時利用雷磁PHS-3C型pH酸度計測定各菌株培養液的pH值，以檢驗其酸堿性[3]。

1.3.4 溶磷菌株分泌生長素能力測定 菌株分泌生長素(3-indoleacetic acid, IAA)能力采用Salkowski比色法測定[18]。Salkowski(S2)比色液組成為：FeCl34.5 g，10.8 mol/L濃硫酸1000 mL。將0.5 mL菌懸液接種于盛有30 mL已滅菌的無色氨酸King培養基中，28 ℃、150 r/min恒溫搖床上振蕩培養7 d，10000 r/min離心10 min，每菌株取1 mL上清液滴入檢測板上，加入等量S2比色液，另外在比色液中分別加入50,30和10 mg/L的標準植物生長激素1 mL作梯度對照，室溫靜置15 min后觀察顏色變化，確定菌株是否具有分泌IAA的能力。取能夠分泌IAA菌株的上清液1 mL，加入S2比色液1 mL，于黑暗中靜置30 min后用紫外分光光度計在530 nm處測定吸光度，根據標準曲線計算各菌株的IAA分泌量(單位：mg/L)。

1.3.5 根瘤菌的分離與純化 將采集的新鮮、飽滿的大豆根瘤，用自來水沖凈表面泥土，10%次氯酸鈉浸泡消毒20～30 min后無菌水沖洗，在無菌條件下將根瘤壓碎，擠出汁液，在YMA平板上劃線，置于28 ℃下培養。5 d后挑取典型單菌落進行革蘭氏染色，鏡檢，若不純，進一步純化，直至獲得純化菌株，分別用YMA斜管和30%甘油保藏。

1.3.6 根瘤菌的回接鑒定與篩選 根瘤菌的回接鑒定與篩選采用試管苗根瘤及促生測定法。選用口徑3.5 cm、高35 cm的大試管加入Hoagland半固體有氮培養基100 mL滅菌；挑選同一批次的籽粒飽滿、大小均一的大豆種子(黔豆1號)，用0.1%的升汞表面消毒5 min后，再用75%的酒精消毒約3 min，無菌水沖洗干凈，在滅菌三角瓶里用無菌水室溫浸種48 h，選擇催芽成功的大豆種子無菌條件下接種于試管內的培養基中，分別加入5 mL各根瘤菌株的YMA發酵菌液，每個菌株3次重復，以YMA液體空白培養基作對照，然后放入25 ℃、光照16 h的培養箱中恒溫培養，觀察記錄管內植株根瘤形成及幼苗生長情況，40 d后進行結瘤與促生性狀測定。測定項目包括根瘤數、根長、株高、地上生物量(鮮重，干重)、地下生物量(鮮重，干重)。測定方法：將幼苗從試管內小心取出，蒸餾水洗凈根部瓊脂，吸水紙吸取根表水分，然后平鋪在桌面的濾紙上。直接數數統計每株根瘤總數；將幼根拉直，用20 cm透明直尺測量根長與地上部株高；用干凈刀片切斷分離植株地上部與地下部，用萬分之一電子天平稱取地上生物量(鮮重)與地下生物量(鮮重)，然后分別將地上、地下部于105 ℃殺青30 min，在恒溫85 ℃下烘干12 h至恒重后再用相同電子天平稱取地上生物量(干重)和地下生物量(干重)。

1.3.7 菌株拮抗反應試驗及菌懸液的制備 拮抗反應試驗：將各供試菌株活化后分別兩兩交叉劃線接種于LB固體培養基上，28 ℃恒溫箱中倒置培養5～10 d，每天觀察兩菌株交叉點的菌落生長情況。若交叉點菌株生長良好，說明兩菌株間沒有拮抗反應；若交叉點菌株不生長或生長較弱，說明兩菌株間有拮抗作用。選擇不發生拮抗反應的菌株制備菌懸液并進行盆栽試驗。

溶磷菌菌懸液的制備：將各供試菌株在LB斜面培養基上活化培養1～2 d，選擇生長良好、無雜菌、無污染的菌落，分別接種于100 mL LB液體滅菌培養基中，28 ℃、125 r/min搖床培養3～5 d。在波長660 nm處測定培養菌液光密度(OD)值，當OD660值大于0.5時，用無菌水在無菌條件下調節各菌株懸液OD值至0.5，用滅菌量筒將菌液注入滅菌玻璃瓶中常溫密封保存。

根瘤菌菌懸液的制備：將篩選出的促生性能良好的菌株純培養物分別挑取1環接種到100 mL YMA液體培養基中，28 ℃、150 r/min恒溫搖床培養72 h，用液體YMA培養基調OD=0.9(波長=600 nm)，菌體濃度約為2×109個/mL，待用。

1.4 盆栽試驗

1.4.1 播種與菌液施用 在花缽中裝入適量供試土壤，不施任何底肥。土壤取自貴州省農業科學院院內試驗地，試驗地土壤全氮含量1.70 g/kg，有效磷15.70 mg/kg，速效鉀130.00 mg/kg，有機質31.17 g/kg，pH 6.03(數據由貴州大學環境與資源研究所測定)。分別選取同一批次的籽粒飽滿、大小均一的大豆和百脈根種子，用設計的各處理菌液于陰涼處浸種約2 h后播入土內，大豆每盆播種5粒，百脈根每盆播種50粒，加入50 mL 處理菌液，另設空白培養基浸種作對照，每個處理3次重復。將不同處理的花盆隨機擺放于光照充足的地方，按常規盆栽試驗進行管理，大豆在分枝期前、百脈根在第1茬收獲前再各施一次處理菌液。

1.4.2 大豆和百脈根株高的測定 盆栽大豆分別在播種20 d后的幼苗期、分枝期和開花期，于每一處理的每個重復中隨機選擇5株共15株，將植株拉直，用100 cm卷尺測定其從地面至最高點的絕對高度，計算平均值；百脈根分別在第1茬和第2茬收獲時，于每一處理的每個重復中隨機選擇10株共30株，用相同方法測定絕對高度，計算平均值。

1.4.3 大豆幼苗和百脈根生物量的測定 在盆栽大豆播種20 d后、盆栽百脈根分別在第1茬和第2茬的收獲期，大豆每處理隨機選擇5株，百脈根各處理每次隨機選擇10株，將地上部分和地下根系分別在105 ℃下殺青15～30 min后，于85 ℃下烘至恒重，使用萬分之一電子天平稱重，計算地上生物量和地下生物量的平均值。

1.4.4 大豆莖粗、結莢數、莢重、單粒數及單粒重的測定 盆栽大豆每處理隨機選擇5株，分別在分枝期和開花期用軟皮尺測定莖粗，在收獲期統計每株結莢數及單株粒數，用萬分之一電子天平稱取單株莢重及粒重，計算每株單莢重與單粒重的平均值。

1.4.5 百脈根全氮、全磷、粗蛋白、粗脂肪含量的測定 在百脈根第1茬收獲時，隨機選擇3個單株的地上部分，分別測定植株的全氮、全磷、粗蛋白及粗脂肪含量。

全氮含量測定采用凱氏定氮法[19]，計算公式為：N(%)=(V1-V0)×V2×n×100×0.014/3W×V3。式中：N為樣品中的全氮含量，V1為滴定樣品時的鹽酸用量(mL)，V0為空白滴定時的鹽酸用量(mL)，V2為消化液定容體積(mL)，n為滴定樣品時鹽酸的當量濃度，W為樣品干重(g)，V3為蒸餾時消化液的吸取體積(mL)，3代表重復數。

全磷量的測定采用H2SO4-H2O2消煮，鉬黃比色法[20]，計算公式為：P(%)=ρ·V×分取倍數×10-4/3m。式中：ρ為從標準曲線中查得顯色液P的質量濃度(μg/mL)，V為顯色液體積(mL)，分取倍數：消煮液定容體積(mL)/吸取消煮液體積(mL)，m為干樣品質量(g)，3為重復數。

粗蛋白(crude protein, CP)含量由公式直接計算：CP(%)=N%×6.25。式中：N%為所測樣品的含氮量，6.25為氮換算成蛋白質的系數。

粗脂肪(crude fat, CF)的測定采用索氏抽提法[21]，計算公式為：CF(%)=(b-c)/(b-a)×100×3。式中：a為稱量瓶加濾紙包的重量(g)，b為稱量瓶加濾紙包和烘干樣重(g)，c為稱量瓶加濾紙包和抽提后烘干殘渣重(g)，3為重復數。

1.5 數據統計分析

采用Excel 2010整理數據，運用LSD法進行多重比較，統計學分析使用SPSS 16.0軟件。

2 結果與分析

2.1 大豆根際溶磷菌的分離與篩選

2.1.1 根際溶磷菌的分離及溶磷圈篩選 通過溶磷圈法,從采集的大豆根際土壤中于含有難溶性磷酸鈣的PKO平板上,挑選獲得36株具有明顯透明圈的菌落純化保存;將純化菌株分別點接于PKO固體培養基上,D/d值在1.50以上的有23個菌株;經過10d培養,D/d值大于2.20的菌株有7株(表1),作為初步篩選出的菌株,占供試菌株的19.4%,其中菌株DR19的D/d值最大,達2.55,其次為菌株DR24和DR7,D/d值分別為2.50和2.51。

表1 7個菌株在PKO培養基上的D/d值Table1 D/dvalueofphosphate-solubilizingbacteriafromsoybeanrootsoiloncalciumphosphateculturemedium菌株StrainNo.D值Dvalued值dvalueD/d值D/dvalueDR41.850.822.46DR71.660.752.51DR91.720.692.49DR131.610.752.29DR191.810.712.55DR241.930.792.50DR261.840.792.33

2.1.2 菌株的溶磷能力及分泌有機酸量 在以磷酸鈣作為磷源的液體培養條件下，培養7 d后7個菌株的溶磷量在151.64～179.70 μg/mL(表2)，其中菌株DR13的溶磷能力最強，達179.70 μg/mL，其次是菌株DR7，溶磷量為173.94 μg/mL，兩者溶磷量均與最小溶磷量為151.64 μg/mL的菌株DR26之間達到顯著差異(P<0.05)。

從表2可以看出，在溶磷培養過程中，各菌株培養液的pH值均呈下降趨勢，由最初的7.00下降到5.00～6.00之間，下降了1～2個單位。

總有機酸量測定結果表明，7個菌株在PKO培養液中生長7 d后均能分泌有機酸，但存在數量差別，其中菌株DR13的分泌量最高，達14.00 mmol/L，其次為菌株DR4和DR19，分泌量均為11.33 mmol/L，分泌有機酸量之間的差異達顯著水平(P<0.05)。菌株DR26分泌有機酸量最小，僅為6.00 mmol/L，與其余菌株分泌量之間達到極顯著差異(P<0.01)。

2.1.3 菌株的產酸、產堿性能 菌株的產酸產堿性能測試結果顯示(表3)，分離篩選出的7個菌株均為產堿菌株，在NFM液體培養基中，使培養介質顏色由綠色轉變成藍色，且各介質培養液pH值主要集中在7.54～7．93之間的弱堿性范圍內，只有菌株DRI3的介質培養液pH值達到了8.44。

表2 7個菌株對磷酸鈣中磷的溶解量及分泌有機酸量Table2 Capacityofphosphatedissolvingandorganicacidproductionofsevenstrains菌株號StrainNo.有效磷增量Incrementofavailablephosphorus(μg/mL)pH值pHvalue總有機酸Totalorganicacid(mmol/L)DR4153.87±4.17Ab5.2911.33ABbDR7173.94±0.64Aa5.0510.00BbDR9157.94±8.88Ab5.438.00BdDR13179.70±1.80Aa5.4014.00AaDR19165.44±6.96Aab5.5411.33ABbDR24168.30±5.81Aab5.349.33BcDR26151.64±3.36Ab5.586.00Ce 注:同列不同大寫字母表示差異達極顯著水平(P<0.01),不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05),下同。 Note:Differentcapitallettersinthesamecolumnindicatethesignifi-cantdifferenceatP<0.01level,differentsmalllettersshowthesignifi-cantdifferenceatP<0.05level.Thesamebelow.表3 7個菌株的產酸產堿性能Table3 Acidoralkaliproducingabilityofsevenstrains菌株號StrainNo.顏色Color產酸或產堿AcidoralkaloidsproductionpH值pHvalueDR4藍色Blue產堿Alkaloidsproduction7.55DR7藍色Blue產堿Alkaloidsproduction7.59DR9藍色Blue產堿Alkaloidsproduction7.54DR13藍色Blue產堿Alkaloidsproduction8.44DR19藍色Blue產堿Alkaloidsproduction7.93DR24藍色Blue產堿Alkaloidsproduction7.60DR26藍色Blue產堿Alkaloidsproduction7.76表4 7個菌株分泌生長素的能力Table4 CapacityofIAAsecretionofsevenstrains菌株號StrainNo.顯色反應ChromogenicreactionIAA值ValueofIAA(μg/mL)DR4深粉紅色Deeppink18.07±0.34AaDR7淺粉紅色Lightpink7.65±0.63DeDR9淺粉紅色Lightpink10.85±1.47CcDR13粉紅色Pink11.49±0.24CcDR19深粉紅色Deeppink14.01±0.67BbDR24深粉紅色Deeppink14.97±0.46BbDR26淺粉紅色Lightpink9.00±0.82Dd

2.1.4 菌株分泌生長素的能力 對分離篩選出的7株溶磷能力較強的菌株進行IAA分泌能力的測定,結果表明,所有供試菌株均具有一定分泌生長素的能力(表4)。定性檢測結果顯示,各菌株呈現出色澤不同的顯色反應。紅色濃度越大,菌株分泌生長素的能力可能越強。從定量測定的結果看,菌株DR4分泌IAA的能力最大,分泌量達18.07μg/mL,均與其余菌株分泌IAA量之間呈極顯著差異(P<0.01);其次為DR24,分泌IAA量為14.97μg/mL,除與菌株DR19(分泌IAA量為14.01μg/mL)之間未達顯著水平差異外,與其余各菌株之間分泌IAA量都達到極顯著水平(P<0.01);菌株DR7分泌IAA 的量最小,為7.65μg/mL,是最大IAA 量的42.3%,表現出微弱分泌IAA 的能力。

2.2 大豆根瘤菌的分離與篩選

2.2.1 大豆根瘤菌的分離 在采集的23份根瘤樣品中,通過含結晶紫的YMA平板劃線分離培養,最終獲得在平板上生長良好的56株純化根瘤菌。純化菌株在YMA 平板上的生長菌落多為圓形,直徑在2～3mm之間,革蘭氏染色均為陰性。挑選菌落隆起而光滑、邊緣整齊、有粘液產生的典型菌株,進行根瘤菌株的回接與促生效果試驗,用于優良菌株的篩選。

2.2.2 根瘤菌的回接與促生效應試驗結果 將9株具有典型菌落特征的根瘤菌用于大豆試管苗的回接與促生效能試驗,試驗結果如表5所列。

測定結果顯示,挑選的9株參試菌株回接后,在Hoagland半固體有氮培養基中都能使大豆幼苗的根系形成根瘤,而對照無結瘤發生。其中菌株D2與D4的結瘤數量明顯高于其余7個菌株。與對照相比,9個菌株對大豆試管苗生長量的影響均達顯著水平,其中菌株D2對大豆試管苗的促生效果最好,生長40d后幼苗的株高、根長、地上生物量和地下生物量均明顯大于其他菌株處理的幼苗,并與對照達到極顯著差異。菌株D1處理的幼苗株高位居第二,但根長與地上生物量卻低于菌株D3、D4處理的幼苗。綜合比較促生苗的株高、根長和地上生物量3個指標,菌株D4的促生效果僅次于D2,然后是菌株D3、D9和D5,菌株D6D7、D8的促生效果相對較低。

表5 9株根瘤菌對大豆試管苗結瘤與生長量的影響Table 5 Effect of nine rhizobium strains on nodulation and growth of soybean tube seedlings

2.3 菌株拮抗反應及菌劑處理設置

溶磷菌株根據D/d值、溶磷能力和IAA分泌能力等指標，挑選出DR19、DR13、DR24和DR4四個菌株，根瘤菌根據回接篩選結果挑選出D2和D4參與對大豆和百脈根的促生效應試驗。首先對挑選出的6個菌株兩兩劃線培養，結果發現所有平板劃線交叉處的菌落均生長良好，表明6個菌株間無拮抗反應。將最終篩選出的6個菌株設成3個不同的組合處理，設置情況見表6(注：菌株名稱與組合及其體積比等正在申報國家發明專利)。

表6 菌劑處理設計Table 6 Design of stain treatments

2.4 不同菌株處理對大豆和百脈根生長的影響

2.4.1 對大豆株高與莖粗和百脈根株高的影響 各菌劑處理對盆栽大豆分枝期和開花期株高及莖粗的影響效果分別見表7和表8。

在分枝期和開花期，單一溶磷菌接種劑和溶磷菌+根瘤菌復合接種劑處理的大豆株高均較對照高，單一根瘤菌接種劑處理較對照低(表7)。其中在分枝期，溶磷菌+根瘤菌復合接種劑處理的大豆株高為69.93 cm/株，比對照(55.53 cm/株)高出25.93%，并達顯著性差異；在開花期，溶磷菌+根瘤菌混合處理的大豆株高較對照高出21.26%，差異達到顯著水平。說明經過溶磷+根瘤菌混合處理后，對大豆株高具有明顯的促進作用。對于經過單一根瘤菌處理的大豆，在分枝期和開花期的株高(53.73和81.13 cm/株)分別比對照低3.24%和2.01%，說明供試根瘤菌劑對提高大豆株高無效果。

在分枝期和開花期，單一溶磷菌、單一根瘤菌和溶磷菌+根瘤菌混合處理的大豆莖粗均較對照明顯提高(P<0.05)(表8)。在分枝期，溶磷菌、根瘤菌和溶磷+根瘤菌三者處理的莖粗分別為2.87，2.69和2.73 cm，分別比對照(2.11 cm)提高35.69%，27.24%和29.29%。在開花期，根瘤菌和溶磷+根瘤菌對大豆莖粗的增大作用明顯加強，兩者處理的大豆莖粗分別為2.85和3.04 cm，比對照(2.16 cm)提高31.93%和40.79%；溶磷處理的大豆莖粗相對分枝期，其增大作用略有減弱，開花期大豆莖粗較對照提高33.94%。

表7 各菌劑處理對大豆株高的影響Table7 Effectofdifferentstaintreatmentsonsoybeanheight處理Treatments分枝期Branchingperiod株高Plantheight(cm/plant)較CK高或低(%)開花期Floweringperiod株高Plantheight(cm/plant)較CK高或低(%)A60.27±5.22Aa8.5386.80±5.39Aa4.83B53.73±10.63Aa-3.2481.13±14.35Aa-2.01C69.93±17.31Ab25.93100.40±23.55Ab21.26D(CK)55.53±2.02Aa-82.80±3.47Aa-表8 各菌劑處理對大豆莖粗的影響Table8 Effectofdifferentstaintreatmentsonstemdiameterofsoybean處理Treatments分枝期Branchingperiod莖粗Stemdiameter(cm)較CK高或低(%)開花期Floweringperiod莖粗Stemdiameter(cm)較CK高或低(%)A2.87±0.16Aa35.692.89±0.11Aa33.94B2.69±0.23Aa27.242.85±0.17Aa31.93C2.73±0.03Aa29.293.04±0.22Aa40.79D(CK)2.11±0.17Bb-2.16±0.26Bb-

較CK高或低:Increase or decrease rate compared with CK.下同 The same below.

各菌株處理對盆栽百脈根第1茬和第2茬株高的影響效果見表9。從表9可以看出，各菌劑處理對百脈根第1茬及第2茬株高的影響差異較大。在第1茬時，A、B、C各處理均較對照有所增加，其中C處理的百脈根株高為25.49 cm/株，比對照(21.10 cm/株)增加20.82%；B處理對百脈根株高的影響不大，僅較對照增加1.06%。在各處理中，C處理與其余處理間株高差異達到極顯著水平(P<0.01)，其余處理間未達顯著水平(P>0.05)。到第2茬時，各菌劑處理株高在13.67～16.44 cm/株之間，較對照株高增加28.73%～54.88%，均與對照差異達極顯著水平(P<0.01)。

表9 各菌劑處理對百脈根株高的影響Table9 EffectofeachstraintreatmentonplantheightofL.corniculatus處理Treatments第1茬Firstcut株高Plantheight(cm/plant)較CK高(%)第2茬Secondcut株高Plantheight(cm/plant)較CK高(%)A23.36±3.72Bb10.7313.86±2.79Aab30.58B21.32±3.23Bb1.0613.67±2.88Aab28.73C25.49±3.57Aa20.8216.44±3.15Aa54.88D(CK)21.10±3.74Bb-10.62±3.02Bb-表10 各菌劑處理對大豆幼苗生物量的影響(接種生長20d)Table10 Effectofdifferentstraintreatmentsonbiomassofsoybeanseedlings處理Treatments地上干重Abovegrounddryweight測定值Measuredvalue(g/plant)較CK高(%)地下干重Undergrounddryweight測定值Measuredvalue(g/plant)較CK高(%)A0.10433Aa13.000.02833ABCbc32.81B0.10667Aa15.520.02867ABbc34.38C0.10700Aa15.880.03033ABab42.19D(CK)0.09233Aa-0.02133BCd-

較CK高:Increase rate compared with CK.下同The same below.

2.4.2 對大豆幼苗和百脈根生物量的影響 各菌劑處理接種20 d后對盆栽大豆生物量的影響效果見表10。測定結果顯示，各菌劑處理與對照相比，對大豆幼苗地上生物量均有一定的促進作用，但差異不顯著；各菌劑處理對地下生物量的提高作用卻與對照都達到了極顯著差異，說明3個菌劑處理都能明顯促進大豆幼苗根系的生長，其中溶磷菌+根瘤菌復合菌劑對大豆幼苗生物量具有最好的提高效果。

各處理對百脈根地上生物量的影響效果見表11。從表11可知，第1茬各菌劑處理的單株地上生物量比對照增加了14.68%～106.14%，其中C處理效果最好，地上生物量比B處理增加了91.46%，與其他各處理間的地上生物量差異達到極顯著水平(P<0.01)；第2茬各處理單株地上生物量較第1茬小，但比對照的單株地上生物量增加了87.40%～148.78%，與對照差異達極顯著水平(P<0.01)，而且也是C處理的影響效果最佳。綜合分析同一處理在不同茬次對百脈根地上生物量的影響，各處理在第2茬的促生效果均強于第1茬，說明各處理對百脈根地上生物量的促生效果在第2茬均較第1茬好，即無論是溶磷菌劑、固氮菌劑，還是溶磷與固氮菌劑混合，其促生效果的作用均較持續和穩定。

表11 各處理對百脈根地上生物量的影響Table 11 Effect of each treatment on above dry weight of L. corniculatus

2.4.3 對大豆結莢數、莢重、單粒數及單粒重的影響 在收獲期，各處理對大豆結莢數及莢重的影響效果見表12。結果表明，溶磷、固氮和溶磷+固氮混合處理的大豆單株莢數分別比對照提高37.70%，55.74%和44.26%，經固氮菌劑處理的大豆單株莢數最多，為6.33個/株，其次為溶磷+固氮處理。在單莢重方面，表現出固氮>溶磷>溶磷+固氮，莢重分別為0.74，0.68和0.64 g/盆，比對照(0.62 g/盆)分別提高20.21%，9.96%和3.75%。

各處理對大豆單粒數及單粒重的影響效果見表13。從表中可知，各菌劑處理都能提高大豆的單粒數及單粒重，但提高程度有所不同。A、B、C三個處理的大豆單株粒數分別為10.27，11.47和10.73粒/株，分別比對照(7.33粒/株)高出40.00%，56.36%和46.36%，單株粒數增加效果表現為固氮>溶磷+固氮>溶磷>CK。A、B、C三個處理的大豆單粒重分別較對照提高了39.99%，57.20%和33.25%，提高效果體現為固氮>溶磷>溶磷+固氮>CK。

表12 各處理對大豆結莢數及莢重的影響Table12 Effectofeachtreatmentonnumbersofbeanpodandpodweightofsoybean處理Treatments莢數Numbersofbeanpodofoneplant測定值Measuredvalue(Number/plant)較CK高(%)莢重Podweight測定值Measuredvalue(g/pod)較CK高(%)A5.60±0.53Aa37.700.68±0.04Aa9.96B6.33±0.76Aab55.740.74±0.15Aa20.21C5.87±0.50Aa44.260.64±0.05Aa3.75D(CK)4.07±0.31Ab-0.62±0.07Aa-表13 各處理對大豆單粒數及單粒重的影響Table13 Effectofeachtreatmentonseedsperpodandsingleseedweightofsoybean處理Treatments單株粒數Seedsperplant測定值Measuredvalue(Number/plant)較CK高(%)單粒重Singleseedweight測定值Measuredvalue(g/piece)較CK高(%)A10.27±1.00ABa40.001.52±0.30Aab39.99B11.47±1.67Aa56.361.71±0.31Aa57.20C10.73±1.21ABa46.361.45±0.27Aab33.25D(CK)7.33±0.62Bb-1.09±0.21Ab-

2.5 不同菌株處理對百脈根營養成分的影響

2.5.1 對百脈根全氮、全磷含量的影響 各菌劑處理對百脈根全氮、全磷含量的影響效果見表14。測定結果顯示，經A、B、C三種菌劑處理后的百脈根全氮含量在1.94%～2.18%之間，而對照僅為1.83%，提高范圍達6.20%～19.34%。除B處理與對照相比未達極顯著差異外(P>0.01)，A、C處理的全氮含量均與對照達到極顯著差異水平(P<0.01)。

在對全磷含量的影響上，施用各處理菌劑后，與對照相比全磷含量提升幅度高達20.93%～61.88%，差異均達極顯著水平(P<0.01)。其中C處理的全磷含量最高，為0.77%，這可能是溶磷菌劑與固氮菌劑共同作用的結果。A處理的全磷含量略大于B處理。綜合分析各處理對百脈根全氮、全磷含量的影響，發現均存在C>A>B>CK的效果關系。

2.5.2 對百脈根粗蛋白、粗脂肪含量的影響 各菌劑處理對百脈根粗蛋白、粗脂肪含量的影響效果見表15。從測定結果可以看出，與對照相比，各處理對百脈根粗蛋白含量均有提高作用，影響效果表現為：C>A>B>CK，而對粗脂肪含量的影響效果有所不同，表現為：A>C>CK>B。由于粗蛋白含量受含氮量的影響，各處理對百脈根粗蛋白含量的影響與含氮量是一致的。在粗脂肪含量上，A、C處理分別較對照增加了25.08%和0.40%，B處理反而較對照降低了11.23%，說明施用單一的固氮菌劑后，不利于百脈根體內能量物質粗脂肪的積累。

表14 各處理對百脈根全氮、全磷含量的影響Table14 EffectofeachtreatmentontotalnitrogenandtotalphosphoruscontentofL.corniculatus%處理Treatments全氮含量Allnitrogencontent測定值Measuredvalue較CK高全磷含量Allphosphoruscontent測定值Measuredvalue較CK高A2.03Bb11.130.58Bb21.14B1.94BCc6.200.57Bb20.93C2.18Aa19.340.77Aa61.88D(CK)1.83Cd-0.47Cc-表15 各處理對百脈根粗蛋白、粗脂肪含量的影響Table15 EffectofeachtreatmentoncrudeproteinandcrudefatcontentofL.corniculatus%處理Treatments粗蛋白含量Thecrudeproteincontent測定值Measuredvalue較CK高粗脂肪含量Thecrudefatcontent測定值Measuredvalue較CK高A12.69Bb11.136.20Bb25.08B12.13BCc6.204.40Bb-11.23C13.63Aa19.344.98Aa0.40D(CK)11.42Cd-4.96Cc-

3 討論

農田土壤中氮、磷、鉀缺乏，過多施用化肥，養分利用率低下，并由此產生一系列資源、環境和農產品品質等負面效應，是我國農業生產中普遍存在的一個問題。研究開發具有多種有益生物學作用的植物根際促生菌，研制并利用對環境友好的微生物菌肥，是解決這一問題的有效途徑[22]。高效根瘤菌可以通過生物固氮機制為作物提供環保氮肥，優良溶磷菌能將土壤中的難溶性磷轉化成可被植物吸收利用的可溶性磷，進而逐漸變成了代表未來綠色農業發展方向之一的“白色農業”中的生力軍[23]。早有將具有固氮、溶磷特性的PGPR生物菌肥應用于甘蔗(Saccharum)、青稞(Hordeumvulgare)、草莓(Fragaria×ananassa)、蘋果樹(Malusdomestica)等經濟作物并產生良好效果的報道[24]。將PGPR復合菌肥應用于牧草中的三葉草(Trifoliumrepens)、紫花苜蓿(Medicagosativa)、箭舌豌豆(Viciasativa)、岷山紅三葉(Trifoliumpratensecv. Minshan)等，也得到了提質增產的效果[25]。

本研究從貴州畢節地區的大豆根瘤中分離篩選出對大豆試管苗具有良好結瘤作用和促生效果的5株根瘤菌；從大豆根際土壤分離菌株中通過溶磷圈法篩選出7株具有較強溶磷能力的溶磷菌株。溶磷圈直徑(D)與菌落生長直徑(d)及其比值是表征溶磷菌相對溶磷能力的一個指標，在篩選出的7株溶磷菌株中，D/d值均在2.20以上。在對篩選菌株的溶磷能力作進一步的檢測時發現，在PKO固體平板上D/d值最大的菌株，在PKO液體培養基中溶解無機磷的能力卻不一定是最大。如菌株DR19的D/d值最大，達2.55，但在液體培養基振蕩培養條件下測得的有效磷增量為165.44 μg/mL，而菌株DR13的D/d值為2.29，在液體PKO培養基中的有效磷增量卻高達179.70 μg/mL。說明菌株的D/d值與在液體培養條件下的溶磷能力不呈絕對的正相關關系，這可能是由兩種培養過程和培養方式有所不同而導致的。因為在PKO平板培養中，透明圈是通過菌株自身分泌的有機酸經滲透擴散于菌落周圍形成的，而在液體培養基中菌株可溶解多種形態的磷，所以通過D/d值篩選出的溶磷菌株必須經由液體培養法來進一步判斷其真實溶磷能力。

很多PGPR都能通過自身代謝產生吲哚乙酸、赤霉素等之類的植物激素，進而有效調節植物的生命活動，促進植物的生長發育[24]。在本研究篩選出的溶磷菌株中，都有不同水平的IAA及有機酸的分泌能力。植物激素的分泌水平與菌株的促生效果之間的直接關系是被眾多研究所證實了的，而有機酸的分泌量與溶磷菌株的溶磷量之間的相關性存在著不同結論的報道，有機酸分泌與菌株溶磷能力的相互關系尚待進一步深入研究。在本研究篩選出的溶磷菌株中，DR19、DR13、DR24、DR4四個菌株除具有較強的溶解無機磷的能力外，還具有較高的分泌IAA和有機酸的能力，因而被挑選出作為優良溶磷菌株，連同對大豆試管苗具有較好促生效果的根瘤菌D2和D4一起，用于進行大豆和百脈根的盆栽促生效應試驗。

促生效應試驗中，除單一根瘤菌劑處理對增加大豆株高無效果外，單一根瘤菌劑、單一溶磷菌劑、根瘤+溶磷復合菌劑3個處理與對照相比，對增加大豆的莖粗、生物量、單株莢數、莢重、單株粒數、單粒重，以及對提升百脈根的株高、地上生物量、全氮、全磷和粗蛋白含量，都有不同程度的促進作用。綜合而言，在對大豆和百脈根的促生作用、在對百脈根全氮全磷含量的促進吸收增幅上，都是以溶磷+固氮復合菌劑處理的促進效果最好，說明本研究所挑選的根瘤菌與溶磷菌2類促生菌具有“1+1>2”的良好互作效應。這種不同菌株組合的加成效應與馬文彬等[26]對箭舌豌豆的生長影響研究和韓華雯等[27]對紫花苜蓿產量和品質的影響研究結果是一致的。當然，根瘤菌與溶磷菌，以及同一類菌的不同菌株之間，存在著互作與拮抗兩種不同的關系。只有深入研究PGPR的作用機理，篩選具有疊加促進效應的菌株組合，研發高效型復合菌劑，才能充分發揮PGPR的促生增質效果，這也是微生物菌肥的一個研究發展方向[28]。

植物根際促生菌劑的研制與應用已成為現代農業發展過程中不可缺少的組成部分。然而在PGPR接種劑中，根瘤菌接種劑的推廣應用普遍存在著接種效果不穩定的問題，因為豆科植物能否結瘤固氮存在著復雜的共生匹配機理，它是根瘤菌本身的遺傳特性、寄主基因以及生態環境等諸多因素相互作用的結果。在一個地區效果顯著的接種劑，引進到另一個地區后效果可能會明顯下降，根瘤菌接種劑效率的發揮存在著區域適用性[10]。豆科植物根瘤菌接種劑的篩選和應用必須考慮菌株對當地環境的適應能力，而從地方豆科植物根瘤中搜集分離優良菌種則是最有效的方法[29]。本研究從地方大豆根瘤中分離篩選高效根瘤菌株，目的就是為了尋找能在本地與豆科作物種類匹配、固氮能力好、競爭結瘤能力強的根瘤菌株。另一方面，已有研究表明，在與大豆或豌豆的共生體系中，溶磷芽孢桿菌和根瘤菌之間的合作能夠促進植物的生長發育，刺激根瘤菌的種群數量和結瘤[28]；土壤中的有效磷能促進大豆根瘤菌對氮的固定和氨的轉化，并有利于根瘤的發育，進而有效增加植株的株高、生物量和產量，提高大豆籽粒的氮素含量[30]。因此，同時接種溶磷菌，不但能有效溶解土壤中的無機磷，促進根系對磷素的吸收，還能增加植株的根瘤數量與共生固氮效率。本研究中根瘤+溶磷復合菌劑對大豆和百脈根的最佳促生增質效果也驗證了溶磷菌與根瘤菌的這一優勢組合效應。

在植物根際促生菌中，大豆根瘤菌的研究報道已有很多，但對大豆根際溶磷菌的報道卻相對較少。本研究從大豆根際分離篩選出的溶磷菌，除對大豆具有促生效果外，對百脈根也有促生增質效應。本研究對大豆根瘤菌和根際溶磷菌的分離篩選及其不同組合菌液對大豆和百脈根的促生影響進行了較為系統的前期試驗，下一步除對篩選出的優良菌株作出分子生物學鑒定外，還將進行不同菌株組合對其他豆科牧草的促生抗逆效果研究，以期為促進地方草地生態畜牧業的健康發展提供技術支持。

References：

[1] Li H Z, Pan M. Research progress of plant growth-promoting rhizobacteria in soil. Guangzhou Chemical Industry, 2014, 42(10): 52-54. 李海宗, 潘梅. 土壤中植物根際促生菌研究進展. 廣州化工, 2014, 42(10): 52-54.

[2] Jiang W, Guan X Q, Yu J Z. Biological nitrogen fixation and intensive grassland livestock husbandry. Acta Prataculturae Sinica, 2003, 12(6): 42-46. 姜薇, 關秀清, 于井朝. 生物固氮在集約化草地畜牧業中的作用. 草業學報, 2003, 12(6): 42-46.

[3] Liu X X, Lu R X, Wang X L,etal. Selection, identification and growth promotion of inorganic phosphorus-dissolving bacterial strains in rhizosphere ofTrifoliumrepens. Agricultural Science and Technology, 2012, 13(10): 2058-2064.

[4] Gyaneshwar P, Naresh K G, Parekh L J,etal. Role of soil microorganisms in improving P nutrition of plants. Plant and Soil, 2002, 245: 83-93.

[5] Hamdali H, Ouhdouch Y. Rock phosphate-solubilizing actinomycetes screening for plant growth-promoting activities. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2008, 24: 2565-2575.

[6] Babana A H, Antoun H. Biological system for improving the availability of Tilemsi phosphate rock for wheat (TriticumaestivumL.) cultivated in Mali. Nutrient Cycling in Agroecosystems, 2005, 72: 147-157.

[7] Feng R Z, Feng Y H, Yao T,etal. The screening of phosphobacteria and solubilizing phosphate ability in the rhizosphere of alfalfa and wheat. Journal of Gansu Agricultural University, 2005, 40(5): 604-608. 馮瑞章, 馮月紅, 姚拓, 等. 春小麥和苜蓿根際溶磷菌篩選及其溶磷能力測定. 甘肅農業大學學報, 2005, 40(5): 604-608.

[8] Huang P F, Liu J A, Jin A X,etal. Isolation and screening, identification of phosphorus-solubilizing bacteria in rhizosphere soil ofPinusmassonuanaand its phosphate-degradation capacity. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2012, 28(19): 12-16. 黃鵬飛, 劉君昂, 靳愛仙, 等. 馬尾松根際土壤溶磷菌分離篩選、鑒定及其溶磷效果研究. 中國農學通報, 2012, 28(19): 12-16.

[9] Li F X, Zhang D G, Yao T. Study on cultural conditions of plant growth promoting rhizobacteria in rhizosphere of oat in alpine region. Journal of Gansu Agricultural University, 2004, 39(3): 316-320. 李鳳霞, 張德罡, 姚拓. 高寒地區燕麥根際高效PGPR菌培養條件研究. 甘肅農業大學學報, 2004, 39(3): 316-320.

[10] Gr?nemeyer J L, Kulkarni A, Berkelmann D,etal. Identification and characterization of rhizobia indigenous to the Okavango region in Sub-Saharan Africa. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 44(3): 174-178.

[11] Zhang Y, Zhu Y, Yao T,etal. Interactions of four PGPRs isolated from pasture rhizosphere. Acta Prataculturae Sinica, 2013, 22(1): 29-37. 張英, 朱穎, 姚拓, 等. 分離自牧草根際四株促生菌株(PGPR)互作效應研究. 草業學報, 2013, 22(1): 29-37.

[12] Zhu Y, Yao T, Li Y E,etal. Screening of phosphate-solubilizing bacteria and their acting mechanisms in the rhizosphere of red clover. Acta Agrestia Sinica, 2009, 17(2): 259-263. 朱穎, 姚拓, 李玉娥, 等. 紅三葉根際溶磷菌分離及其溶磷機制初探. 草地學報, 2009, 17(2): 259-263.

[13] Hariprased P, Niranjana S R. Isolation and characterization of phosphate-dissoloving rhizobacteria to improve plant health of tomato. Plant and Soil, 2009, 316: 13-24.

[14] Shekhar Nautiyal C. An efficient microbiological growth medium for screening phosphate solubilizing microorganisms. Federation of European Microbiological Societies, 1999, 170: 265-270.

[15] Bai W J, Hu R R, Zhang J E,etal. A study on the isolation, screening and phosphate solubilizing capacity of phosphate solubilizing bacteria in the rhizosphere of corn. Journal of South China Agricultural University, 2013, 34(2): 167-176. 白文娟, 胡蓉蓉, 章家恩, 等. 玉米根際溶磷細菌的分離、篩選及溶磷能力研究. 華南農業大學學報, 2013, 34(2): 167-176.

[16] Li Y E, Yao T, Zhu Y,etal. Isolation and characteristics of phosphorus-solubilizing bacteria in rhizosphere of alfalfa and sainfoin in Lanzhou. Chinese Journal of Grassland, 2009, 1: 45-51. 李玉娥, 姚拓, 朱穎, 等. 蘭州地區苜蓿和紅豆草根際溶磷菌篩選及菌株部分特性研究. 中國草地學報, 2009, 1: 45-51.

[17] Zhang Y, Lu G X, Xie Y L,etal. The relationship between organic acid secreted from phosphorus-solubilizing bacteria and the phosphate-solubilizing ability. Acta Agrestia Sinica, 2015, 23(5): 1033-1038. 張英, 蘆光新, 謝永麗, 等. 溶磷菌分泌有機酸與溶磷能力相關性研究. 草地學報, 2015, 23(5): 1033-1038.

[18] Zhang Y, Zhu Y, Yao T. Characteristics of phosphate dissolving and IAA secretion of phosphate-solubilizing bacteria isolated fromTrifolium. Grassland and Turf, 2012, 32(5): 36-40. 張英, 朱穎, 姚拓. 三葉草根際溶磷菌溶磷及分泌IAA能力測定. 草原與草坪, 2012, 32(5): 36-40.

[19] Fan X, Xiao Z M, Zhang W,etal. Comparison of Kjeldahl and Dumas combustion methods for the determination of crude protein in feedstuffs. Feed Industry, 2014, 35(24): 47-53. 樊霞, 肖志明, 張維, 等. 杜馬斯燃燒法與凱氏定氮法測定植物源性飼料原料中粗蛋白質含量的比較. 飼料工業, 2014, 35(24): 47-53.

[20] Li H J. Comparative study on determination of phosphorus content in two kinds of plants. Modern Agricultural Science and Technology, 2012, 11: 16-17. 李會娟. 2種植物磷含量的檢測方法比較研究. 現代農業科技, 2012, 11: 16-17.

[21] Li Q, Qiu M M. A rapid determination method of crude fat in grain. Modern Agricultural Science and Technology, 2008, 23: 189-190. 李茜, 邱敏敏. 糧食中粗脂肪的快速測定方法. 現代農業科技, 2008, 23: 189-190.

[22] Liu S C, Feng X, Yu J. Research progress of plant growth-promoting rhizobacteria and its environmental effects. Hubei Agricultural Sciences, 2009, 48(11): 2882-2887. 劉淑琮, 馮炘, 于潔. 植物根際促生菌的研究進展及其環境作用. 湖北農業科學, 2009, 48(11): 2882-2887.

[23] Yao T. Associative nitrogen-fixing bacteria in the rhizosphere ofAvenasativain an alpine region II-Phosphate-solubilizing power and auxin production. Acta Prataculturae Sinica, 2004, 13(3): 1-8. 姚拓. 高寒地區燕麥根際聯合固氮菌研究II—固氮菌的溶磷性和分泌植物生長素特性測定. 草業學報, 2004, 13(3): 1-8.

[24] Hu J C, Xue D L, Ma C X,etal. Research advances in plant growth promoting rhizobacteria and its application prospect. Chinese Journal of Applied Ecology, 2004, 15(10): 1963-1966. 胡江春, 薛德林, 馬成新, 等. 植物根際促生菌(PGPR)的研究與應用前景. 應用生態學報, 2004, 15(10): 1963-1966.

[25] Rong L Y, Yao T, Ma W B,etal. The inoculants potential of plant growth promoting rhizobacteria strains to improve the yield and quality ofTrifoliumpretensecv. Minshan. Acta Prataculturae Sinica, 2014, 23(5): 231-240. 榮良燕, 姚拓, 馬文彬, 等. 岷山紅三葉根際優良促生菌對其宿主生長和品質的影響. 草業學報, 2014, 23(5): 231-240.

[26] Ma W B, Yao T, Wang G J,etal. Assessment of rhizobacteria strains forViciasativa. Acta Prataculturae Sinica, 2014, 23(5): 241-248. 馬文彬, 姚拓, 王國基, 等. 根際促生菌篩選及其接種劑對箭舌豌豆生長影響的研究. 草業學報, 2014, 23(5): 241-248.

[27] Han H W, Sun L N, Yao T,etal. Effects of bio-fertilizers with different PGPR strain combinations on yield and quality of alfalfa. Acta Prataculturae Sinica, 2013, 22(5): 104-112. 韓華雯, 孫麗娜, 姚拓, 等. 不同促生菌株組合對紫花苜蓿產量和品質的影響. 草業學報, 2013, 22(5): 104-112.

[28] Camacho M, Santamarfa C, Temprano F,etal. Co-inoculation withBacillussp. CECT 450 improves nodulation inPhaseolusvulgarisL. Canadian Journal of Microbiology, 2001, 47: 1058-1062.

[29] Bejarano A, Ramírez-Bahena M H, Velázquez E,etal. Vigna unguiculata is nodulated in Spain by endosymbionts ofGenisteaelegumesand by a new symbiovar (vignae) of the genus Bradyrhizobium. Systematic and Applied Microbiology, 2014, 37(7): 533-540.

[30] Xue X Y, Feng R H, Guan D W,etal. Screening and analysis for efficient co-inoculation system of soybean rhizobia and plant growth-promoting rhizobacteria. Soybean Science, 2011, 30(4): 613-620. 薛曉昀, 馮瑞華, 關大偉, 等. 大豆根瘤菌與促生菌復合系篩選及機理研究. 大豆科學, 2011, 30(4): 613-620.

Identification of soybean growth-promoting rhizobacteria and their effects on the growth and quality of Glycine max and Lotus corniculatus

ZENG Qing-Fei, WANG Qian, LU Rui-Xia, LIU Zheng-Shu, WU Jia-Hai, WANG Xiao-Li*

GuizhouInstituteofPrataculture,Guiyang550006,China

In order to screen combinations of rhizobacteria which have growth-promoting and quality-improving effects on local leguminous crops, phosphorus-solubilizing bacteria were isolated from soybean rhizospheric soils in the Bijie Region of Guizhou Province and rhizobium strains were isolated from soybean root nodules. Phosphorus-solubilizing strains with ratios of the diameter of the phosphorus-solubilizing halo to colony diameter of more than 2.20 were tested for their abilities of phosphorus-solubilizing, 3-indoleacetic acid (IAA)-secreting, organic acid and alkali production. Four superior phosphate-solubilizing strains were selected. For the isolated rhizobium strains, two highly efficient strains were screened out by means of back-inoculation and growth-promoting effect tests on soybean tube seedlings. The six selected strains were tested for antagonistic reactions and three types of bacterial suspension were prepared: phosphate dissolving only, rhizobia only and a mix of the two. These were immediately inoculated intoGlycinemaxandLotuscorniculatusin pots to test their growth-promoting effects. The results showed that, compared to control, the rhizobia only inoculants had no effect on the plant height ofG.maxwhereas the other two treatments could significantly increase height. All three treatments had significant promoting effects onG.maxstem diameter, biomass, number of bean pods, weight of pods, seeds per pod and single seed weight. Among the three treatments, the mix of phosphate dissolving and rhizobia inoculants showed the best growth effects on soybean seedling plant height, stem diameter, aboveground biomass and underground biomass (respectively 21.26%, 40.79%, 15.88% and 42.19% higher than control). With regard toL.corniculatus, all three treatments could improve first and second harvest plant height, aboveground biomass, total nitrogen content, total phosphorus content and crude protein content. Again, the effects of the mixed treatment of phosphate dissolving with rhizobia inoculants were the highest (respectively 20.82%, 54.88%, 106.14%, 148.78%, 19.34%, 61.88% and 19.34% higher than control). The results thus indicate that combining phosphate-solubilizing with rhizobium bacteria strains produces a favourable interaction effect.

phosphorus-solubilizing bacteria in the rhizosphere of soybean; soybean rhizobia; isolation and screening;GlycinemaxandLotuscorniculatus; growth-promoting effect

10.11686/cyxb2016063

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-03-02；改回日期：2016-04-12

國家自然科學基金項目(31560035)和貴州省科技支撐計劃項目(黔科合NY字[2016]3004)資助。

曾慶飛(1969-)，男，貴州德江人，副研究員，博士。E-mail:zengqingfei2008@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail：wangxiaolizhenyuan@126.com

曾慶飛, 王茜, 陸瑞霞, 劉正書, 吳佳海, 王小利. 大豆根際促生菌的分離篩選及其對大豆和百脈根生長與品質的影響. 草業學報, 2017, 26(1): 99-111.

ZENG Qing-Fei, WANG Qian, LU Rui-Xia, LIU Zheng-Shu, WU Jia-Hai, WANG Xiao-Li. Identification of soybean growth-promoting rhizobacteria and their effects on the growth and quality ofGlycinemaxandLotuscorniculatus. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(1): 99-111.