急性腦梗死患者外周血單個核細胞中組蛋白H3乙酰化水平的變化

林秀潔 黃禮傳 張 俊

(福州神經精神病防治院神經科，福建 福州 350008)

急性腦梗死患者外周血單個核細胞中組蛋白H3乙酰化水平的變化

林秀潔 黃禮傳 張 俊

(福州神經精神病防治院神經科，福建 福州 350008)

目的 探討急性腦梗死患者外周血單個核細胞(PBMC)中組蛋白H3乙酰化水平變化與急性腦梗死的臨床關系。方法 選取2015年1～12月該院神經內科收治的發病后不同時間段的急性腦梗死患者206例為腦梗死組；選取同期在該院腦卒中篩查門診就診的60名健康志愿者為對照組。密度梯度法離心分離PBMC，提取全組蛋白，Western印跡檢測組蛋白H3乙酰化水平；根據患者就診時的癥狀與體征，進行牛津郡社區腦卒中項目(OCSP)分型，并采用神經功能缺損程度評估(NIHSS)量表評估患者的神經功能缺損程度。結果 急性腦梗死后1 d開始，持續到7 d，PBMC組蛋白H3乙酰化水平均明顯低于對照組(P<0.05)，其中梗死后第3天蛋白H3值最低。不同OCSP分型患者組蛋白H3乙酰化水平均明顯低于對照組(P<0.05)；其中完全前循環腦梗死(TACI)組蛋白H3乙酰化水平降低幅度最大，明顯低于后循環腦梗死組和部分前循環腦梗死組(P<0.05)。多元直線回歸分析顯示，PBMC組蛋白H3乙酰化水平是入院急性腦梗死患者NIHSS評分的重要影響因素，兩者呈明顯直線負相關(β=-0.283，P=0.001)。結論 急性腦梗死患者PBMC中組蛋白H3乙酰化水平低于健康人群，且以TACI型和神經功能缺損嚴重患者的PBMC中組蛋白H3乙酰化水平下降最為明顯。

腦梗死；組蛋白；乙酰化作用

組蛋白乙酰化可通過改變染色體結構來影響基因表達，在中樞神經系統疾病發展過程中發揮重要作用〔1〕。雖然研究顯示，在氧糖剝奪(OGD)細胞和大腦中動脈阻斷實驗(MCAO)大鼠腦組織中組蛋白乙酰化水平均明顯降低〔2〕，并且給予中樞神經系統損傷動物乙酰化酶抑制劑可有效提升組蛋白乙酰化水平，通過抗感染、抗氧化應激等作用改善神經系統功能〔3〕。但關于急性腦梗死患者組蛋白水平具體如何仍不清楚。研究已證實，在中樞神經系統疾病中，外周血單個核細胞(PBMC)中表觀遺傳性變化與腦組織中一致〔4〕。本次研究以PBMC為材料，觀察急性腦梗死患者PBMC中組蛋白H3乙酰化水平變化情況，探討其與急性腦梗死的臨床關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1～12月本院神經內科收治的發病后1、3、5、7、14 d的急性腦梗死患者206例為腦梗死組。入選患者均經頭顱CT、磁共振成像(MRI)檢查證實；簽署知情同意書并經本院倫理委員會批準；排除合并腦出血、惡性腫瘤、自身免疫性疾病者。其中男138例，女68例；年齡55～83〔平均(64.31±8.05)〕歲。選取同期在本院腦卒中篩查門診就診的60名健康志愿者為對照組，其中男44例，女16例；年齡58～79〔平均(64.12±9.17)〕歲。

1.2 方法

1.2.1 分型與標本采集 腦梗死組根據就診時的癥狀與體征，進行牛津郡社區腦卒中項目(OCSP)分型：完全前循環腦梗死(TACI)組36例，部分前循環腦梗死(PACI)組128例，后循環腦梗死(POCI)組42例。此外。對上述患者進行神經功能缺損程度評估(NIHSS評分)。患者入院1 d內取肘靜脈血3 ml，對照組入組時取肘靜脈血3 ml，收集到的血液標本均在6 h內完成PBMC分離。

1.2.2 組蛋白提取 密度梯度法離心分離PBMC，磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌，使用總組蛋白提取試劑盒(艾美捷科技有限公司)提取蛋白：每份PBMC標本中加入100 μl裂解緩沖液，冰上裂解10 min，10 000 r/min離心60 s，棄上清后加入50 μl裂解緩沖液，冰上裂解30 min，10 000 r/min離心5 min，取上清，加12 μl硫蘇糖醇(1∶500稀釋)。二喹啉甲酸法(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)測定各樣本蛋白濃度，-20℃保存。

1.2.3 組蛋白H3乙酰化檢測 Western印跡檢測組蛋白H3乙酰化水平，2.5 μg蛋白經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(0.22 μm孔徑)，室溫下5%脫脂牛奶封閉60 min，加入兔組蛋白H3(H3)(1∶500稀釋)，4℃孵育過夜。Tris鹽酸緩沖液(TBST)沖洗3次，10 min/次，加辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)，室溫下孵育60 min，TBST洗膜緩沖液洗3次，10 min/次，化學發光試劑顯色。乙酰化蛋白H3(Ac-H3)檢測與上述過程相似，Ac-H3抗體亦為1∶500稀釋。Image J 軟件分析H3、Ac-H3 Western印跡檢測圖片灰度值，Ac-H3/ H3的比值為組蛋白H3乙酰化水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS16.0軟件進行t檢驗、方差分析、Pearson分析、多元回歸分析。

2 結 果

2.1 急性腦梗死后不同時間點組蛋白H3乙酰化水平變化 對照組組蛋白H3乙酰化水平為0.23±0.09；急性腦梗死發病后1、3、5、7、14 d分別為：0.12±0.08、0.08±0.03、0.13±0.05、0.14±0.05、0.17±0.03。急性腦梗死后1 d開始，持續到7 d，組蛋白H3乙酰化水平均明顯低于對照組(P<0.05)。其中梗死后第3天組蛋白H3水平最低。見圖1。

圖1 急性腦梗死后組蛋白H3乙酰化水平動態變化

2.2 不同OCSP分型患者組蛋白H3乙酰化水平 不同OCSP分型患者組蛋白H3乙酰化水平均明顯低于對照組(0.23±0.09)(P<0.05)；TACI組蛋白H3乙酰化水平(0.09±0.05)降低幅度最大，明顯低于PACI組(0.13±0.04)和POCI組(0.16±0.07)(P<0.05)。見圖2。

圖2 不同OCSP分型患者PBMC組蛋白H3乙酰化水平

2.3 神經功能損傷程度與組蛋白H3乙酰化水平的關系 患者年齡、性別、糖尿病、高血壓、心血管疾病、組蛋白H3乙酰化水平等與NIHSS評分相關的變量單因素分析見表1。為進一步消除混雜因素干擾，以房顫、組蛋白H3乙酰化水平為自變量，NIHSS評分為因變量進行多元回歸分析，結果顯示，組蛋白H3乙酰化水平是入院急性腦梗死患者NIHSS評分的重要影響因素(P=0.001)，呈明顯負相關，見表2。

表1 急性腦梗死患者以NIHSS評分為因變量單因素分析

表2 急性腦梗死患者以NIHSS評分為因變量多元回歸分析

3 討 論

目前雖然已逐漸探明急性腦梗死后的病理機制以及氧化應激、炎癥反應、鈣超載、血腦屏障受損等，但多數有效治療方案仍受限于時間窗。表觀遺傳學研究顯示，具有遺傳性的基因組表觀修飾包括組蛋白修飾、DNA甲基化、染色體重排等，任意一種修飾異常均會誘發自身免疫、腫瘤、神經病變等疾病〔5〕。其中組蛋白修飾包括乙酰化、磷酸化、糖基化等，而乙酰化是研究較為系統的表觀遺傳，其可通過調整組蛋白末端殘基上乙酰基數量來改變染色體構型，調整基因表達〔6〕；以組蛋白乙酰化為治療靶點具有很大的潛在價值。相關研究已證實，組蛋白去乙酰化酶抑制劑在缺血性腦損傷動物模型和OGD細胞模型中具有明顯療效〔7〕。但以上兩種模型無法完全模擬腦梗死后患者的病理生理過程，因此需進一步對患者本身組蛋白乙酰化情況進行了解。

盡管本次研究發現了急性腦梗死患者PBMC組蛋白H3乙酰化水平明顯低于健康人群，其中以TACI型患者及NIHSS評分高的患者H3乙酰化水平下降最為明顯這一現象，但仍有很多工作需要進一步完善。例如由于受目前檢測組蛋白乙酰化水平方法的限制，較難開展大樣本量的研究分析，而本次研究樣本量偏下，結果可能存在偏差。此外，雖然相關研究顯示，組織中多數HDACS活性明顯提升可能是導致心肌缺血性損傷后組織中組蛋白乙酰化水平下降的原因〔8〕，亦有研究在急性缺血性腦損傷中證實了以上現象〔9〕，但引發急性腦梗死患者PBMC組蛋白H3乙酰化水平降低的原因仍待進一步闡明。

1 Doherty R,O'Farrelly C,Meade KG,etal.Epigenetic regulation of the innate immune response to LPS in bovine peripheral blood mononuclear cells(PBMC)〔J〕.Vet Immunol Immunopathol,2013;154(3/4):102-10.

2 Brown M,Postlethwaite AE,Myers LK,etal.Supernatants from culture of typeⅠ collagen-stimulated PBMC from patients with cutaneous systemic sclerosis versus localized scleroderma demonstrate suppression of MMP-1 by fibroblasts〔J〕.Clin Rheumatol,2012;31(6):973-81.

3 Ghosh S,Zang S,Mitra PS,etal.Global gene expression and Ingenuity biological functions analysis on PCBs 153 and 138 induced human PBMC in vitro reveals differential mode(s)of action in developing toxicities〔J〕.Environ Int,2011;37(5):838-57.

4 Pujari R,Eligar SM,Kumar N,etal.CD45-mediated signaling pathway is involved in Rhizoctonia bataticola lectin(RBL)-induced proliferation and Th1/Th2 cytokine secretion in human PBMC〔J〕.Biochem Biophy Res Commun,2012;419(4):708-14.

5 Ilavarasi K,Kiruthiga PV,Pandian SK,etal.Hydroxytyrosol,the phenolic compound of olive oil protects human PBMC against oxidative stress and DNA damage mediated by 2,3,7,8-TCDD〔J〕.Chemosphere,2011;84(7):888-93.

6 Mihály J,Gericke J,Trocsik D,etal.Reduced lipoxygenase and cyclooxygenase mediated signaling in PBMC of atopic dermatitis patients〔J〕.Prostagland Other Lipid Mediat,2013;107:35-42.

7 Sabo TJ,Dinovic VM,Kaluderovic GN,etal.Syntheses and activity of some platinum(IV)complexes with N-methyl derivate of glycine and halogeno ligands against HeLa,K562 cell lines and human PBMC〔J〕.Inorgan Chim Acta,2005;358(7):2239-45.

8 Wieczorek L,Brown BK,Delsarto-Macedo C,etal.Mitigation of variation observed in a peripheral blood mononuclear cell(PBMC)based HIV-1 neutralization assay by donor cell pooling〔J〕.Virology,2013;447(1/2):240-8.

9 Welker MW,Welsch C,Ochs D,etal.Comparison of envelope 2 CD81 binding regions in PBMC-derived versus serum-derived hepatitis C virus isolates:higher conservation of CD81 region 2 in PBMC isolates〔J〕.J Viral Hepat,2011;18(3):181-92.

〔2016-10-23修回〕

(編輯 袁左鳴)

福建省自然科學基金資助項目(No:2014D013)

林秀潔(1974-)，女，主治醫師，主要從事精神疾病研究。

R743.33

A

1005-9202(2017)02-0336-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.031