β-淀粉樣蛋白對幼鼠骨髓干細胞增殖、遷移和凋亡的影響

熱娜·阿布力孜 威力江·賽買提

(新疆醫科大學第一附屬醫院小兒外二科，新疆 烏魯木齊 830054)

β-淀粉樣蛋白對幼鼠骨髓干細胞增殖、遷移和凋亡的影響

熱娜·阿布力孜 威力江·賽買提

(新疆醫科大學第一附屬醫院小兒外二科，新疆 烏魯木齊 830054)

目的 探討β-淀粉樣蛋白(Aβ)對幼鼠骨髓干細胞增殖、遷移和凋亡的影響。方法 培養新生小鼠骨髓干細胞，將其分為對照組和Aβ處理組。利用BrdU方法檢測兩組陽性細胞數；檢測Aβ蛋白對幼鼠骨髓干細胞遷移的影響；流式細胞儀檢測對照組和Aβ處理組細胞凋亡情況；Western印跡檢測Cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表達。結果 Aβ處理組的細胞生長速度明顯低于對照組，對照組BrdU陽性率顯著高于Aβ處理組(P<0.05)；Aβ處理組的細胞遷移距離及凋亡率顯著高于對照組(P<0.05，P<0.01)；經Aβ蛋白處理的骨髓干細胞中Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表達量明顯升高，而Bcl-2蛋白表達量與對照組相比明顯減少(P<0.01)。結論 Aβ能抑制骨髓干細胞的增殖，加速骨髓干細胞的遷移和凋亡。

骨髓干細胞；β-淀粉樣蛋白；增殖；凋亡；遷移

骨髓干細胞能分化成造血細胞，還能跨胚層分化成神經元細胞、內皮細胞、骨骼肌細胞等，還能用于缺血性心臟病、心肌梗死的治療〔1〕。β-淀粉樣蛋白(Aβ)在體內以聚合體、單體和不溶性的纖維形式存在〔2〕，可溶性的Aβ寡聚體、三聚體和二聚體致病性更強〔3〕。有研究證實了Aβ與神經干細胞的關系〔3,4〕，但目前關于Aβ對骨髓干細胞之間的關系還很少。本研究旨在探討Aβ對骨髓干細胞增殖、遷移、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗動物:取新生的小鼠，由新疆醫科大學中心實驗室提供。主要試劑：DMEM/F12培養液、磷酸鹽緩沖液(PBS)、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、山羊血清購自美國Gibco，Aβ、Annexin V-FITC/PI購自美國Sigma，小鼠抗BruU購自美國abcam，兔抗Bcl-2多克隆抗體、兔抗半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)多克隆抗體、兔抗Max多克隆抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體購自美國Bioworld。主要儀器：倒置顯微鏡購自日本Olympus，細胞儀購自美國MG公司，流式細胞儀購自美國B-D公司，CO2培養箱購自日本SANYO公司。

1.2 骨髓干細胞培養 取新出生的小鼠，1 g/kg的烏拉坦腹腔注射麻醉，75%的乙醇消毒皮毛，無菌條件下取股骨和脛骨，剪開股骨和脛骨的兩端，用Hank液反復沖洗骨髓腔。以1.073/ml的Percoll分離液分離單個核細胞，以每瓶1×106接種于75 ml的培養瓶內、37℃、5% CO2、飽和溫度的條件下培養細胞，4 d后換液，倒掉未貼壁細胞。培養7 d，當細胞匯集達到80%～90%時，用1 ml 0.25%的胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化細胞。當細胞之間的縫隙增大時，加入2 ml含10%FBS的DMEM培養液終止消化，1 500 r/min離心3 min，取上清，加入4 ml DMEM培養液，1 500 r/min離心3 min，取上清，再次加入4 ml DMEM培養液，離心取上清。然后加入4 ml DMEM培養液制成細胞懸液，放入培養箱中培養。當細胞密度達到85%時進行傳代。

1.3 Aβ蛋白對骨髓干細胞增殖的影響 將細胞分為對照組、Aβ處理組。Aβ處理組加入10 μmol/L BrdU，對照組加入稀釋液，37℃ 5% CO2的培養箱中培養96 h后，加入0.012 5%胰蛋白酶并機械吹打使之成為單細胞，轉移到24孔板中培養2 h，細胞貼壁后，用抗BrdU染色鑒定。熒光顯微鏡下計數單位面積呈BrdU陽性細胞數以及Hoechst33258標記的總細胞數。

1.4 Aβ蛋白對骨髓干細胞遷移的影響 對照組和Aβ處理組在DMEM培養液種培養12 h，用胰酶消化并計數后，使用含0.2%BSA的DMEM培養液制成密度為3×105/ml的單細胞懸液，然后加入500 μl細胞懸液，處理組加入15 μmol/L Aβ蛋白，對照組加稀釋液，37℃ 5% CO2的培養箱中培養24 h后，進行染色和細胞計數。

1.5 Aβ蛋白對骨髓干細胞凋亡的影響 將兩組傳代后5 d的骨髓干細胞處理24 h。收集細胞，1 500 r/min離心5 min，棄上清，PBS調整待測細胞濃度為3×106個/ml。取1 ml細胞懸液至離心管中，4℃，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 ml冰預冷的PBS 重懸細胞，再次離心棄上清，PBS重復洗滌1次，加入上樣緩沖液200 μl重懸細胞，分別加入5 μl Annexin-V和PI，充分混勻后避光環境中室溫靜置20 min，加緩沖液300 μl，用流式細胞儀觀察細胞凋亡情況。

1.6 Western印跡檢測相關蛋白的活性 Aβ蛋白作用于骨髓干細胞96 h后，轉移到1.5 ml的Ep管中，根據細胞的數量，加入適宜量的裂解緩沖液，裂解30 min，12 000 r/min，4℃離心10 min，取上清。按照細胞總蛋白提取試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒提取蛋白和測定蛋白濃度。在蛋白樣品與上樣緩沖液充分混合后，100℃煮沸變性5 min，每孔加50 μl樣品。通過Odyssey掃描系統分析蛋白表達量。

1.7 統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1 Aβ對細胞增殖的影響 Aβ處理組的細胞生長速度明顯低于對照組，對照組BrdU陽性率顯著高于Aβ處理組(P<0.01)。見圖1。

2.2 Aβ蛋白對細胞遷移的影響 對照組的細胞遷移距離〔(322.46±32.64)μm〕顯著低于Aβ處理組〔(433.28±29.48)μm，P<0.05〕。

2.3 Aβ蛋白對細胞凋亡的影響 Aβ處理組細胞的凋亡率(35.49%±2.49%)顯著高于對照組(9.79%±1.23%，P<0.01)。

2.4 Western印跡檢測相關蛋白表達 經Aβ蛋白處理的骨髓干細胞中酶切caspase-3、Bax蛋白表達量與對照組相比明顯升高，而Bcl-2蛋白表達量與對照組相比明顯減少(P<0.01)。見圖2。

圖1 兩組細胞生長速度比較

圖2 Aβ蛋白處理骨髓干細胞后相關蛋白表達量

3 討 論

Aβ是γ-分泌酶和β-分泌酶水解樣前體蛋白的產物〔5〕。研究表明，衰老的大腦中沉積或是過多的生成 Aβ，能造成 Aβ發生錯誤的折疊，引發神經元損傷，從而引起炎性反應，最終引起神經元細胞死亡，導致阿爾茨海默癥(AD)的產生〔6〕。研究表明，AD產生的原因可能與Aβ產生和清除的失衡有關〔7〕。

細胞增殖是生物體生命活動的源泉，是生物發育、生長和繁殖的基礎〔8〕。研究顯示，一些中藥如地黃多糖、車前子多糖

對骨髓干細胞的增殖起到抑制作用〔9〕。本研究說明Aβ同樣抑制了骨髓干細胞的增殖。細胞的凋亡是機體維持內環境穩定、保持機體處于正常狀態的一種機制〔10〕。

促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2是Bcl-2家族兩個重要的蛋白。正常情況下Bax和Bcl-2蛋白以二聚體的形式存在，而且表達量相對穩定。當Bcl-2出現表達量減少，而Bax表達量增加時，兩者間的比率失衡，可引起細胞凋亡〔11〕。本研究結果顯示，可能就是Aβ引起兩者之間的比率失衡從而引起細胞凋亡。Caspase-3是Caspase家族中重要的一員，在細胞凋亡過程中是重要的效應子，Caspase-3的活化可引發細胞凋亡〔12〕。本研究結果顯示。可能Aβ誘導骨髓干細胞的凋亡是通過Caspase依賴的途徑發揮作用。總之，Aβ能抑制骨髓干細胞的增殖，加速骨髓干細胞的遷移和凋亡。

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2 王 燕,杜 瑤,杜芳騰,等.β-淀粉樣蛋白清除障礙與阿爾茨海默病〔J〕.中國老年學雜志,2014;34(9):2582-5.

3 Vossel KA,Xu JC,Fomenko V,etal.Tau reduction prevents Aβ-induced axonal transport deficits by blocking activation of GSK3β〔J〕.J Cell Biol,2015;209(3):419-33.

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9 付海燕,胡占升,杜紅陽,等.地黃多糖對過表達 Notch1(NICD)大鼠骨髓間充質干細胞誘導分化及增殖的影響〔J〕.山東大學學報:醫學版,2015;53(1):34-40.

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11 Ramalingam M,Kim SJ.Insulin involved Akt/ERK and Bcl-2/Bax pathways against oxidative damages in C6 glial cells〔J〕.J Rec Signal Transduc Res,2016;36(1):14-20.

12 Chu J,Li JG,Joshi YB,etal.Gamma secretase-activating protein is a substrate for caspase-3:implications for Alzheimer's disease〔J〕.Biol Psychiatry,2015;77(8):720-8.

〔2016-11-10修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

威力江·賽買提(1975-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事小兒泌尿系統疾病的診治研究。

熱娜·阿布力孜(1985-)，女，碩士，主要從事小兒泌尿系統疾病研究。

R363

A

1005-9202(2017)02-0314-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.023