去甲腎上腺素對人肝細胞系表達瘦素及瘦素受體的影響

劉 娜 穆 華 梁傳棟 鄭吉敏

(河北省人民醫院消化內科，河北 石家莊 050051)

去甲腎上腺素對人肝細胞系表達瘦素及瘦素受體的影響

劉 娜 穆 華 梁傳棟1鄭吉敏

(河北省人民醫院消化內科，河北 石家莊 050051)

目的 探討交感神經遞質去甲腎上腺素(NE)對體外培養人肝細胞系L02表達瘦素及瘦素受體的影響。方法 用不同濃度的NE作用于體外培養的人肝細胞系L02，分別于24、48及72 h收集細胞，Western印跡法檢測其表達瘦素及瘦素受體蛋白的影響；RT-PCR檢測NE對肝細胞系L02瘦素及瘦素受體mRNA的影響。結果 ①Western印跡結果顯示，1、10、100 μmol/L NE作用于L02 細胞24 h后，瘦素蛋白表達明顯高于對照組(1.02±0.08,2.24±0.09,2.35±0.12 vs 0.62±0.09,P<0.05)；瘦素受體蛋白表達亦明顯高于對照組(1.35±0.13,2.37±0.12,2.39±0.15 vs 0.85±0.13,P<0.05)。②RT-PCR檢測L02瘦素以及瘦素受體mRNA的表達情況，1、10、100 μmol/L NE作用于L02 24 h后，瘦素mRNA表達明顯高于對照組(1.54±0.08,2.37±0.09,2.72±0.12 vs 1.00±0.07,P<0.05);瘦素受體mRNA表達亦明顯高于對照組(1.61±0.08,2.27±0.10,3.39±0.11 vs 1.00±0.06,P<0.01)。結論 交感神經遞質NE對體外培養的肝細胞系瘦素以及瘦素受體的表達均有促進作用，從而參與了肝纖維化進程。

肝細胞；肝纖維化；去甲腎上腺素；瘦素；可溶性瘦素受體

瘦素參與了肝纖維化進程〔1〕。研究發現在非酒精性脂肪肝患者中血清瘦素水平增高,瘦素可以促進肝星狀細胞(HSC)增殖,并抑制HSC細胞凋亡〔2〕。交感神經系統也參與了肝纖維化的進程，交感神經遞質去甲腎上腺素(NE)能增加HSC數目,并使其活化〔3〕,但對肝細胞的影響鮮有報道。本文旨在探討NE對體外培養人肝細胞系L02表達瘦素及其受體的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及實驗儀器 RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，β-actin 兔抗人單抗購自北京博奧森公司，兔抗人瘦素抗體、兔抗人瘦素受體抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，逆轉錄反應體系、SYBR Green Real Master Mix、TRIzol試劑盒購自中國北京天根公司；PCR 擴增用引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。NE購自美國Sigma公司；人肝細胞系L02購自山東省醫學科學院，其他試劑為分析純。主要儀器有超凈工作臺、二氧化碳培養箱(Precision Co,美國)，倒置相差顯微鏡(Olympus,日本)。

1.2 細胞培養及分組 將冷凍保存的人肝細胞系L02復蘇后接種于含10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和4 mmol/ml谷氨酰胺的RPMI1640培養液中，于37℃、5%CO2的培養箱內培養。細胞分為以下四組：①空白對照組，為單純L02培養；②低濃度NE組(1 μmol/L)；③中濃度NE組(10 μmol/L)；④高濃度NE組(100 μmol/L)。

1.3 Western印跡檢測瘦素以及瘦素受體蛋白的變化 取對數生長期細胞，加1、10、100 μmol/L NE繼續培養24、48及72 h后收集細胞，提取細胞總蛋白，考馬斯亮藍比色法測定蛋白含量。以8%的SDS-PAGE凝膠作為分離膠電泳，轉膜，封閉，分別以兔抗人痩素抗體、兔抗人痩素受體抗體(1∶200)和兔抗人β-actin多克隆抗體(1∶200)作為第一抗體反應；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)作為第二抗體反應。采用電化學發光(ECL)劑，進一步顯影、定影，結果以目的蛋白與β-actin的積分光密度值的比值表示。密度掃描分析采用美國Kodak公司ID數碼成像分析系統軟件對Western印跡結果進行定量分析，灰度值以積分光密度值(IOD)表示。

1.4 RT-PCR檢測NE對LQZ表達瘦素及瘦素受體的影響 (1)采用TRIzol試劑盒，提取L02總RNA，逆轉錄合成cDNA；瘦素、瘦素受體及內參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物參照Genebank基因序列自行設計，由北京賽百盛基因有限公司合成。引物設計與合成如下：瘦素(正義：5'-CAATGACATTTCACACACGCAG-3'，反義：5'-AGATGGAGGAGGTCTCGCAG-3'，擴增產物大小為204 bp)。瘦素受體(正義：5'-GTGTCCTTCCTGACTCCGTAG-3'，反義：5'-GTTATTCTCTGGAAAGACTGGCT-3'，擴增產物大小為119 bp)。GAPDH(正義：5'TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA 3'，反義：5' AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT 3'，擴增產物大小為259 bp)。(2)在PE5700實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)上進行實時定量擴增。SYBR反應體系25 μl。反應條件：93℃ 5 min，1個循環；93℃ 45 s，55℃ 1 min，10個循環；93℃ 30 s，55℃ 45 s，30個循環。利用實時熒光定量PCR儀自帶軟件進行分析，獲得產物的Ct值。采用相對定量2-△△Ct法比較瘦素、瘦素受體基因在各組中的表達差異。

1.5 統計學處理 采用SPSS12.0軟件進行單因素方差分析及q檢驗。

2 結 果

2.1 NE對L02細胞作用后的瘦素及瘦素受體蛋白表達的影響 如圖1所示，分別在大約16 kD、5.1 kD位置出現瘦素、瘦素受體特異性條帶，在43 kD位置可見β-actin條帶。結果證實，1、10、100 μmol/L NE作用于L02細胞24 h后，瘦素蛋白表達明顯高于對照組(1.02±0.08,2.24±0.09,2.35±0.12 vs 0.62±0.09,F=519.348，P<0.05)；瘦素受體蛋白表達亦明顯高于對照組(1.35±0.13,2.37±0.12,2.39±0.15 vs 0.85±0.13,F=217.285，P<0.05)；見圖1。

1～4：對照組，1、10、100 μmol/L組圖1 Western印跡檢測NE作用于L02 細胞24 h 后表達瘦素及瘦素受體表達

2.2 NE對L02細胞作用后的瘦素及瘦素受體mRNA表達的影響 1、10、100 μmol/L NE作用于L02細胞24 h后，瘦素mRNA表達明顯高于對照組(1.54±0.08,2.37±0.09,2.72±0.12 vs 1.00±0.07,F=1 241.751，P<0.05);瘦素受體mRNA表達亦明顯高于對照組(1.61±0.08,2.27±0.10,3.39±0.11 vs 1.00±0.06,F=751.254,P<0.01)。

3 討 論

瘦素是由肥胖基因所編碼的一種由167 個氨基酸組成的分泌型蛋白質。瘦素作為一種肽類激素,其生物學效應由瘦素受體介導，其中可溶性瘦素受體是主要的功能性受體。瘦素主要通過與可溶性瘦素受體結合發揮作用。近年來研究顯示瘦素與纖維化形成有關，瘦素在非酒精性脂肪肝、丙肝及肝硬化等慢性肝病中的作用已引起眾多學者的關注〔4〕。非酒精性脂肪肝患者血清中瘦素水平明顯增高，而瘦素是肝星狀細胞的強有力促有絲分裂因子,并抑制肝星狀細胞的細胞凋亡〔5,6〕。Oben等〔7〕通過動物實驗發現痩素缺陷性ob/ob大鼠形成肝損傷，如補充瘦素可使肝纖維化加重；但對于對照大鼠注射同樣劑量的瘦素卻意義不大，說明依賴瘦素且與損傷關聯的因素可參與肝纖維化的進展。交感神經系統參與了體內各個系統的功能調節，肝臟也不例外。交感神經遞質NE也能增加肝星狀細胞數目，促進纖維化的形成〔8,9〕。表達低兒茶酚胺水平或低交感活性的痩素缺陷性ob/ob小鼠經研究顯示可以產生肝纖維化抵抗，當給予動物肝細胞毒性飲食，NE缺乏的大鼠纖維化形成過程減慢，當給予補充促腎上腺素釋放物質時，這種現象消失，認為NE直接作用于肝臟，以調節并削弱瘦素對肝纖維化的促進作用〔10〕。由此可見，瘦素的促進纖維化的形成作用可能需要NE參與調節〔11〕。肝細胞作為肝臟的主要實質細胞，瘦素對于肝細胞的作用是否需要NE的介導仍不明確。本研究提示NE確實介導了肝細胞瘦素以及瘦素受體的表達，從而參與了肝纖維化的過程。但是NE對于肝細胞的生物學行為的調節作用仍不明確，關于瘦素和瘦素受體在肝纖維化形成過程中具體作用機制也需要進一步的實驗證實，以期為臨床上肝纖維化/肝硬化的治療提供更加精確的理論依據。

1 Goldenberg D,Santos JL,Hodgson MI,etal.Novel physiological and therapeutic implications of leptin〔J〕.Rev Med Chil,2014;142(6):738-47.

2 Polyzos SA,Kountouras J,Mantzoros CS.Leptin in nonalcoholic fatty liver disease:a narrative review〔J〕.Metabolism,2015;64(1):60-78.

3 Bruinstroop E,Fliers E,Kalsbeek A.Hypothalamic control of hepatic lipid metabolism via the autonomic nervous system〔J〕.Best Pract Res Clin Endocrinol Metab,2014;28(5):673-84.

4 Liu Y,Brymora J,Zhang H,etal.Leptin and acetaldehyde synergistically promotes α-SMA expression in hepatic stellate cells by an interleukin 6-dependent mechanism〔J〕.Alcohol Clin Exp Res,2011;35(5):921-8.

5 Weiskirchen R,Tacke F.Cellular and molecular functions of hepatic stellate cells in inflammatory responses and liver immunology〔J〕.Hepatobiliary Surg Nutr,2014;3(6):344-63.

6 Mazzoccoli G,Vinciguerra M,Oben J,etal.Non-alcoholic fatty liver disease:the role of nuclear receptors and circadian rhythmicity〔J〕.Liver Int,2014;34(8):1133-52.

7 Oben JA,Roskams T,Yang S,etal.Hepatic fibrogenesis requires sympathetic neurotransmitters〔J〕.Gut,2004;53(3):438-45.

8 劉 娜,張曉嵐.交感神經系統與肝纖維化〔J〕.臨床肝膽病雜志,2007;23(5):389-91.

9 Sigala B,McKee C,Oben JA,etal.Sympathetic nervous system catecholamines and neuropeptide Y neurotransmitters are upregulated in human NAFLD and modulate the fibrogenic function of hepatic stellate cells〔J〕.PLoS One,2013;8(9):e72928.

10 劉 娜,張曉嵐.肝纖維化過程中去甲腎上腺素各受體亞型表達的動態變化〔J〕.中華肝臟病雜志,2009;17(9):653-6.

11 劉 娜,張曉嵐,姚冬梅,等.去甲腎上腺素對體外肝星狀細胞系凋亡的影響〔J〕.基礎醫學與臨床,2008;28(1):64-9.

〔2015-08-12修回〕

(編輯 曹夢園)

河北省衛生廳課題(ZL20140250)

劉 娜(1979-)，女，博士，主治醫師，主要從事肝纖維化的治療研究。

R575.2

A

1005-9202(2017)02-0276-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.007

1 河北省人民醫院神經外二科