大鼠肺損傷模型建立及一氧化碳肺保護的作用機制

吳慰芳 張海萍 肖 顏

(南昌大學第四附屬醫院麻醉科，江西 南昌 330003)

大鼠肺損傷模型建立及一氧化碳肺保護的作用機制

吳慰芳 張海萍 肖 顏1

(南昌大學第四附屬醫院麻醉科，江西 南昌 330003)

目的 探討建立大鼠肺損傷模型一氧化碳(CO)肺保護的作用機制。方法 將28只SD大鼠按抽簽的方式分為對照組和研究組，均14只，其中7只為供體，7只為受體。摘除供體大鼠的肺部，將對照組的供肺進行12 h的保存，再進行1 h的靜脈血灌注。研究組在移植的過程中全程吸入低濃度的CO，至再灌注后1 h結束，余同對照組。抽取流入及流出供肺的血液進行對血氣分析，包括靜脈血CO2分壓(PvCO2)、靜脈血氧分壓(PvO2)、酸堿度(pH)、血紅蛋白(Hb)、動脈血氧分壓(PaCO2)、動脈血氧分壓(PaO2)的測定，20 min/次。再灌注期間對氣道峰壓(PawP)、肺動脈壓(mPAP)、PaO2進行測定；再灌注完成后對肺組織干濕比(W/D)、白細胞介素(IL)-8、丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶(MPO)進行測定，20 min/次。結果 各時段的PvCO2、PvO2、pH、Hb水平均無明顯變化(P>0.05)；隨著灌注時間的增加，PaCO2、mPAP、PawP水平逐漸上升，而PaCO2水平逐漸下降；在第40、60 min時，研究組的PawP水平明顯低于對照組(P<0.05)；在第20、40、60 min時，研究組PaO2水平均明顯高于對照組、mPAP低于對照組(P<0.05)；研究組的IL-8、MDA、W/D、MPO水平均明顯低于對照組(P<0.05)。結論 在肺移植的過程中全程吸入低劑量的CO，可有效改善供肺功能，減輕供肺的缺血再灌注損傷，對肺保護具有重要意義。

肺損傷；動物模型；一氧化碳

肺移植術后早期死亡的原因主要和早期移植功能障礙有關，其發病率高達20%左右〔1〕。早期移植功能障礙出現在肺移植術后72 h之內，低氧血壓、肺水腫等是其主要特征。大部分學者認為肺移植缺血再灌注損傷是引發早期移植功能障礙的主要原因〔2〕。因此，對肺損傷的機制和病理過程進行深入的研究，可為降低早期移植功能障礙的發生率、提高肺移植手術的成功率提供有力的證據〔3〕。一氧化碳(CO)是亞鐵紅素在血紅素加氧酶的作用下分解后的一種產物。文獻報道〔4〕，CO在機體內可調控炎癥反應，對于臟器移植、肺臟的損傷反應具有重要的作用。本研究通過建立大鼠肺移植模型，在移植的過程中全程吸入低劑量的CO，比較分析CO對肺的保護機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將28只SD大鼠按抽簽的方式分為對照組和研究組，均14只，其中7只為供體，7只為受體。對照組大鼠雄性8只，雌性6只；體重250～350 g，平均(289.12±13.65)g；周齡15～20 w，平均(17.38±1.64)w。研究組大鼠雄性9只，雌性5只；體重260～360 g，平均(292.84±12.69)g；周齡16～21 w，平均(18.02±2.01)w。所有大鼠均由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供。兩組大鼠性別、體重、周齡相比無統計學差異(P>0.05)。

1.2 方法 將50 mg/kg的1%巴比妥鈉(天津藥業集團新鄭股份有限公司，國藥準字H41025613)注射至大鼠的腹腔中，待麻醉成功后將其仰臥并固定在手術臺上，將供肺摘除。在肺動脈進行插管，將30 ml的4℃低鉀右旋糖苷液灌入管內，接著把供肺放入溫度4℃低鉀右旋糖苷液內，保存12 h。對兩組受體大鼠的左總頸靜脈實施游離，在頸靜脈實施插管，和循環管道相連接。對左股動脈實施游離，在股動脈進行插管，和動脈測壓管相連接。把Langerdoff灌注裝置和供肺實施實施連接，把受體大鼠和供肺的循環管道相連接，將1 m的靜脈血灌入管道。給予100%的O2讓對照組大鼠在供肺移植的全程吸入，同時給予O2和500×10-6CO混合氣體讓研究組大鼠通過呼吸機全程吸入。利用監測儀對吸入的CO濃度實施監測，以保持CO濃度不發生變化，余同對照組。見圖1。

1.3 觀察指標 觀察兩組大鼠的再灌注期間氣道峰壓(PawP)、肺動脈壓(mPAP)、動脈血氧分壓(PaO2)、肺組織干濕比(W/D)、白細胞介素(IL)-8、丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶(MPO)。再灌注完成后，將部分左上肺實施稱重，放進溫度為100℃的烘箱中，24 h之后將其取出并進行稱重，計算出W/D。再灌注1 h之后，將0.1 g的肺組織進行漂洗并將血液取出，制成10%的勻漿，應用比色法對MDA進行測定〔5〕；應用雙抗體夾心酶聯免疫法對IL-8的含量進行測定〔6〕。在供體肺循環灌注的第1、20、40、60 min對PaO2、PawP、mPAP進行記錄。抽取流入及流出供肺的血液進行對血氣分析，靜脈CO2分壓(PvCO2)、靜脈氧分壓(PvO2)、酸堿飽和度(pH)、血紅蛋白(Hb)、血二氧化碳分壓(PaCO2)、血氧分壓(PaO2)的測定，20 min/次，并記錄供肺的PawP及mPAP，并進行對比。

1.4 統計學方法 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1 再灌注不同時段流入供體肺血氣分析結果 各時段的PvCO2、PvO2、pH、Hb均無明顯變化(P>0.05)。見表1。

2.2 再灌注各時段流出供體肺的動脈血情況 隨著灌注時間的增加，PaCO2、mPAP、PawP水平逐漸上升，而PaCO2水平逐漸下降；各時段PawP相比差異顯著(P<0.05)；在第40、60 min時PaCO2水平均明顯低于第1、20 min(P<0.05)；在第40、60 min時mPAP水平均明顯高于第1、20 min(P<0.05)。見表2。

2.3 兩組不同時段PawP的變化 在第1、20 min時，兩組PawP相比無統計學差異(P>0.05)；在第40、60 min時，研究組的PawP明顯低于對照組(P<0.05)。見表3。

2.4 兩組不同時段mPAP、PaO2的變化 在第1 min時，兩組mPAP相比無統計學意義(P>0.05)；在第20、40、60 min時，研究組的mPAP明顯高于對照組(P<0.05)。見表4。

表1 再灌注不同時段流入供體肺血氣分析結果±s,n=7)

表2 再灌注不同時段流出供體肺的動脈血情況±s,n=7)

與1 min比較：1)P<0.05；與40 min比較：2)P<0.05

表3 兩組不同時段PawP的變化對比

表4 兩組不同時段mPAP的變化對比

2.5 兩組不同時段PaO2的變化 1 min時，兩組PaO2無統計學意義(P>0.05)；20、40、60 min時，研究組的PaO2明顯低于對照組(P<0.05)。見表5。

2.6 兩組IL-8、MDA、W/D、MPO比較 研究組IL-8、MDA、W/D、MPO水平均明顯低于對照組(P<0.05)。見表6。

表5 兩組不同時段PaO2的變化對比

表6 兩組IL-8、MDA、W/D、MPO對比

3 討 論

隨著肺移植手術的成功率不斷提高，其已成為治療終末期肺病的一種有效方法，但術后大約有20%出現早期移植功能障礙，主要原因為缺血再灌注損傷〔7〕。從供體腦死亡開始至移植肺再灌注之前，細胞內的鈣穩態失調、氧自由基及脂質過氧化反應、肺缺血再灌注損傷體液因子作用、肺缺血再灌注損傷和細胞凋亡、中性粒細胞大量浸潤導致過度的炎癥反應等有可能造成缺血再灌注損傷〔8〕。由于吸入CO是導致煤氣中毒的最主要原因，因此CO被認為具有很強的毒性〔9〕。通過對血紅素加氧酶的生物學作用、特性進行深入探索，發現CO是一種小分子氣體信使。CO雖可對機體的抗損傷作用進行增強，但應用增加CO對生病理性的變化實施減輕及對機體實施保護的方法比較復雜，不容易進行準確的調控〔10〕。據相關文獻報道〔11〕，在肺損傷的氧化反應中吸入低劑量的CO，具有一定程度的抗細胞凋亡、抗氧化的作用。

本研究提示供肺功能下降、出現缺血再灌注損傷，大鼠肺損傷模型建立成功；各時段的PvCO2、PvO2、PH、Hb均無明顯變化，說明可以為供肺提供穩定動脈血，解決了因血流動力學不穩定而導致的相應體液因素的改變。本研究結果提示吸入低劑量的CO可有效改善氧合功能，減輕肺水腫，降低肺血管阻力，改善肺損傷的情況。原因為吸入低劑量的CO，將MDA和MPO的水平進行降低，對多形核白細胞的聚集、缺血再灌注損傷中的氧化應激、IL-8的釋放實施一定程度的抑制，進而達到減輕炎癥反應、氧化損傷的目的。MPO存在于多形核白細胞內，組織中多形核白細胞的浸潤程度和其活性呈正比，普遍將其作為多形核白細胞浸潤的指標。MDA是硫巴比妥酸反應的一種產物，可以將肺組織脂質過氧化的水平反映出來。IL-8是促使多形核白細胞的激活和遷移的一種細胞因子，再灌注后其水平不斷上升，對再灌注損傷起著比較重要的作用。

綜上，在肺移植的過程中全程吸入低劑量的CO，可有效改善供肺功能，減輕供肺的缺血再灌注損傷，對肺保護具有重要意義。

1 潘東峰，梁詩頌，肖紅燕，等.百草枯誘導的急性肺損傷大鼠肺表面活性物質的表達及其意義〔J〕.中華醫學雜志，2015；95(46)：3762-5.

2 Song Z，Zhao X，Gao Y，etal.Recombinant human brain natriuretic peptide ameliorates trauma-induced acute lung injury via inhibiting JAK/STAT signaling pathway in rats〔J〕.J Trauma Acute Care Surg，2015；78(5)：980-7.

3 陳 燕，余常輝，潘妙霞，等.基質金屬蛋白酶9在Wistar大鼠與自發性高血壓大鼠煙熏肺損傷中的變化〔J〕.中華醫學雜志，2015；95(18)：1415-20.

4 李百玲，柴家科，胡 泉，等.外源性肺泡表面活性物質對重度燒沖復合傷大鼠急性肺損傷的治療作用〔J〕.中華醫學雜志，2015；95(2)：133-7.

5 Zhao J,Pan G,Wang B，etal.A fresh frozen plasma to red blood cell transfusion ratio of 1：1 mitigates lung injury in a rat model of damage control resuscitation for hemorrhagic shock〔J〕.Am J Emerg Med，2015；33(6)：754-9.

6 Aksu B,Ayvaz S,Aksu F，etal.Effects of sphingosylphosphorylcholine against oxidative stress and acute lung injury induced by pulmonary contusion in rats〔J〕.J Pediatr Surg，2015；50(4)：591-7.

7 王 濤，魏曉永，劉 博，等.鹽酸戊乙奎醚對新生大鼠內毒素性急性肺損傷時TLR4 mRNA表達的影響〔J〕.中華麻醉學雜志，2015；35(7)：883-5.

8 Lai TS,Wang ZH,Cai SX,etal.Mesenchymal stem cell attenuates neutrophil-predominant inflammation and acute lung injury in an in vivo rat model of ventilator-induced lung injury〔J〕.Chin Med J，2015；128(3)：361-7.

9 Wang F,Meng Y,Zhang Y，etal.Ketamine reduces lipopolysaccharide-induced high-mobility group box-1 through heme oxygenase-1 and nuclear factor erythroid 2-related factor 2/ p38 mitogen-activated protein kinase〔J〕.J Surg Res，2015；194(2)：599-613.

10 Matsuo S,Saiki S,Adachi O，etal.Single-dose rosuvastatin ameliorates lung ischemia-reperfusion injury via upregulation of endothelial nitric oxide synthase and inhibition of macrophage infiltration in rats with pulmonary hypertension〔J〕.J Thorac Cardiovasc Surg，2015；149(3)：902-9.

11 李 瑞，劉江偉，錢建輝，等.沙漠干熱環境創傷失血性休克大鼠繼發性肺損傷時一氧化氮合酶等變化研究〔J〕.中華急診醫學雜志，2015；24(2)：163-8.

〔2016-10-27修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

江西省衛生廳課題(No.20123082)

吳慰芳(1964-)，女，副主任醫師，主要從事麻醉學研究。

R657.51

A

1005-9202(2017)02-0274-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.006

1 南昌大學第四附屬醫院手術室