大黃酚對局灶性腦缺血再灌注小鼠缺血半暗帶區環氧化酶2和基質金屬蛋白酶-9表達的影響

房亞蘭 黃語悠 趙詠梅 李錦程 段云霞 趙海蘋 高 利 羅玉敏

(首都醫科大學宣武醫院 北京市老年病醫療研究中心 神經變性病教育部重點實驗室 腦血管病轉化醫學北京市重點實驗室，北京 100053)

· 腦血管病、認知障礙的基礎及臨床研究 ·

大黃酚對局灶性腦缺血再灌注小鼠缺血半暗帶區環氧化酶2和基質金屬蛋白酶-9表達的影響

房亞蘭 黃語悠 趙詠梅*李錦程 段云霞 趙海蘋 高 利 羅玉敏

(首都醫科大學宣武醫院 北京市老年病醫療研究中心 神經變性病教育部重點實驗室 腦血管病轉化醫學北京市重點實驗室，北京 100053)

目的 探究大黃酚(Chrysophanol， CHR)對大腦中動脈梗死(middle cerebral artery occlusion， MCAO)模型小鼠再灌注后腦內環氧化酶2(cyclooxygenase-2， COX2)和基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9， MMP-9)表達的影響，探討CHR保護腦缺血再灌注損傷的抗炎機制。方法采用數字表法隨機將18只健康雄性C57BL小鼠分為3組:假手術(Sham)組、MCAO組、CHR組(小鼠造模當天按0.1 mg/kg腹腔注射CHR，此后每天1次，連續給藥14 d)，每組6只。使用線栓法制作小鼠右側大腦中動脈缺血45 min再灌注模型。術中監測小鼠肛溫，使其維持在正常范圍。于再灌注后14 d處死小鼠，迅速取腦，用免疫熒光染色檢測小鼠腦組織冰凍切片缺血半暗帶區COX2和MMP-9的表達，并用免疫熒光雙標法對COX2和MMP-9在缺血腦組織的表達進行細胞定位。結果1)Sham組小鼠偶見COX2或MMP-9染色陽性細胞。與Sham組相比，MCAO組小鼠腦缺血半暗帶區COX2和MMP-9的表達明顯增高(P<0.05)。2)與MCAO組相比，給予CHR治療后，缺血再灌注小鼠腦缺血半暗帶區COX2和MMP-9的表達均明顯減少(P<0.05)。3)缺血再灌注小鼠腦缺血半暗帶區，COX2或MMP-9免疫熒光染色分別與神經元標志物NeuN免疫熒光染色共定位。結論CHR可能通過抑制COX2和MMP-9的蛋白表達，減輕炎性反應，從而對腦缺血再灌注損傷發揮長期的神經保護作用。

腦缺血；大黃酚；炎性反應；大腦中動脈梗死；環氧化酶2；基質金屬蛋白酶-9

缺血性腦卒中是由于腦血管狹窄或閉塞導致腦組織供血障礙引起的神經系統損害。它是造成成人永久性殘疾的主要原因，也是世界范圍內導致死亡的直接原因之一[1]。腦缺血/再灌注損傷機制非常復雜，有眾多的細胞因子參與其中，最終啟動凋亡信號通路，導致神經元凋亡或死亡。其中，炎性反應在缺血性腦損傷過程中扮演著重要的角色[2-3]。因而，抑制腦缺血/再灌注過程中的炎性反應是一個頗具吸引力的治療策略[4]。

在中國，應用大黃治療腦損傷的歷史悠久，大黃酚(Chrysophanol， CHR)是大黃蒽醌類中一種純化的活性成分[5]，一些研究[6-7]表明，CHR對腦缺血再灌注損傷具有神經保護作用。但目前關于CHR在神經保護作用方面的相關機制的基礎研究還十分有限。

環氧化酶2(cyclooxygenase-2， COX2)是花生四烯酸合成炎性介質前列腺素的限速酶，生理狀態下，COX2幾乎不表達[8]。研究[9]表明，局灶性腦缺血大鼠缺血30 min時，COX2在缺血半暗帶區及扣帶回的表達顯著增加，抑制COX2的表達能減輕腦缺血損傷[10]。基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9， MMP-9)是基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase， MMPs)家族成員之一，能特異性地降解膠原蛋白、彈性蛋白等細胞外基質，在缺血性腦梗死病人的血清中，MMP-9顯著增加[11]。研究[12]顯示，敲除MMP-9基因的腦缺血再灌注小鼠能顯著減小腦梗死體積，降低腦缺血損傷，表明MMP-9與腦缺血損傷過程密切相關。因此，本研究采用大腦中動脈梗死(middle cerebral artery occlusion， MCAO)再灌注模型小鼠，觀察CHR對模型小鼠腦缺血再灌注后14 d COX2和MMP-9表達的影響，從而進一步探討CHR長期拮抗腦缺血再灌注損傷的抗炎機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設備

小動物手術顯微鏡(Carl Zeiss公司，德國)、麻醉機(Harvard Apparatus公司，美國)、反饋式溫度調節儀(CMA 150，Carnegie Medicin公司，瑞典)、雙極電凝器(德威公司，DEVEL，ACC100)、熒光顯微鏡(Nikon公司，日本)。

1.2 試劑

恩氟烷(河北一品制藥有限公司)；CHR(中國食品藥品檢定研究院)；Tween 80(Sigma公司，美國)；COX2抗體(CST公司，美國)；MMP-9抗體(Abcam公司，美國)；NeuN抗體(Millipore公司，美國)等。

1.3 實驗動物及分組

2月齡健康雄性C57BL小鼠，實驗動物許可證號：SCXK(京) 2012-0001(北京維通利華實驗動物公司)，體質量(23.5±1) g，于SPF級動物實驗室飼養。將18只小鼠按照數字表法隨機分為3組：假手術(Sham)組、MCAO組、CHR組。CHR溶于含有1%(體積分數) Tween 80和1%(體積分數) DMSO的0.9%(質量分數)的氯化鈉注射液中，CHR組小鼠造模當天按0.1 mg/kg腹腔注射CHR，此后每天1次，連續給藥14 d，Sham組和MCAO組小鼠腹腔注射同等體積的含1%(體積分數) Tween 80和1%(體積分數) DMSO的0.9%(質量分數)的氯化鈉注射液。

1.4 動物模型制作

MCAO模型按照改良ZeaLonga法制備。將恩氟烷混合于70%(體積分數)N2O和30%(體積分數)O2中，首先用5%(體積分數)恩氟烷誘導麻醉，然后用面罩吸入2%(體積分數)恩氟烷維持麻醉。于小鼠頸部沿正中線切口，分離右側的頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，將頭端直徑為0.38 mm的尼龍線栓自頸外動脈殘端插進頸內動脈，到達距頸外動脈和頸內動脈分叉約1 cm處。使用反饋性控溫毯監測術中小鼠肛溫，將其維持在(37.0±0.5)℃。缺血45 min后，將線栓小心地拔出進行再灌注。術后小鼠飼養于SPF級動物實驗室14 d，自由進食飲水。

1.5 免疫熒光雙標

各組小鼠于造模后14 d，用水合氯醛腹腔注射麻醉后，快速斷頭取腦，于4%(質量分數)多聚甲醛后固定48 h，30%(質量分數)蔗糖脫水24 h，行連續冰凍切片(厚度為20 μm)。將腦組織冰凍切片經PBS洗后，用含有0.2%(體積分數)TritonX-100的PBS孵育約10 min，PBS洗后，用5 %(體積分數)的山羊血清在室溫下封閉30 min，滴加一抗(COX2兔多克隆抗體 1∶100，MMP-9兔多克隆抗體 1∶500，NeuN鼠多克隆抗體 1∶300)，4 ℃孵育過夜。次日將切片取出，PBS洗后，滴加山羊抗兔和山羊抗鼠熒光二抗(1∶300)，在室溫下避光孵育1 h。PBS洗后，最終用含DAPI(4’，6-diamidino-2-phenylindole)的封片劑封片。在熒光顯微鏡下觀察腦皮質半暗帶區[9]。陰性對照組用PBS代替一抗。在相同放大倍數下，使用相同參數，每張腦組織冰凍切片隨機選取4個視野照相，用NIS Element軟件統計COX2和MMP-9的陽性細胞數目。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 CHR抑制MCAO小鼠腦缺血半暗帶區COX2的表達

免疫熒光染色結果可見，Sham組小鼠腦組織偶見COX2綠色熒光染色；在MCAO小鼠缺血側額頂葉皮質和紋狀體有大量的COX2陽性細胞，MCAO組小鼠缺血半暗帶區COX2染色陽性細胞顯著增加；與MCAO組相比，CHR組小鼠缺血半暗帶區COX2染色陽性細胞數目顯著減少(圖1 A)，差異具有統計學意義(P<0.05，圖1 B)。

2.2 CHR抑制MCAO小鼠腦缺血半暗帶區MMP-9的表達

免疫熒光染色結果顯示，Sham組小鼠腦組織可見少量MMP-9綠色熒光染色，散在分布于大腦皮質和海馬組織。MCAO組小鼠腦缺血半暗帶區MMP-9染色陽性細胞明顯增多。與MCAO組相比，CHR組小鼠腦缺血半暗帶區MMP-9的表達明顯減少(圖2 A)，差異具有統計學意義(P<0.05，圖2 B)。

2.3 MCAO小鼠腦缺血半暗帶區域COX2、MMP-9與NeuN共定位

免疫熒光雙標結果可見，在MCAO小鼠腦缺血半暗帶區域COX2陽性細胞及MMP-9陽性細胞，均呈綠色熒光。NeuN染色陽性細胞呈紅色熒光。所有細胞的胞核為藍色熒光。合并圖像后，發現綠色與紅色熒光相重合，表明COX2和MMP-9與神經元共定位，該結果提示，腦缺血再灌注后神經元內COX2及MMP-9的表達增加(圖1、2)。

圖1 Sham組、MCAO組及CHR組小鼠再灌注14 d腦缺血半暗帶區COX2/NeuN免疫熒光雙標結果

A:representative double immunofluorescence staining for COX2 (green) and neuron-specific NeuN (red) on 14th day after reperfusion. Bar=20μm. B: comparison of the numbers of COX2-positive immunoreactive cells in Sham， MCAO and CHR group mice.*P<0.05vssham group，#P<0.05vsMCAO group，n=5; MCAO: middle cerebral artery occlusion; DAPI: 4’，6-diamidino-2-phenylindole; CHR:Chrysophanol.

A:representative double immunofluorescence staining for MMP-9 (green) and neuron-specific NeuN (red) on 14th day after reperfusion. Bar=20μm. B: comparison of the numbers of MMP-9-positive immunoreactive cells in Sham， MCAO and CHR group mice.*P<0.05vsSham group，#P<0.05vsMCAO group，n=5; MCAO: middle cerebral artery occlusion; DAPI: 4’，6-diamidino-2-phenylindole；CHR：Chrysophanol；MMP-9：matrix metalloproteinase-9.

3 討論

炎性反應可增加缺血性卒中的嚴重程度，在腦缺血再灌注損傷過程中發揮了重要作用[2]。核因子-κΒ(nuclear factor-kappa Β， NF-κΒ)是一個參與調節多種炎性細胞因子表達的核轉錄因子，在許多炎性疾病中發揮舉足輕重的作用。據報道[13]，NF-κB的活化與缺血再灌注損傷過程中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)濃度的顯著升高有關。本課題組最新的研究[14]表明，再灌注后14 d，CHR仍能顯著抑制MCAO小鼠腦缺血半暗帶區內NF-κΒ的活化和TNF-α、IL-1β的表達，提示CHR通過抑制NF-κΒ的活化，下調TNF-α、IL-1β的表達，進而發揮長期的神經保護作用。然而有關CHR神經保護作用的相關機制目前尚不十分清楚，本研究通過免疫熒光染色方法檢測腦缺血半暗帶區COX2和MMP-9的表達情況，進一步探討CHR拮抗腦缺血再灌注損傷的抗炎機制。

NF-κΒ信號通路和COX2廣泛參與腦缺血再灌注中的炎性反應[15-18]。NF-κΒ p65從細胞質轉位到細胞核引起NF-κΒ的活化，進而促進應答基因的轉錄。COX2是NF-κΒ的一個下游靶基因，活化的NF-κΒ可以促使COX2基因轉錄，已有研究[9-10，15]表明，腦缺血可引起COX2的產生，介導有害的炎性反應，參與腦缺血損傷。為了闡明CHR減輕腦缺血損傷炎性反應的機制，本研究采用免疫熒光染色方法觀察CHR對MCAO小鼠腦缺血半暗帶區COX2表達的影響。結果顯示，MCAO小鼠再灌注14 d時腦缺血半暗帶區COX2的表達仍比Sham組顯著增加，高表達的COX2可促使促炎介質和氧自由基的增多，也能直接損傷神經細胞，導致細胞死亡[16，19]，因此，本研究中MCAO小鼠再灌注14 d時 COX2表達增加，可加重腦缺血損傷。給予MCAO小鼠CHR治療14 d后，腦缺血半暗帶區COX2的表達明顯減少，說明CHR對COX2的產生有抑制作用。本課題組最近的研究[14]結果顯示，CHR能顯著改善MCAO小鼠再灌注后14 d的神經功能評分，明顯減少因腦缺血導致的腦組織損失，并且抑制NF-κΒ的活化。結合本研究結果，提示CHR可能通過抑制NF-κΒ活化，減少COX2的表達，進而減輕炎性損傷，發揮長期的神經保護作用。

已有研究[12]表明，急性腦梗死病人血清中MMP-9的濃度與腦梗死體積呈正相關，且COX2和MMP-9的表達呈正相關[20]。為了進一步闡明CHR拮抗腦缺血損傷的機制，本研究采用免疫熒光染色法觀察CHR對MCAO小鼠腦缺血半暗帶區MMP-9表達水平的影響。結果表明，MCAO小鼠再灌注14 d時腦缺血半暗帶區MMP-9的表達仍比Sham組顯著增多，提示此時MMP-9仍參與腦缺血損傷。本課題組最近的研究[14]表明，CHR能抑制MCAO小鼠腦組織內NF-κΒ的活化，而活化的NF-κΒ可誘導MMP-9轉錄[21]，因此，在本研究中，CHR可能通過抑制NF-κΒ的活化，進而抑制了MMP-9的表達。有關癌癥的研究[20]顯示，COX2可能通過促進前列腺素合成，間接促進MMP-9表達，也可能直接促進MMP-9產生。因此，本研究中，給予CHR治療的MCAO小鼠，其MMP-9的表達顯著減少，可能是CHR通過降低COX2的表達實現的。

COX2參與遠隔缺血預適應對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用[10]，敲除MMP-9基因的MCAO小鼠再灌注后腦梗死體積明顯降低[12]，抑制腦缺血再灌注大鼠腦內COX2和MMP-9的表達，能有效改善其神經細胞凋亡[22-23]。為了闡明MCAO小鼠腦缺血半暗帶區COX2、MMP-9是否在神經元中的表達增加，本研究采用免疫熒光雙標染色法將COX2和MMP-9分別與神經元標志物NeuN進行共染色。結果顯示，MCAO小鼠腦缺血半暗帶區COX2和MMP-9分別與神經元共定位，提示COX2和MMP-9很可能參與腦缺血再灌注損傷過程中神經元的凋亡。

本研究以上的結果提示，給予MCAO小鼠CHR治療能降低COX2的表達，進而抑制MMP-9的表達，減輕炎性反應，從而對腦缺血再灌注損傷起到長期的神經保護作用。本研究進一步為深入探討CHR發揮神經保護作用的抗炎機制提供了相關的科學依據。

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編輯 陳瑞芳

Effects of chrysophanol on the expressions of cyclooxygenase-2 and matrix metalloproteinase-9 in the penumbra of mice following focal cerebral ischemia/reperfusion

Fang Yalan， Huang Yuyou， Zhao Yongmei*， Li Jincheng， Duan Yunxia， Zhao Haiping， Gao Li， Luo Yumin

(XuanwuHospital，CapitalMedicalUniversity，BeijingGeriatricMedicalResearchCenter，KeyLaboratoryofNeurodegenerativeDiseasesofMinistryofEducation，BeijingKeyLaboratoryofTranslationalMedicineforCerebrovascularDiseases，Beijing100053，China)

Objective To explore the effects of Chrysophanol (CHR) on the expression levels of cyclooxygenase-2 (COX2) and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in mice with middle cerebral artery occlusion (MCAO)/reperfusion injury and to investigate the potential anti-inflammatory mechanism of CHR. Methods Eighteen male C57BL mice were divided into 3 groups randomly: Sham group (n=6)， MCAO group (n=6)， and CHR group [mice received 0.1 mg/kg CHR (i.p.) for 14 days after ischemia/reperfusion]. MCAO was induced by using the suture method. The mice underwent 45 min of right MCAO， and then reperfusion by withdrawing filament. Rectal temperature was monitored and kept in normal range during the operation. The mice were sacrificed and the brains were harvested on 14 d after reperfusion. The expressions of COX2 and MMP-9 were detected by immunofluorescent staining. And the cellular location of COX2 and MMP-9 were detected by double immunofluorescence labeled antibody technique. Results 1) In Sham group， little COX2 positive cells and MMP-9 positive cells were observed. Compared with Sham group， the number of COX2 positive cells and MMP-9 positive cells increased significantly in the penumbra of MCAO group (P<0.05). 2) Compared with MCAO group， the number of COX2 positive cells and MMP-9 positive cells decreased significantly in the penumbra of MCAO+CHR group on day 14 after reperfusion (P<0.05). 3) COX2-positive immunoreactive cells were colocalized with the general neuronal marker， NeuN， in the penumbra of ischemia/reperfusion mice. And MMP-9-positive immunoreactive cells were colocalized with NeuN. Conclusion CHR has long-term neuroprotective effect against ischemia/reperfusion injury which might be attributed to its anti-inflammatory actions by decreasing the expression of COX2 and MMP-9.

cerebral ischemia; Chrysophanol; inflammatory middle cerebral artery occlusion; cyclooxygenase-2; matrix metalloproteinase-9

國家臨床重點專科(中醫，財社122號)，北京市自然科學基金(7122036)。This study was supported by National Key Clinical Specialty (Traditional Chinese Medicine， No.122)，Natural Science Foundation of Beijing (7122036).

時間：2017-01-17 23∶22

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170117.2322.010.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.01.010]

R 743.3

2016-11-28)

*Corresponding author， E-mail：yongmeizhao@hotmail.com