藍莓間座殼莖潰瘍病病原鑒定及生物學特性研究

李 媛, 石凌波, 費諾亞, 傅俊范, 嚴雪瑞

(沈陽農業大學植物保護學院,沈陽 110866)

藍莓間座殼莖潰瘍病病原鑒定及生物學特性研究

李 媛, 石凌波, 費諾亞, 傅俊范, 嚴雪瑞*

(沈陽農業大學植物保護學院,沈陽 110866)

在藍莓園進行病樣采集時,發現一種藍莓莖部病害,病斑呈紅褐色,潰瘍狀,長橢圓形。為明確該病害的病原菌種類,對病枝進行組織分離,經單孢純化后得到菌落形態一致的7株致病菌,對供試菌株的ITS與EF1-α基因聯合構建系統發育樹,供試菌株與Diaporthephaseolorum處于同一分支,結合形態學特征,鑒定該病原菌為Diaporthephaseolorum。對病原菌的生物學特性研究結果表明,該菌最適培養基為PDA,最適生長溫度為25℃,光照對菌絲生長無明顯影響。本文首次報道Diaporthephaseolorum引起藍莓莖潰瘍病。

藍莓; 間座殼屬; 莖潰瘍病; 鑒定

藍莓Vacciniumspp.,又名越橘、藍漿果,屬于杜鵑花科Ericaceae,越橘屬Vaccinium叢生灌木,果實營養豐富,20世紀80年代中期引進國內并開始大面積商業化種植栽培,隨著種植面積不斷擴大,藍莓病害問題也日益嚴重[1-2]。

間座殼屬病原菌可引起藍莓莖潰瘍病、藍莓果腐病等多種病害,國外已報道該屬危害藍莓種有Diaporthevaccinii[3]、D.ambigua[4]、D.australafricana[4]、D.neotheicola[4]、D.passiflorae[4]、D.viticola[5]、D.asheicola[5]、D.baccae[5]和D.sterilis[5]。我國目前已報道可侵染藍莓的種有D.vaccinii[6]和D.eres[7]。

2013-2014年在遼寧莊河市、丹東市,黑龍江伊春市,福建長汀縣藍莓園進行病樣采集時發現了一種藍莓莖部病害。病斑潰瘍狀,長橢圓形,紅褐色,后期呈灰白色。本研究對該病害進行病原菌分離純化以及柯赫氏法則證病,將引起該病害的病原菌與已經報道的間座殼屬病原菌在形態學、分子生物學以及發病癥狀上進行比較,確定在我國可侵染藍莓的間座殼屬病原菌種類。

1 材料方法

1.1 病原菌分離

采用組織分離法和單孢分離法對病樣進行病原菌分離和純化[8]。用無菌水沖洗病部枝條,在病健交界處切取5 mm×5 mm組織塊,用75%乙醇進行表面消毒30 s后放入0.1%升汞溶液中浸泡30 s,無菌水沖洗3次后置于PDA(馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂粉20 g,水1 000 mL)培養基上,在25℃,12 h光暗交替條件下培養3～7 d,挑取尖端菌絲純化,培養菌株至產生分生孢子,進行單孢純化,并將純化后的菌株保存在PDA斜面上,于4℃下保存備用。

1.2 病原菌致病性測定

采取活體植株接種菌餅的方法對分離得到的7株菌進行致病性測定,取兩年生健康藍莓植株,對藍莓枝條進行表面消毒,用無菌解剖刀制造環狀傷口,將直徑5 mm菌餅接種到傷口上,用無菌脫脂棉進行保濕處理,以無菌PDA塊作為對照,重復3次[4]。置于培養箱中培養(28℃,90%RH)。培養3 d后去掉菌餅,每隔3 d統計發病情況。

1.3 病原菌鑒定

(1) 形態學鑒定:取直徑5 mm的菌餅置于PDA上,在25℃、12 h光暗交替條件下培養5 ～7 d,觀察菌落形態。將菌餅放置于無菌苜蓿稈+WA培養基上[9]于25℃,黑暗培養,誘導菌株產生分生孢子器,觀察菌株產孢情況并測量兩種類型分生孢子及產孢結構大小,每種類型的孢子及分生孢子梗測量100個并取其平均值。

(2)分子生物學鑒定:用CTAB法提取菌株總DNA,以ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) /ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)以及EF1-728F(5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′)/EF1-986R(5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′)為引物分別擴增菌株ITS及EF1-α基因序列。反應體系以及反應程序參照Udayanga 等[10]的方法。擴增產物經凝膠電泳檢測后送至生工生物工程(上海)有限公司進行純化,測序。

(3) 序列分析:測序結果在NCBI/GenBank中進行比對,下載模式菌株及相關菌株序列以及藍莓上已經報道的間座殼屬菌株序列[3-4,7,10-12](表1)。用Mafft-win軟件進行序列比對后,對聯合基因分別采用最大簡約法(MP)及貝葉斯法(BI)進行分析,以DiaporthellacorylinaCBS121124作為外群。MP分析采用PAUP4.0b10進行,bootstrap重復值采用1 000,將供試序列導入MrMTgui軟件,預測出最佳進化模型,用Mrbayes軟件對供試序列進行BI分析。結合系統發育分析結果,挑選與供試菌株親緣關系較近的代表菌株序列,分別進行二次系統發育分析。

表1 用于ITS和EF1-α基因聯合構建藍莓間座殼潰瘍病菌系統發育分析的相關模式菌株基因登錄號

Table 1 ITS and EF1-α accession numbers in GenBank ofDiaportheisolates used for phylogenetic analyses in this study

種Species菌株號Strain寄主Host采集地Location基因登錄號GenBankaccessionno.ITSEF1-αD.alleghaniensis CBS495.72加拿大黃樺Betulaalleghaniensis加拿大CanadaKC343007KC343733D.vacciniiCBS160.32大果蔓越莓Oxycoccusmacrocarpus美國USAKC343228KC343954D.eresLNSY003藍莓Vacciniumsp.中國ChinaKJ867089KJ867090AR5196榆屬Ulmussp.德國GermanyKJ210533KJ210554D.infecundaCBS133812巴西胡椒木Schinusterebinthifolius 巴西BrazilKC343126KC343852D.ambiguaCBS114015西洋梨Pyruscommunis南非SouthAfricaKC343010KC343736D.terebinthifoliiCBS133180巴西胡椒木Schinusterebinthifolius巴西BrazilKC343216KC343942D.cuppateaCBS117499南非茶Aspalathuslinearis南非SouthAfricaKC343057KC343783D.melonisCBS507.78甜瓜Cucumismelo美國USAKC343142KC343868D.angelicaeCBS111592獨活Heracleumsphondylium奧地利AustriaKC343027KC343753D.dauciCBS315.49 胡蘿卜Daucuscarota荷蘭NetherlandsFJ889451GQ250348D.stewartii CBS193.36波斯菊Cosmosbipinnatus—FJ889448GQ250324D.sclerotioidesCBS296.67黃瓜Cucumissativus荷蘭NetherlandsKC343193KC343919D.siamensisMFLUCC100573——JQ619879JX275393D.australafricanaCBS111886葡萄Vitisvinifera澳大利亞AustraliaKC343038KC343764D.foeniculaceaCBS123208小茴香Foeniculumvulgare葡萄牙PortugalKC343104KC343830

續表1 Table 1(Continued)

種Species菌株號Strain寄主Host采集地Location基因登錄號GenBankaccessionno.ITSEF1-αCBS187.27茶樹Camelliasinensis意大利ItalyKC343107KC343833D.phaseolorumCBS116019Caperoniapalustris美國USAKC343175KC343901CBS116020Symphyotrichumsubulatum美國USAKC343176KC343902PS03大豆Glycinemax克羅地亞CroatiaHM347702HM347670Ar2牛蒡Arctiumlappa克羅地亞CroatiaHM347705HM347679D.sojaeCBS116023大豆G.max美國USAKC343198KC343440CBS127267大豆G.max克羅地亞CroatiaKC343199KC343925D.hongkongensisCBS115448常山Dichroafebrífuga中國香港HongKongKC343119KC343845D.novemCBS354.71玉竹Polygonatumodoratum羅馬尼亞RomaniaKC343158KC343884D.longicollaFAU644大豆G.max美國USAKJ590730KJ590769PL7大豆G.max克羅地亞CroatiaHM347699HM347683DiaporthearengaeCBS114979山棕Arengaengleri中國香港HongKongChinaKC343034KC343760Diaporthesp.CBS115595臺灣山桂花Maesaperlaria中國香港HongKongChinaKC343209KC343935CBS115584臺灣山桂花M.perlaria中國香港HongKongChinaKC343208KC343934D.passiflorae15.3.1r1大果蔓越莓Vacciniummacrocarpon智利ChileKC143196KC533444D.viticolaCBS113201葡萄Vitisvinifera葡萄牙PortugalKC343234KC343960D.asheicolaCBS136967兔眼藍莓Vacciniumashei智利ChileKJ160562KJ160594D.baccaeCBS136971高叢藍莓Vacciniumcorymbosum意大利ItalyKJ160564KJ160596D.sterilisCBS136969高叢藍莓V.corymbosum意大利ItalyKJ160579KJ160611Diaporthellacoryli-naCBS121124榛屬Corylussp.中國ChinaKC343004KC343730

1.4 病原菌生物學特性研究

將直徑5 mm的菌餅分別置于不同培養基 (PDA、Czapek培養基、WA,胡蘿卜培養基、藍莓莖煎汁培養基),不同光照條件(分別在全光照、全黑暗、12 h光暗交替、24 h光暗交替),在25℃下培養,分別于5、7、9 d后測量菌落直徑,每個處理重復3次。

研究不同溫度對供試菌株生長狀況的影響,選用5 mm的菌餅作為出發菌落直徑,分別置于15、20、25、27和30℃的PDA 平板上培養,培養5、7和9 d后分別測量菌落直徑,每個處理重復3次。采用軟件Excel 和SPSS 17.0對數據進行整理和分析。

2 結果分析

2.1 病原菌分離

病樣經過組織分離后得到菌落形態一致的7株白色菌株,菌株編號及序列登錄號見表 2。

表2 從藍莓上分離得到的莖潰瘍病病原菌株

Table 2 Isolates of the pathogen of the blueberry stem canker

菌株號Strainno.寄主Host采集地Location基因登錄號GenBankaccessionno.ITSEF1-αLNZH041藍莓Vacciniumsp.遼寧莊河Zhuanghe,LiaoningKU375746KU685380LNZH087B藍莓Vacciniumsp.遼寧莊河Zhuanghe,LiaoningKU375749KU685383LNZH076A藍莓Vacciniumsp.遼寧莊河Zhuanghe,LiaoningKU375748KU685382LNDD007藍莓Vacciniumsp.遼寧丹東Dandong,LiaoningKU375738KU685371LNDD011藍莓Vacciniumsp.遼寧丹東Dandong,LiaoningKU375740KU685373FZXM061A藍莓Vacciniumsp.福建長汀Changting,FujianKU375716KU685349HLJYC010藍莓Vacciniumsp.黑龍江伊春Yichun,HeilongjiangKU375717KU685350

2.2 病原菌致病性測定

在28℃條件下,接種3 d后接種部位出現深褐色凹陷病斑,病斑長3～5 mm,病斑環莖,接種9 d后,病斑繼續擴展,病斑長10～20 mm,病部中間深褐色,病斑周圍淡褐色,對照不發病。將回接發病的藍莓莖部進行再次組織分離,得到與原接種菌株相同的菌株(圖1a,d)。

2.3 病原菌形態學鑒定及生物學特性

菌株在PDA培養基上,25℃、12 h光暗條件下培養7 d。菌落直徑達到90 mm,菌落白色毛氈狀,菌絲較為致密,形成不規則的同心輪紋(圖1b)。在PDA上20 d左右可無規則散生或聚生球形或近球形黑色分生孢子器,分生孢子器頂部分泌不規則黃色分生孢子角。在苜蓿稈上培養15 d左右可以誘導出分生孢子器,通過誘導產生的分生孢子器形態與PDA上產生的分生孢子器相同(圖1e,f)。鏡檢分生孢子器及孢子,分生孢子梗(16.04～24.57)μm×(1.92～2.42)μm(圖1g),產生兩種類型分生孢子,α型孢子(5.95～7.92)μm×(1.64～2.59)μm,無色透明,單孢,橢圓形,含2個油球,β型孢子(6.69～19.79)μm×(0.62～1.18)μm無色透明,單胞,線形,一端較直,另一端稍彎,沒有觀察到γ型分生孢子(圖1c)。

在不同培養基、不同光照及不同溫度條件的試驗結果表明:供試菌株適宜在PDA上生長,在PDA上生長最快,7 d菌落直徑90 mm。在不同溫度條件下菌株生長速度快慢順序為25℃>30℃>27℃>20℃>15℃,菌株在25℃條件下生長快,7 d菌落直徑為90 mm,在15℃和20℃條件下菌絲生長速度最慢,培養9 d菌絲仍未長滿整個培養皿(90 mm)。光照對菌絲生長無明顯影響,在4種條件下菌絲均能正常生長。

圖1 藍莓莖潰瘍病癥狀及病原菌形態特征Fig.1 Symptoms of the blueberry stem canker and morphological characteristics of the pathogen

2.4 分子生物學鑒定

供試菌株的ITS序列長度為555～584 bp,EF1-α序列長度為323 bp,將其與GenBank下載的模式菌株的序列進行單獨及聯合系統發育樹分析。基于聯合基因的系統發育樹結果顯示,供試菌株與Ar2、PS03、CBS116019及CBS116020歸為一個類群(PP值1/BS值99),位于Diaporthephaseolorum種群內,與已報道的D.vaccinii、D.ambigua、D.australafricana、D.neotheicola(現已歸入D.foeniculacea)、D.viticola、D.asheicola、D.baccae、D.sterilis和D.passiflorae及D.eres處于不同的分支(圖2)。結合形態學特征,鑒定該病原菌為Diaporthephaseolorum。

圖2 基于ITS和EF1-α基因聯合構建的藍莓間座殼潰瘍病菌的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic analysis based on combined ITS and EF1-α gene sequences of the blueberry stem canker

3 結論與討論

間座殼屬真菌無性型為擬莖點霉屬Phomopsis,可作為植物的致病菌及內生菌[10],也可侵染人類皮膚[13],具有廣泛的寄主范圍,間座殼屬真菌作為致病菌通常引起植物的潰瘍、枯死、根腐、果腐、葉斑病、枯萎病,可造成植物大面積枯萎[14]。

Diaporthephaseolorum可引起大豆莖潰瘍病[15],也是葡萄、菜豆等重要經濟作物的病原菌[11],本研究首次在藍莓上分離到該種。現在對于間座殼屬真菌的鑒定通常采用分子生物學的方法,已經有許多運用ITS序列結合形態學特征來鑒定間座殼屬真菌的研究:Murali等[16]研究來自柚木Tectonagrandis葉片內的11個內生菌株的ITS序列,支持來自柚木的間座殼屬菌株沒有寄主專化性這一結論。但ITS序列分析也在屬間顯示大量的交叉,多基因聯合分析比單個基因分析能夠更好地對菌株進行區分。例如Santos等和van Rensburg等[14,17]運用ITS和EF1-α序列結合形態學和菌落特征將引起南非博士茶Aspalathuslinearis頂梢枯死的間座殼屬菌株分為5個種。本文選擇供試菌株以及相關菌株的ITS與EF1-α基因聯合構建系統發育樹,能夠很好地將供試菌株與其近緣種(D.sojae、D.longicolla)及藍莓上已報道的間座殼屬其他種真菌進行區分。

本研究系統發育樹結果顯示D.vaccinii與D.eres親緣關系較近,D.neotheicola(現已歸入D.foeniculacea)與D.baccae具有較近的親緣關系,而D.viticola和D.asheicola為D.australafricana的近緣種,此結果與Lorenzo等的研究結果一致[5]。本文報道的D.phaseolorum不僅在系統發育上與藍莓上已報道的間座殼屬菌株處于不同分支,在菌落形態、侵染癥狀上也存在差異,Diaporthevaccinii在PDA上生長的菌落形態具有非常明顯的環狀輪紋,分層明顯[3],本試驗菌株菌落邊緣平坦,無明顯分層現象。由D.ambigua,D.australafricana,D.neotheicola和D.passiflorae引起的莖部病害呈不規則病斑,病斑周圍紅色,病菌從嫩枝侵入造成嫩枝枯死[7]。我國報道的Diaportheeres從藍莓枝條芽眼侵入,造成藍莓芽枯病[7]。在國外Diaporthevaccinii主要危害藍莓[3],我國已經報道D.vaccinii[6]和D.eres[7]兩個種侵染藍莓,造成藍莓枝枯病和芽枯病,對藍莓造成嚴重危害。本研究結果表明D.phaseolorum也可侵染藍莓,造成藍莓莖部潰瘍病,這是在我國新發現的可以引起藍莓病害的間座殼屬真菌。

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(責任編輯：田 喆)

Identification and biological characteristics of a blueberryDiaporthestem canker pathogen

Li Yuan， Shi Lingbo， Fei Nuoya， Fu Junfan， Yan Xuerui

(CollegeofPlantProtection,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866，China)

A kind of blueberry stem canker was found in blueberry plantation and the symptoms consist of red-brown and elliptical stem canker. In order to identify the pathogen, seven isolates were obtained by isolation and purification. Phylogenetic analysis of combined ITS and EF1-α gene sequences showed that the isolates were located in the same clade withDiaporthephaseolorum. Compared with the morphological characteristics, the isolates were identified asD.phaseolorum. The biological characteristics test showed that 25℃, PDA were the best culture conditions, and it was not sensitive to light. This is the first report ofD.phaseolorumcausing diseases on blueberry.

blueberry;Diaporthe; stem canker; identification

2016-08-19

2016-09-19

公益性行業(農業)科研專項(201103037)；沈陽市科技計劃項目(F15-167-4-00，F15-079-3-00)

S436.639

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.014

* 通信作者 E-mail: berrypest@126.com