脂聯(lián)素及其基因單核苷酸多態(tài)性與廣西壯族代謝綜合征的相關(guān)性研究*

鄭利平，楊 蘭，陸俊佳，朱 旭

(廣西壯族自治區(qū)南寧市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科 530031)

脂聯(lián)素及其基因單核苷酸多態(tài)性與廣西壯族代謝綜合征的相關(guān)性研究*

鄭利平，楊 蘭，陸俊佳，朱 旭△

(廣西壯族自治區(qū)南寧市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科 530031)

目的 探討脂聯(lián)素(APN)及其基因位點(diǎn)+45、+276 和-11377的單核苷酸多態(tài)性與廣西壯族代謝綜合征(MS)的相關(guān)性。方法 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測壯族MS組、壯族健康組、漢族MS組和漢族健康組(各100例)血清中APN濃度，聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)檢測APN基因位點(diǎn)+45T/G、+276G/T和-11377C/G的多態(tài)性。結(jié)果 (1)較同民族健康組，兩個(gè)民族的MS組高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和APN均顯著降低，而BMI、空腹血糖(FPG)、收縮壓、舒張壓、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；(2)壯族、漢族MS組APN+45基因位點(diǎn)的TG和GG基因型頻率明顯比同族健康組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.319，P=0.001；χ2=11.631，P=0.003)。壯族、漢族MS組的APN+276位點(diǎn)TG和GG基因型明顯高于同族健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.058，P=0.000；χ2=25.425，P=0.003)。4組的APN-11377位點(diǎn)絕大部分是野生型，雖等位基因分布頻率略有差異，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；(3)兩個(gè)MS組中APN+45位點(diǎn)為TT基因型的患者血清APN水平顯著高于基因型為TG和GG型的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。APN+276位點(diǎn)為GG型的患者血清APN水平明顯高于基因型為GT和TT型的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論APN+45位點(diǎn)G基因型和+276 位點(diǎn)T基因型導(dǎo)致血清中APN水平降低可能與廣西地區(qū)壯族和漢族MS發(fā)生有相關(guān)性。

脂聯(lián)素；基因多態(tài)性；壯族；代謝綜合征

代謝綜合征(metabolic syndrome，MS) 是一組以多種代謝性疾病或危險(xiǎn)因素在個(gè)體聚集的綜合征 。臨床主要表現(xiàn)是高血壓、血脂異常、糖耐量異常、凝血異常。胰島素抵抗是MS的主要病理基礎(chǔ)，貫穿于MS發(fā)生、發(fā)展的始終。脂聯(lián)素(APN)是脂肪細(xì)胞分泌的特異性蛋白，具有調(diào)節(jié)血糖、血脂代謝，增強(qiáng)胰島素敏感性，抗炎癥，抗動(dòng)脈粥樣硬化，抗血小板聚集等生物作用。因此APN水平的改變可能引起MS發(fā)生、發(fā)展。本研究通過檢測廣西最大的少數(shù)民族，即壯族MS患者外周循環(huán)中APN水平及其基因位點(diǎn)+45T/G、+276 G/T和-11377C/G 基因多態(tài)型及等位基因的分布頻率，探討APN水平及基因位點(diǎn)與壯族MS的關(guān)系，從而為廣西地區(qū)壯族MS防治提供全新視角。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇廣西南寧市的壯族MS患者、壯族健康個(gè)體、漢族MS患者和漢族健康個(gè)體各100例。其中，壯族MS組：女48例，男52例，年齡46～75歲，平均53.1歲；壯族健康組：女45例，男55例，年齡50～71歲，平均53.9歲；漢族MS組：女45例，男55例，年齡47～78歲，平均54.3歲；漢族健康組：女47例，男53例，年齡49～72歲，平均54.4歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)3代以上未有與外族通婚的壯族或漢族家庭，第3代或以下個(gè)體納入研究，且盡可能確保研究對象在其可追蹤的歷史上沒有與外族通婚；(2)無遺傳性疾病家族史及其他繼發(fā)血脂、血糖升高的急、慢性疾病史。MS 的診斷參照《中國成人血脂異常防治指南》[1]。4組研究對象在年齡和性別上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。采樣過程遵循知情同意原則，并通過詢問確保樣本間無血緣關(guān)系。

1.2 儀器與試劑 全自動(dòng)生化儀(日本日立公司)；酶標(biāo)儀(深圳雷杜生命科學(xué)有限公司)；核酸擴(kuò)增儀(美國ABI公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)。凝膠成像儀(珠海黑馬生物公司)；APN檢測試劑(美國GBD公司)；全血DNA 抽提試劑(北京天根生化科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 抽取研究對象空腹?fàn)顟B(tài)下靜脈血5 mL，注入干燥管和EDTA抗凝管中。干燥管放置30 min后，低速離心(3 000 r/min)10 min，分離血清用于測定空腹血糖(FPG)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和APN的檢測。EDTA抗凝管充分混勻，提取DNA用于APN基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測。

1.3.2 血清FPG、TG、TC、HDL-C、LDL-C和APN的檢測 采用比濁法或比色法測定血清FPG 、TG、TC、HDL-C、LDL-C水平。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清APN，一切操作嚴(yán)格按照試劑說明書。

1.3.3 DNA制備 全血DNA的制備嚴(yán)格按照DNA提取試劑說明書操作，最后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 APN基因檢測

1.3.4.1 反應(yīng)體系 PCR混合反應(yīng)液8.0 μL(含dNTP、buffer)，Taq酶 0.5 μL，無菌水37.5 μL，DNA模版2.0 μL和上、下游引物各1.0 μL，共50.0 μL反應(yīng)體系。APN 3個(gè)基因位點(diǎn)引物序列見表1。

1.3.4.2 APN基因位點(diǎn)的擴(kuò)增條件 APN+45和APN+276位點(diǎn)：94 ℃ 5 min預(yù)變性；94 ℃ 1 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸7 min。APN-11377位點(diǎn)：94 ℃ 5 min預(yù)變性；94 ℃ 1 min，62 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.3.4.3 APN限制性片段長度多態(tài)性分析 PCR擴(kuò)展產(chǎn)物20 μL、buffer 3 μL，內(nèi)切酶1 μL，無菌水6 μL，37 ℃孵育1 h后取5 μL在2%瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣。電壓100 V，電泳30 min后在凝膠成像儀下觀察電泳結(jié)果并攝像保存。3個(gè)基因位點(diǎn)酶切情況見表2。

表1 APN+45、+276和-11377基因位點(diǎn)引物序列

表2 APN3個(gè)基因位點(diǎn)酶切情況

2 結(jié) 果

2.1 4組臨床一般資料及APN的比較 較同族健康個(gè)體，兩個(gè)民族的MS組外周循環(huán)中HDL-C和APN水平均較健康組顯著降低，而BMI、FPG、收縮壓、舒張壓、TG、TC、LDL-C明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而壯族MS組與漢族MS組間的FPG、BMI、收縮壓、舒張壓、TG、TC、HDL-C、LDL-C和APN略有差異，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 研究對象臨床資料的比較

a：P<0.05，與同民族健康組比較。

2.2 4組的3個(gè)APN基因位點(diǎn)多態(tài)性分析 健康組和MS組的APN+45、+276和-11377基因單核苷酸多態(tài)性經(jīng)H-W平衡檢驗(yàn),均符合H-W群體遺傳平衡法則(P>0.05),具有群體代表性。4組的APN+45和+276基因位點(diǎn)雜合程度較高，均以漢族MS組最高。4組APN-11377位點(diǎn)少見突變，均以野生型為主。 4組APN+45位點(diǎn)等位基因分布頻率,發(fā)現(xiàn)壯族和漢族MS組的TG和GG基因頻率明顯比同族健康組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.319，P=0.001；χ2=11.631，P=0.003)；壯族MS組APN+45基因雜合程度略低于漢族MS組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.372，P=0.830)。APN+276位點(diǎn)等位基因分布頻率同APN+45位點(diǎn),壯族和漢族MS組的GT和TT基因頻率明顯比壯族和漢族健康組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.058，P=0.000；χ2=25.425，P=0.000)；壯族MS組APN+276基因雜合程度略低于漢族MS組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.193，P=0.908)。4組的APN-11377位點(diǎn)絕大部分是野生型，雖基因頻率略有差異，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。電泳結(jié)果見圖1。

表4 4組各基因型別頻率檢測結(jié)果(%)

M:marker;1:APN+276TT型;2:APN+276GG型;3:APN+276TG型;4:APN+45TT型;5:APN+45TG型;6:APN+45GG型;7:APN-11377CG型;8:APN-11377CC型。

圖1APN3個(gè)基因位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物酶切電泳圖

2.3MS組APN3個(gè)位點(diǎn)不同基因型與血清APN水平的影響MS組中APN+45位點(diǎn)攜帶TT型的患者血清APN水平顯著高于基因型為TG和GG型的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MS組APN+45位點(diǎn)TG型別的APN水平較GG型別的MS患者略高，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MS組中APN+276位點(diǎn)攜帶GG型的患者血清APN水平顯著高于基因型為GT和TT型的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MS組APN+276位點(diǎn)GT型別的APN水平較TT型別的MS患者略高，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MS組中APN-11377位點(diǎn)的CC型別和CG型別的APN水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表5。

表5 MS組APN+276G/T和-11377C/G不同基因型的血清APN水平

a:P<0.05，與同位點(diǎn)TT型比較。

3 討 論

APN是脂肪組織分泌的一種特異性蛋白。可調(diào)節(jié)葡萄糖、脂質(zhì)代謝，改善胰島素抵抗，影響血管內(nèi)皮功能和炎癥反應(yīng)[2-3]。APN基因位于人染色體3q27區(qū)域，該區(qū)域具有豐富的多態(tài)性[4]，有研究表明該區(qū)域是2型糖尿病、MS、冠心病的易感基因區(qū)域[5-7]。但APN基因多態(tài)性存在地區(qū)、種族差異,以致很多研究結(jié)果不一致,甚至不同地區(qū)的同一種族人群的研究也會(huì)有相互矛盾的結(jié)果產(chǎn)生[8]。因此研究廣西地區(qū)壯族MS患者血清中APN水平和基因位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性，對明確該地區(qū)MS患者的發(fā)生、發(fā)展因素具有重要作用。

較同族健康個(gè)體，壯族和漢族MS組外周循環(huán)中APN水平顯著降低，這與Kizer等[9]研究結(jié)果相似，提示血清中低APN水平可能與MS的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。壯族MS組APN水平略高于漢族MS組，這可能跟壯族MS組血脂、血糖、血壓等臨床指數(shù)略低于漢族MS組相關(guān)，間接證明了MS的發(fā)展與APN的水平相關(guān)。壯族和漢族MS組APN+45位點(diǎn)的TG、GG基因型分布頻率明顯高于該族健康個(gè)體，且攜帶G基因型的個(gè)體血清中APN水平降低，GG基因型個(gè)體APN水平顯著下降，提示攜帶SNP+45G基因型個(gè)體所致的血清中低水平APN更易發(fā)展為MS，是MS的一個(gè)危險(xiǎn)因素，這與國內(nèi)外有關(guān)研究相似[7,9]。目前APN+276位點(diǎn)G/T變異的研究結(jié)果不一致，有研究表明APN+276基因多態(tài)性與肥胖個(gè)體的低APN水平相關(guān)[10]，也有研究表明該變異位點(diǎn)與MS不相關(guān)[11]。同APN+45位點(diǎn)，壯族和漢族MS組APN+276的GT、TT基因型明顯高于同族健康個(gè)體，T等位基因攜帶的個(gè)體血清中APN水平明顯降低，提示攜帶SNP+276T基因型的個(gè)體所致的血清中低水平APN更易發(fā)展為MS，是MS的另一個(gè)危險(xiǎn)因素，這與相關(guān)研究結(jié)論一致[7,9]。兩個(gè)民族MS組APN+45位點(diǎn)、APN+276位點(diǎn)等位基因分布頻率與血清中APN水平雖略有差異，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示APN+45位點(diǎn)、APN+276位點(diǎn)多態(tài)性在廣西地區(qū)無民族差異性。有研究表明APN+45基因位點(diǎn)和+276基因位點(diǎn)存在一定的連鎖不平衡[12]。但因此次研究主要遴選彼此沒有血緣關(guān)系的研究對象作為研究對象，沒有選擇MS家系做研究，因此不能確定APN+45的G基因型和+276位點(diǎn)的T基因型的連鎖不平衡。APN-11377基因位點(diǎn)在兩個(gè)民族MS組和健康個(gè)體中以野生型為主，基因雜合程度均不高，且與血清中APN水平并不相關(guān)，提示SNP-11377基因多態(tài)性與MS不相關(guān)。這與桂北地區(qū)漢族體檢人群的研究結(jié)論一致[13]。但與Lin等[14]研究表明血漿APN水平降低，是MS發(fā)生的一個(gè)危險(xiǎn)因素的結(jié)論不一致。

總之，APN+45G基因型和APN+276T基因型所導(dǎo)致的血清中低APN水平可能與廣西地區(qū)漢族、壯族MS患者的發(fā)生密切相關(guān)。將APN+45和APN+276基因位點(diǎn)作為MS的篩選基因之一有助于早期發(fā)現(xiàn)廣西地區(qū)MS的易感人群。

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Study on correlation between adiponectin and it single nucleotide polymorphism with Zhuang metabolic syndrome in Guangxi*

ZhengLiping,YangLan,LuJunjia,ZhuXu△

(DepartmentofClinicalLaboratory,NanningMunicipalSecondPeople′sHospital,Nanning,theGuangxiZhuangAutonomousRegion530031,China)

Objective To study the correlation between adiponectin (APN) and gene site APN+45,+276 and -11377 polymorphisms with Zhuang metabolic syndrome (MS) in Guangxi Region.Methods The levels of serum adiponectin in Zhuang MS patients,Han MS patients,Zhuang normal people and Han normal people(each of 100 cases)were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method,and APN+45,APN+276 and APN-11377 polymorphisms were detected by using PCR-RFLP.Results (1) Compared with the same nationality normal control group,the APN and HDL-C levels of the two MS groups were significantly decreased,while BMI,FPG,systolic blood pressure,diastolic blood pressure,TC,TG and LDL-C were significantly increased,the differences were statistically significant (P<0.05);(2)the TG and GG genotype frequency of APN+45 loci in Zhuang and Han MS groups was significantly higher than that in the same nationality normal group,the differences were statistically significant (χ2=25.058,P=0.000;χ2=25.425,P=0.003).APN+276 loci TG and GG genotype frequency in Zhuang and Han MS groups significantly higher than that of same nationality normal group,the differences were statistically significant (χ2=14.319,P=0.001;χ2=11.631,P=0.003).The heterozygosis degree of APN+276 locus in the Zhuang and Han MS groups was significantly higher than that in the same nationality individuals,the difference was statistically significant(allP<0.05).Most of APN-11377 locus in the 4 groups was the wild type,although there was a slight difference in the distribution of allele frequencies,but the difference was not statistically significant (P>0.05).(3)The serum APN level in the patients with APN+45 TT genotype of the two MS groups was significantly higher than that in the patients with TG and GG genotype,and the differences were statistically significant (P<0.05).The serum APN level in the patients with APN+276 GG genotype was significantly higher than that in the patients with GT and TT genotype,and the differences were statistically significant (P<0.05).Conclusion The APN+45 G genotype and APN+276 T genotype resulted in the decrease of serum APN level,which may be associated with the occurrence of MS in Zhuang and Han nationality.

adiponectin;polymorphism;Zhuang nationality;metabolic syndrome

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.018

廣西壯族自治區(qū)南寧市科技課題資助(20123135)。

鄭利平(1966-)，主任檢驗(yàn)師，本科，主要從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)方面研究。△

E-mail:Lipingzheng88@163.com。

R

A

1671-8348(2017)02-0203-04

2016-07-22

2016-11-07)