阿司匹林對不穩定型心絞痛患者血漿中5種miRNA水平的影響*

李 云，呂云波，宋銀宏

(1.三峽大學醫學院，湖北宜昌 443002；2.三峽大學人民醫院心內科，湖北宜昌 443002)

阿司匹林對不穩定型心絞痛患者血漿中5種miRNA水平的影響*

李 云1,2，呂云波2，宋銀宏1△

(1.三峽大學醫學院，湖北宜昌 443002；2.三峽大學人民醫院心內科，湖北宜昌 443002)

目的 探討口服阿司匹林對不穩定心絞痛(UAP)患者血漿miR-21、miR-24、miR-126、miR-146、miR-223水平的影響。方法 以未服用過阿司匹林的15例冠狀動脈病變陽性的UAP患者及10例冠狀動脈病變陰性的UAP患者作為研究對象，予以阿司匹林腸溶片0.1 g，每日1次口服，實時定量反轉錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測miRNA濃度，比較服藥前及服藥1周后外周血漿中這5種miRNA的差異。同時選取50例UAP患者(包括冠狀動脈病變陰性及陽性者)，根據其近期是否服用阿司匹林情況分為阿司匹林組及對照組，比較不同組間血漿中5種miRNA水平。結果 僅冠狀動脈病變陽性的UAP患者服用阿司匹林后血漿中的miR-223水平升高有統計學意義(P<0.05)，而其他幾種miRNA及冠狀動脈病變陰性者血漿中5種miRNA水平變化均無統計學意義(P>0.05)。結論 阿司匹林可升高冠狀動脈病變陽性的UAP患者血漿中miR-223的水平但不影響冠狀動脈病變陰性者血漿miR-223水平。

阿司匹林；冠狀動脈疾病；心絞痛，不穩定型；微RNAs

微RNA(miRNA)是一類高度保守的內源性非編碼小分子單鏈RNA，能通過非特異性識別靶基因mRNA調節生物體的基本生物過程。實驗發現miRNA能穩定存在于血漿及體液中。并且，在特定的病理條件下血漿中某些miRNA水平發生相應改變，這提示特定miRNA有望成為新的生物標志物[1-2]。目前有許多miRNA作為生物標志物的研究，然而這些研究很少考慮藥物對miRNA的影響。miR-21、miR-24、miR-126、miR-146及miR-223是目前研究較多的幾種與血管病變關系密切的miRNA。阿司匹林是一種抗血小板藥物，廣泛應用于冠心病的預防及治療。本研究通過檢測冠狀動脈(簡稱冠脈)病變陽性及冠脈病變陰性的不穩定型心絞痛(UAP)患者服用阿司匹林前后及近1年內從未服用過阿司匹林和近3個月內堅持服用阿司匹林的UAP患者血漿中miR-21、miR-24、miR-126、miR-146及miR-223的濃度，探討阿司匹林對血漿中這5種miRNA的影響，評估這5種miRNA作為冠心病生物標志物的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年10月至2015年3月在宜昌市人民醫院住院治療的從未服用過阿司匹林的15例冠脈病變陽性UAP患者及10例冠脈病變陰性UAP患者作為研究對象[入選患者均行冠脈病造影檢驗，并進行冠脈狹窄程度積分(Gensini)評分。單支主干血管或主要分支病變狹窄大于或等于50%為冠脈病變陽性，否則為冠脈病變陰性。]，每日口服1次阿司匹林腸溶片(拜耳公司)0.1 g，服藥前后其他治療不變，收集患者服用阿司匹林前及服藥1周后外周血。

選取2013年10月至2014年12月該院新入院的276例UAP患者，根據其近期服用阿司匹林情況分為阿司匹林組及對照組。取得患者同意后入院時抽取患者靜脈血。同時收集患者的一般臨床資料及其用藥情況，對患者各項生化指標、免疫學指標及血細胞參數進行檢驗。根據服用阿司匹林情況及冠脈病造影結果將入選者共分為4組：冠脈病變陰性未服用阿司匹林組(A組)、冠脈病變陰性服用阿司匹林組(C組)、冠脈病變陽性未服用阿司匹林組(B組)、冠脈病變陽性服用阿司匹林組(D組)。最后入選并納入統計者50例。冠脈病變陽性的UAP患者與冠脈病變陰性的UAP患者及UAP患者阿司匹林組與相應對照組(即A組與C組，B組與D組)一般資料差異無統計學意義(P>0.05)。

納入標準：(1)至少近1年內未服用過阿司匹林或至少近3個月內堅持服用阿司匹林。(2)除高血壓、冠心病外無其他全身性器質性疾病。(3)入院前除降壓藥及阿司匹林外未服用其他可能影響血小板藥物。(4)近1周內行冠脈病造影檢查。排除標準：急性心肌損傷，急性感染，肝、腎功能不全，腫瘤，風濕免疫性疾病，傳染病，糖尿病和間斷或近期服用阿司匹林不足3個月者，或近期服用其他可能影響血小板藥物者，以及住院期間未行冠脈病造影檢查者。本研究獲得宜昌市倫理委員會的批準。所有入選患者均簽署知情同意書。入院的UAP患者參照2011年《ACC/AHA不穩定型心絞痛/非ST段抬高心肌梗死指南》的UAP診斷標準。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 采集入選患者外周靜脈血2 mL加入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，4 ℃，100 r/min，15 min初步離心，離心后得到的上層液體于4 ℃，2 000 r/min，15 min再次離心，取得血漿4 ℃保存。

1.2.2 血漿miRNA的檢測 分離血漿后用miRcute miRNA提取分離試劑盒(北京TIANGEN公司)分離提取血漿RNA并加尾、逆轉錄為cDNA，嚴格按照說明書進行操作。RNA加Poly(A)尾反應體系為：總 RNA 10.0 μL，E.coli Poly(A) 多聚酶(5 U/μL)0.4 μL,10×Poly(A)多聚酶緩沖液2.0 μL,5×rATP 溶液4.0 μL,無RNase ddH2O 3.6 μL，反應條件為37 ℃，60 min；逆轉錄合成cDNA的反應體系為：Poly(A)反應液2.0 μL,10×RT引物2.0 μL,10×RT緩沖液2.0 μL,dNTPs 1.0 μL,RNasin(40 U/μL)1.0 μL,Quant Rtase 0.5 μL,無RNase ddH20 11.5 μL，反應條件為37 ℃，60 min。熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測以miR-16作為內參，采用miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒(北京TIANGEN公司)，miR-16的上游引物為5′-GAT AGC AGC AGG TAA ACA TTG GCG-3′；miR-21的上游引物為5′-CGC CTA CCT TAT GAG ACT GAT GTT GAA-3′；miR-24的上游引物為5′-TGG CTC AGG TCA GCA GGA ACA G-3′；miR-126的上游引物為5′-CCT CGT TCC GTG AGT AAT AAT GCG-3′；miR-146的上游引物為5′-CGA TGA GAA CTG AAA TCC TTG GGT TA-3′;miR-223的上游引物為5′-TCC TGT CAG TCT GTC AAA TAC CCC A-3′；下游引物由試劑公司試劑盒提供。反應條件：94 ℃，2 min預變性，然后94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，共45個循環，采集數據分析結果。依據上述RT-qPCR條件，對前期制備的各個樣品的逆轉錄產物進行檢測。以miR-16為內參[3-5]，計算3個復孔的平均值作為每個樣品的實際Ct值，將同一樣品的Ct值減去其內參Ct值，得到ΔCt值；即ΔCt=Ct目的-Ct內參基因；進行統計學分析，同時運用miRNA表達倍數的改變值(FC，即FC=2-ΔΔCt)對定量的結果進行分析和比較[6-7]。ΔΔCt=ΔCt處理樣品-ΔCt對照樣品。

2 結 果

2.1 研究對象各項化驗指標的比較 冠狀動脈病變陽性UAP患者與冠脈病變陰性UAP患者血細胞計數、血生化等差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1；A組與C組，B組與D組血細胞計數、血生化、Gensini評分等差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表1 研究對象檢驗指標及冠脈病情況的比較

PLT：血小板數量；MPV：平均血小板體積；PCT：血小板壓積；PDW：血小板體積分布寬度；HGB:血紅蛋白；WBC：白細胞；CHO：總膽固醇；TG：三酰甘油；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；ALT：丙氨酸氨基轉移酶；AST：天冬氨酸氨基轉移酶；BUN：尿素氮；CRE：肌酐；UA：尿酸；PT：凝血酶原時間；APTT：活化部分凝血酶原時間；Fib：纖維蛋白原；TT：凝血酶時間；INR;國際標準化比值；CRP：C-反應蛋白。

2.2 研究對象服藥前后血漿miRNA的比較 樣品的擴增曲線及溶解曲線提示樣品提純純度較高，見圖1、2。冠脈病變陰性UAP患者服阿司匹林前與服用阿司匹林1周后對比血漿miR-21、miR-24、miR-126、miR-146及miR-223的表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。冠脈病變陽性UAP患者服阿司匹林前與服用阿司匹林1周后對比，血漿miR-223水平升高并差異有統計學意義(P<0.05)，而血漿miR-21、miR-24、miR-126及miR-146差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表2 UAP患者檢驗指標及冠脈病情況的比較

PLT：血小板數量；MPV：平均血小板體積；PCT：血小板壓積；PDW：血小板體積分布寬度；HGB:血紅蛋白；WBC：白細胞；CHO：總膽固醇；TG：三酰甘油；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；ALT：谷丙轉氨酶；AST：谷草轉氨酶；BUN：尿素氮；CRE：肌酐；UA：尿酸；PT：凝血酶原時間；APTT：部分凝血酶原時間；Fib：纖維蛋白原；TT：凝血酶時間；INR;國際標準化比值；CRP：C-反應蛋白。

圖1 6對引物對樣品的擴增曲線

2.3 各組血漿miRNA水平的比較C組與A組比較，血漿miR-21、miR-24、miR-126、miR-146及miR-223水平均差異無統計學意義(P>0.05)。D組與B組比較，血漿miR-223水平升高并有統計學意義(P<0.05)，而血漿miR-21、miR-24、miR-126及miR-146表達差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

圖2 6對引物的熔解曲線

項目冠脈病變陰性UAP患者用藥前2-ΔCt用藥后2-ΔCtP冠脈病變陽性UAP患者用藥前2-ΔCt用藥后2-ΔCtPmiR-210.275±0.0730.242±0.0850.1160.037±0.0070.039±0.0090.552miR-240.071±0.0200.067±0.0180.5050.023±0.0100.021±0.0150.864

續表3 服藥前后患者血漿miRNA的比較

表4 UAP患者血漿miRNA水平的比較

3 討 論

miR-21、miR-24、miR-126、miR-146及miR-223富含于不同的細胞中，同時它們也是血小板中水平較高的幾種miRNA。它們與血管病變關系密切，缺氧時細胞內外的miRNA水平發生改變。既往多個試驗發現冠心病及急性腦梗死時細胞內及血漿中的miR-126和miR-223水平下降，而動脈粥樣斑塊中的水平上升，推測其有穩定斑塊的作用[6-7]。進而提出miR-126和miR-223可作為心腦血管病變的血漿標志物[8]。Long等[9]發現急性心肌梗死患者血漿中miR-126 和肌鈣蛋白有相同的變化趨勢，從而提出miR-126 和肌鈣蛋白一樣，可作為預測急性心肌梗死的生物學標記物。然而Sun等[10]研究了冠心病患者血漿miR-126與低密度脂蛋白(LDL)的關系，發現miR-126并不能區分冠心病與非冠心病患者，但它能通過調節脂質代謝從而影響冠心病的進程。盡管各個實驗的結論不完全一致，但他們均未考慮到抗血小板藥物對其細胞及血漿水平的影響。

最近的實驗發現血小板也是血漿中miRNA的重要來源。血漿中的miRNA有41%～45%來源于血小板[11]。已知miR-223富含于造血干細胞和血小板中。它是血小板中水平最高的miRNA。Roberto等[12]發現miR-223的序列具有高度的保守性，提示其功能保守并在生物進化過程中具有重要的作用。已知miR-223可以調節細胞及血小板表面的黏附分子的表達，從而調節細胞及血小板的活性。血小板的P2Y12mRNA是miR-223的作用靶點[13]。前期試驗發現動脈粥樣硬化時血小板活性增高，血漿及細胞內miR-223的水平減少，血小板表面的黏附因子表達上調。阿司匹林作為一種抗血小板藥物廣泛應用于心腦血管疾病的預防及治療。阿司匹林作用于環氧合酶(即前列腺素合成酶)減少血栓素A2(TXA2)的生成，從而抑制血小板的激活。本試驗顯示冠脈病粥樣硬化血栓形成時服用阿司匹林可提高血漿miR-223的水平，這可能與阿司匹林抑制血小板的激活有關。而在冠狀動脈病正常時，由于血小板處于相對平穩狀態，故這一影響不明顯。這提示miRNA在細胞活化時調節靶蛋白mRNA作用明顯，而在細胞靜止期這一作用較弱或無作用。同時本試驗顯示阿司匹林對血漿中其他幾種miRNA的影響不大，考慮與其在血小板內水平偏低有關。鑒于阿司匹林在臨床上的廣泛應用，其對血漿miRNA水平的影響在確定血漿標志物時不得不慎重考慮。

[1]MitchellPS,ParkinRK,KrohEM,etal.CirculatingmicroRNAsasstableblood-basedmarkersforcancerdetection[J].ProcNatlAcadSciUSA,2008,105(30):10513-10518.

[2]ChenX,BaY,MaL,etal.CharacterizationofmicroRNAsinserum:anovelclassofbiomarkersfordiagnosisofcancerandotherdiseases[J].CellRes,2008,18(10):997-1006.

[3]ReidG,KirschnerMB,VanZandwijkN.CirculatingmicroRNAs:associationwithdiseaseandpotentialuseasbiomarkers[J].CritRevOncolHematol,2011,80(2):193-208.

[4]劉益民，杜魯濤，王麗麗，等．膀胱癌患者血清microRNA檢測中內參基因的篩選及驗證[J]．山東大學學報(醫學版)，2014，52(5)：86-91．

[5]SongJ,BaiZ,HanW,etal.IdentificationofsuitablereferencegenesforqPCRanalysisofserummicroRNAingastriccancerpatients[J].DigDisSci,2012,57(4):897-904.

[6]KinK,MiyagawaS,FukushimaS,etal.Tissue-andplasma-specificmicroRNAsignaturesforatheroscleroticabdominalaorticaneurysm[J].JAmHeartAssoc,2012,1(5):e000745.

[7]WangX,SundquistJ,Z?llerB,etal.Determinationof14circulatingmicroRNAsinSwedesandIraqiswithandwithoutdiabetesmellitustype2[J].PLoSOne,2014,9(1):e86792.

[8]FichtlschererS,DeRosaS,FoxH,etal.

Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease[J].Circ Res,2010,107(5):677-684.

[9]Long G,Wang F,Duan Q,et al.Human circulating microRNA-1 and microRNA-126 as potential novel indicators for acute myocardial infarction[J].Int J Biol Sci,2012,8(6):811-818.

[10]Sun X,Zhang M,Sanagawa A,et al.Circulating microRNA-126 in patients with coronary artery disease:correlation with LDL,cholesterol[J].Thromb J,2012,10(1):16.

[11]Diehl P,Fricke A,Sander L,et al.Microparticles:major transport vehicles for distinct microRNAs in circulation[J].Cardiovasc Res,2012,93(4):633-644.

[12]Roberto VP,Tiago DM,Gautvik K,et al.Evidence for the conservation of miR-223 in zebrafish (Danio rerio):implications for function[J].Gene,2015,566(1):54-62.

[13]Edelstein LC,Bray PF.microRNAs in platelet production and activation[J].Blood,2011,117(20):5289-5296.

The effect of aspirin on the expression of five miRNA in plasma of patients with unstable angina pectoris*

LiYun1,2,LvYunbo2,SongYinhong1△

(1.TheCollegeofMedicalScience,ChinaThreeGorgesUniversity,Yichang,Hubei443002,China;2.DepartmentofCardiology,People′sHospitalofThreeGorgesUniversity,Yichang,Hubei443002,China)

Objective To detect the effect of aspirin on the expression of miR-21,miR-24,miR-126,miR-146 and miR-223 in plasma of patients with unstable angina pectoris (UAP).Methods Fifteen UAP patients with coronary artery disease and ten UAP patients without coronary artery disease were selected as subjects.All subjects had no medication of aspirin before.Aspirin enteric-coated tablets was taken to all subjects at 0.1 g once a day orally for one week.The peripheral blood (PB) samples of the patients were collected before and after taking the drug for one week.The expressions of the 5 miRNAs in plasma were detected by quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR).Meanwhile,fifty UAP patients with or without coronary artery disease were divided into the aspirin group and the control group according to the medication of aspirin.The expressions of the 5 miRNAs in plasma between different groups were compared.Results The expression of miR-223 in plasma of UAP patients with coronary artery disease was increased significantly after the medication of aspirin (P<0.05).However,the expression of the other 4 miRNAs in plasma of these UAP patients with coronary artery disease and the 5 miRNAs in plasma of the UAP patients without coronary artery disease did not change significantly before and after the medication of aspirin (P>0.05).Conclusion The medication of aspirin is able to increase the expression of miR-223 in serum of UAP patients with coronary artery disease but not of UAP patients without coronary artery disease.

aspirin;coronary artery disease;unstable angina pectoris;microRNAs

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.010

湖北省教育廳自然科學研究項目(Q20121306)。

李云(1977-)，主治醫師，碩士，主要從事miRNA與心血管病方面研究。△

R541.4

A

1671-8348(2017)02-0178-04

2016-07-20

2016-09-08)