長鏈非編碼RNA-UBC1 對膀胱癌細胞生物學功能的影響

朱晨曦，李文洲，郭永連，余家俊，舒 博，陳 琳，李國灝，衛(wèi) 丹

(湖北省武漢市中心醫(yī)院泌尿外科 430014)

長鏈非編碼RNA-UBC1 對膀胱癌細胞生物學功能的影響

朱晨曦，李文洲，郭永連，余家俊，舒 博，陳 琳，李國灝，衛(wèi) 丹

(湖北省武漢市中心醫(yī)院泌尿外科 430014)

目的 探討長鏈非編碼RNA(lncRNA)-尿路上皮癌相關基因1(UBC1)對膀胱癌細胞增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移的作用及其可能的機制。方法 采用siRNA干擾技術(shù)沉默膀胱癌細胞系T24細胞的lncRNA-UBC1，設置陰性對照組，CCK-8檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞凋亡，Transwell檢測細胞侵襲能力，Westernblot印跡法檢測與轉(zhuǎn)移相關的基質(zhì)金屬蛋白2(MMP-2)與zeste基因增強子同源2(EZH2)。結(jié)果lncRNA-UBC1在T24細胞株中表達明顯高于人胚胎膀胱組織來源細胞；與陰性對照組和空白對照組相比，沉默UBC1后，UBC1沉默組膀胱癌細胞增殖速率慢于對照組，UBC1沉默組膀胱癌細胞凋亡細胞比例高于陰性對照組[(18.72±7.79)% vs. (13.09±5.66)%，P<0.05]，UBC1沉默組細胞侵襲能力受到抑制，T24細胞MMP-2與EZH2表達降低。結(jié)論 沉默lncRNA-UBC1可抑制T24細胞增殖、凋亡及侵襲能力，其機制可能是通過MMP-2與EZH2途徑。

RNA;膀胱腫瘤；長鏈非編碼RNA-UBC1；腫瘤浸潤；細胞增殖；基質(zhì)金屬蛋白酶2；zeste基因增強子同源物2

膀胱癌是最為常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其特點是復發(fā)率高和惡性程度高，尤其是浸潤性膀胱癌，惡性程度極高，預后不佳，5年生存率不超過50%[1]。近年來，眾多研究正深入探索膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，尋找可信度高的生物標志物和有效的治療靶點成為膀胱癌診治的突破點之一。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)已成為當前全球基因領域研究的熱點內(nèi)容之一[2]，lncRNA可通過表觀遺傳學相關的修飾在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，部分lncRNA具有重要的潛在臨床應用價值，有望成為人類癌癥新的診斷標志物及分子治療靶點[3]。 有研究從臨床組織學水平檢測并篩查發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA(lncRNA)-尿路上皮癌相關基因1(UBC1)表達與膀胱癌患者淋巴轉(zhuǎn)移及預后密切相關，而且，術(shù)前檢測UBC1表達水平可為膀胱癌淋巴結(jié)清掃范圍提供有力參考依據(jù)[4-5]。UBC1可能通過調(diào)控下游基因表達來發(fā)揮作用，但其具體機制尚在研究當中。本研究擬從細胞水平探討UBC1與膀胱癌細胞增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移的關系及其可能的機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 膀胱癌細胞系T24細胞株和人胚胎膀胱組織來源細胞(CCC-HB-2)購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)；DMEM和RPMI-1640均購自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；UBC1 siRNA和negative siRNA由廣州市銳博生物科技有限公司合成；磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.25%胰蛋白酶和RIPA組織細胞快速裂解液等購自武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；SYBR Green染料購自天根生化科技有限公司；CCK-8試劑盒購自株式會社日本同仁； AnnexinV-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒、Matrigel基質(zhì)膠均購自BD公司；各種孔板、Transell小室及其他細胞培養(yǎng)所需耗材為Corning公司產(chǎn)品。LipofectamineTM2000、TRIzol試劑和DNase Ⅰ酶等購自Invertogen公司；引物合成委托廣州市銳博生物科技有限公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo)、酶標儀(芬蘭雷勃)、移液槍(吉爾森)、流式細胞儀(BD公司)均由本院科研中心提供使用。蛋白質(zhì)標記物(Promega)、脫脂奶粉(BD公司)、十二烷基硫酸鈉(SDS)(Sigma)和硝酸纖維素膜(millipore)均購自武漢谷歌生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人胚胎膀胱組織來源細胞CCC-HB-2用DMEM+10%胎牛血清+雙抗培養(yǎng)。T24人膀胱癌細胞用DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)，常規(guī)細胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)細胞，操作過程嚴格遵循無菌操作原則，細胞培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。取對數(shù)生長期生長狀態(tài)最佳的細胞，接種于6孔板中，每孔2 mL細胞懸液，待細胞長滿70%～80%時，參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑操作說明書進行siRNA瞬時轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染終濃度為100 nmol/L，在轉(zhuǎn)染進行48 h后收集細胞進行下一步實驗。實驗分為空白對照組，陰性對照組(轉(zhuǎn)染negative siRNA)和UBC1沉默組(轉(zhuǎn)染UBC1-siRNA)。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCT)檢測RNA表達水平 轉(zhuǎn)染48 h后，采用Trizol法提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，然后按選定引物采用TaqPCR MasterMix(Toyobo)進行下一步熒光定量PCR操作。隨后進行目的基因片段的擴增，以U6基因為內(nèi)參。lncRNA UBC1基因引物序列：上游引物 5′-CCU GUC UAC AGA CUG AAU ATT-3′,下游引物 5′-CCG GAA CAA AUG GCU UCA UTT-3′)，陰性對照siRNA序列 5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′,各組設置3個復孔進行重復試驗。采用RT-PCR法檢測CCC-HB-2-人胚胎膀胱組織來源細胞株(CH2組)和T24膀胱癌細胞株(T24組)中的UBC1表達水平，方法同前。

1.2.3 CCK-8檢測細胞增殖試驗 取處于對數(shù)生長期的對照組和實驗組的細胞，用胰蛋白酶消化后重懸，調(diào)整細胞濃度為(1～5)×104/mL，取96孔培養(yǎng)板，每組設置6個復孔，每孔加入100 μL細胞懸浮液，種植細胞濃度為(1～5)×103/孔，并設置空白對照。37 ℃培養(yǎng)過夜，按照每孔100 μL CCK-8，37 ℃，5% CO2孵育1～4 h； 用分光光度計測定450 nm波長光密度值(OD值)。記錄每塊板的數(shù)值，以培養(yǎng)處理的時間為橫軸，以平均OD值為縱軸，制作處理后T24人膀胱癌細胞生長曲線。

1.2.4 流式細胞儀檢測凋亡實驗 轉(zhuǎn)染48 h后，移去各組細胞上液，采用PBS洗滌1次，用胰酶消化液消化后重懸細胞，調(diào)整細胞濃度1×105/mL。用預冷的PBS洗滌2次，每次加入1 mL預冷的PBS，輕輕震蕩操作，使細胞充分懸浮，1 000 g、4 ℃條件離心5 min，棄上清液。將細胞重懸于200 μL，注意調(diào)整細胞濃度；加入10 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，輕輕混勻，注意不要用力震蕩，在4 ℃避光孵育30 min后加入300 μL結(jié)合緩沖液(Binging Buffer)，隨即進行流式細胞儀上機檢測。

1.2.5 Transwell侵襲實驗 用無血清DMEM培養(yǎng)基進行細胞血清饑餓處理24 h，將24孔板和Transwell小室用1×PBS浸泡5 min；用不含血清的DMEM培養(yǎng)液洗滌細胞，然后用含有1%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸處理后的細胞，調(diào)整細胞濃度至1×105/mL，注意細胞濃度不可太高，接種到Transwell小室上層內(nèi)，每個小室上層加0.50 mL細胞懸液，下層加入500 μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，每組3復孔。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后每孔加入1 mL 4%甲醛溶液，室溫下固定10 min后吸去固定液，用1×PBS洗滌1次，用0.5%結(jié)晶紫溶液進行染色，處理至少30 min后用1×PBS洗3次，晾干后觀察。觀察前用棉簽小心擦去Transwell小室內(nèi)沒有遷移的細胞，注意不要擦掉小室牽引過去的細胞，不要殘留棉花碎屑，然后將小室置于200倍的顯微鏡下觀察，計數(shù)每個視野中的細胞數(shù)。

1.2.6 Western blot 細胞傳代培養(yǎng)至70%～80%融合時進行轉(zhuǎn)染，48 h后，胰酶消化并重懸細胞，采用RIPA試劑裂解法提取總蛋白，并用二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒檢測蛋白濃度，達標蛋白濃度方可進行下一步實驗。水浴法變性蛋白后，加入5×SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)蛋白上樣緩沖液，取含相同量蛋白的蛋白裂解液，采用10%的SDS-PAGE 膠進行電泳分離，注意調(diào)整電泳電壓和時間，用電轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，用脫脂牛奶室溫封閉1 h，免疫印跡的一抗用按1∶1 000稀釋的抗人基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、zeste基因增強子同源物2(EZH2)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體過夜孵育，在室溫下用PBS-Tween洗膜3次，每次10 min；印跡膜用按1∶3 000的抗鼠或抗兔IgG耦聯(lián)的辣根過氧化物酶作為二抗，室溫孵育 1 h，用PBS-Tween 洗膜3次，室溫下每次10 min。用增強型化學發(fā)光液檢測試劑盒化學發(fā)光顯色。

2 結(jié) 果

2.1RT-PCR檢測細胞系UBC1基因表達T24組細胞UBC1表達水平高于CH2組近3倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；T24膀胱癌細胞UBC1沉默組與陰性對照組及空白對照組相比，UBC1相對表達明顯較低(P<0.05)，見圖1。

A：T24膀胱癌細胞UBC1基因表達水平；B：T24細胞UBC1表達水平。

圖1RT-PCR檢測細胞系UBC1基因表達水平

2.2 沉默UBC1對膀胱癌細胞增殖影響結(jié)果 與陰性對照組及空白對照組相比，24、48和72h時UBC1沉默組細胞OD值均降低，T24膀胱癌細胞增殖受到抑制，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 CCK-8檢測T24膀胱癌細胞增殖情況

2.3 沉默UBC1對膀胱癌細胞凋亡影響 人T24膀胱癌細胞轉(zhuǎn)染UBC1-siRNA24h后，流式細胞術(shù)檢測膀胱癌細胞凋亡情況，結(jié)果顯示，UBC1沉默組膀胱癌細胞凋亡細胞比例高于陰性對照組[(18.72±7.79)%vs.(13.09±5.66)%，P<0.05]，見圖3。

圖3 流式細胞儀術(shù)檢測T24膀胱癌細胞增殖情況

2.4 沉默UBC1對膀胱癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移影響Transwell小室實驗檢測膀胱癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移情況，結(jié)果顯示，穿膜細胞數(shù)目分別為：空白對照組(333.0±22.3)、陰性對照組(310.0±30.5)和UBC1沉默組(172.0±20.9)，與陰性對照組比較，UBC1沉默組細胞侵襲能力受到抑制(P<0.05)，見圖4。

圖4 Transwell檢測T24膀胱癌細胞侵襲情況(×100)

2.5Westernblot檢測MMP-2和EZH2蛋白的表達水平 轉(zhuǎn)染24h后，Westernblot結(jié)果顯示，與陰性對照組和空白對照組相比，UBC1沉默組細胞MMP-2和EZH2蛋白水平降低，見圖5。

圖5 Western blot檢測T24腫瘤細胞MMP-2和EZH2蛋白的表達水平

3 討 論

lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200nt單位的RNA,普遍存在于細胞中，它們起初被認為是基因組轉(zhuǎn)錄的“轉(zhuǎn)錄垃圾”，不具有生物學功能[6-7]。然而，近年來研究表明，lncRNA參與了基因組印記、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄干擾及轉(zhuǎn)錄激活等多種重要的調(diào)控過程[7]。lncRNA在膀胱癌中的研究既可以豐富非編碼RNA的研究內(nèi)容，到目前為止，已發(fā)現(xiàn)的與膀胱癌疾病密切相關的lncRNA有H19[8]、UCA1[9]、ncRAN[10]、MALAT-1[11]和MEG3[12]等。它們與膀胱癌疾病的發(fā)病機制、復發(fā)轉(zhuǎn)移、診斷治療及預后都有著一定的相關性[13]。

UBC1是新近發(fā)現(xiàn)的與膀胱癌疾病相關的又一lncRNA，He等[5]采用qRT-PCR檢測102名膀胱癌患者的癌組織和癌旁組織UBC1的表達，發(fā)現(xiàn)UBC1在膀胱癌組織中呈現(xiàn)高表達，而且這種高表達與預后密切相關，其表達越高，患者預后越差，是可能的致癌基因或基因干預治療的靶點。本實驗在此基礎上進行細胞實驗，結(jié)果表明，在膀胱癌細胞系中UBC1表達明顯高于人胚胎膀胱組織源性細胞中，這與He等[5]研究一致。當下調(diào)UBC1后，膀胱癌細胞的增殖、凋亡和侵襲能力均受到抑制。而在關于UBC1與胃腸道癌癥關系的一項研究中，Hu等[4]也證實，在胃腸道癌組織中UBC1呈現(xiàn)高表達，下調(diào)UBC1后，胃腸道癌癥細胞株BGC-823,SGC-7901的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移均受到抑制。因此，結(jié)合以往研究不難得出，UBC1可能在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展中有致癌作用，若干擾UBC1的表達，可能對膀胱癌具有一定的治療意義。

本實驗研究結(jié)果還表明，下調(diào)UBC1后，膀胱癌細胞MMP-2和EZH2基因相關蛋白表達也隨之下降。lncRNA并不直接參與調(diào)控蛋白的翻譯合成，但其在mRNA前體的剪輯的調(diào)節(jié)和活性絲氨酸/精氨酸剪接因子水平的調(diào)控起著至關重要的作用，從而進一步影響蛋白的表達。雖然本項目研究的是UBC1，但是有關lncRNA調(diào)控MMPs基因的研究并不陌生，Dong等[11]下調(diào)肝癌細胞中的lncRNA-MALAT1后發(fā)現(xiàn)，MMP-9基因相關蛋白被明顯下調(diào)[10]。Ji等[13]研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1調(diào)控c-Myc和MMP-7基因的表達抑制結(jié)腸癌細胞的轉(zhuǎn)移。已知MMPs蛋白家族參與多種癌癥細胞的轉(zhuǎn)移過程[14-15]。因此，UBC1可能通過MMP-2途徑調(diào)控膀胱癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)UBC1干擾組的膀胱癌細胞EZH2蛋白水平的降低。以往研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-MALAT1可以通過調(diào)控EZH2而調(diào)控前列腺癌細胞的生物學功能[16]，EZH2在膀胱癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用，EZH2在膀胱癌中呈現(xiàn)高表達，其表達水平的高低與預后成反比，但可能作為治療的干預靶點[17-18]。因此，參與UBC1調(diào)控膀胱癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移等生物學功能的蛋白途徑除了MMP-2之外，還可能有EZH2途徑。

總之，lncRNA-UBC1是膀胱癌發(fā)生、發(fā)展，增殖浸潤和轉(zhuǎn)移復發(fā)的重要調(diào)控分子，lncRNA與表觀遺傳學的調(diào)控是相互關聯(lián)、相互影響的，并非獨立存在于人體，隨著研究的深入，lncRNA-UBC1在膀胱癌中的作用機制將越來越明確，甚至可能作為膀胱癌診斷的特異性標志物和藥物作用基因靶點，為膀胱癌診斷和治療提供新策略。

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Effect of long-chain non-coding RNA UBC1 on biological function of bladder cancer cells

ZhuChenxi,LiWenzhou,GuoYonglian,YuJiajun,ShuBo,ChenLin,LiGuohao,WeiDan

(DepartmentofUrology,WuhanMunicipalCentralHospital,Wuhan,Hubei430014,China)

Objective To investigate the effect of long-chain non-coding RNA-UBC1(lncRNA-UBCI) on proliferation,apoptosis,invasion and metastasis of bladder cancer cells and its possible mechanism.Methods The siRNA was used to silence lncRNA-UBC1 in bladder cancer cell line T24 cells.The negative control group was set.CCK-8 was used to detect cell proliferation,flow cytometry was used to detect cell apoptosis,Transwell assay was used to detect the invasion ability and the expression of EZH2 and MMP-2 was detected by Western blot.Results The lncRNA-UBC1 expression in T24 cell lines was significantly higher than that in human embryonic bladder tissue derived cells.Compared with the negative control group and blank control group,T24 bladder cancer cell proliferation rate in the UBC1 silence group was slower than that of the control groups.T24 bladder cancer cell apoptosis cell percentage in the UBC1 silence group was higher than that in the negative control group[(18.72±7.79)%vs. (13.09±5.66)%,P<0.05].The T24 bladder cancer cell invasion ability in the UBC1 silence group was inhibited.Expression of MMP-2 and EZH2 of T24 cell in UBC1 silence group was decreased.Conclusion Silencing lncRNA-UBC1 can inhibit the proliferation,apoptosis and invasion ability of T24 cells and its mechanism may be through MMP-2 and EZH2 pathway.

RNA；urinary bladder neoplasms；long-chain non-coding RNA UBC1；neoplasm invasiveness；cell proliferation；matrix metalloproteinase 2；enhancer of zeste homolog 2

朱晨曦(1979-)，主治醫(yī)師，博士，主要從事泌尿系腫瘤及結(jié)石方面研究。

??·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.007

R

A

1671-8348(2017)02-0169-03

2016-07-03

2016-08-26)