人脂肪干細胞與不同濃度纖維蛋白膠的相容性研究*

陽水發，易陽艷，黃 艷，吳 舒，王朝慧

(南昌大學第二附屬醫院醫療美容科，南昌 330000)

人脂肪干細胞與不同濃度纖維蛋白膠的相容性研究*

陽水發，易陽艷△，黃 艷，吳 舒，王朝慧

(南昌大學第二附屬醫院醫療美容科，南昌 330000)

目的 研究人脂肪干細胞(ASCs)與不同濃度纖維蛋白膠支架的體外生物相容性。方法 獲取人原代ASCs，鑒定后通過CCK-8試驗檢測纖維蛋白膠對ASCs的毒性。通過光鏡直接觀察和活細胞/死細胞(DEAD/LIVE)雙標染色熒光觀察ASCs分別與100.0、50.0、25.0、12.5mg/mL4組不同濃度纖維蛋白膠支架三維培養后ASCs的生長狀況。結果CCK-8試驗顯示纖維蛋白膠對ASCs無明顯毒性。通過光鏡直接觀察及DEAD/LIVE雙熒光染色后觀察顯示ASCs與不同濃度纖維蛋白膠復合后細胞呈立體三維生長，ASCs增殖速率和健康程度(DEAD/LIVE值)隨纖維蛋白濃度降低而提高，低于25.0mg/mL時細胞增殖速率和健康程度趨于良好。結論ASCs與纖維蛋白膠支架具有良好的體外生物相容性，纖維蛋白濃度低于25.0mg/mL為與ASCs三維培養的適宜濃度。

干細胞；脂肪類；纖維蛋白組織黏著劑；組織工程；支架；組織相容性

臨床上因先天性畸形和獲得性損傷所造成的軟組織缺損的修復及美容需求的軟組織填充是整形修復外科常見問題。目前臨床采用注射透明質酸或膠原的方法存在填充效果維持時間短的弊端，假體植入存在填充效果不自然等缺點，自體脂肪移植由于缺乏微血管也存在再吸收率高的難題[1-2]。以脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ASCs)為種子細胞的脂肪組織工程為研究熱點，特別是與可注射型支架材料為載體構建的組織工程脂肪具有極大的臨床應用價值，有可能為解決這類問題提供優良的軟組織填充材料，并且具有可穩定存活，有結構和功能雙重修復作用，不需開放式外科手術，滿足各種形狀的填充需要等優點[3]。纖維蛋白膠由于其良好的可降解性和生物相容性等特性，被嘗試用于包括組織工程等多個領域的研究[4-5]。在已有研究中，ASCs與纖維蛋白膠支架的三維培養模式缺乏直觀的展示，對于ASCs與不同濃度纖維蛋白膠的生物相容性也缺乏研究，而這是纖維蛋白膠作為支架材料用于可注射型脂肪組織工程的重要參數[6]。因此，本研究將直觀地顯示ASCs復合纖維蛋白膠后三維培養下細胞生長狀況，并摸索最適的纖維蛋白膠支架濃度，為以纖維蛋白膠為支架材料的可注射型脂肪組織工程的臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織材料 游離脂肪組織取自本科26～32歲健康女性腹部吸脂術后廢棄的脂肪組織。術前已與患者談話征得同意，研究經由醫院倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑與儀器 低糖DMEM培養基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶、0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)購于美國Gibco公司；Ⅰ型膠原酶、地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、吲哚美辛、油紅O染色劑、纖維蛋白原、凝血酶購于美國Sigma公司；鼠抗人CD34、CD45、CD49d、CD90、CD105、CD106多克隆抗體購于美國eBioscience公司；碘化丙啶(propidium iodide,PI)、鈣黃綠素乙酰氧基甲酯(Calcein-AM)購于美國Invitrogen公司。CKX41型倒置相差顯微鏡、IX3型熒光倒置顯微鏡購于日本Olympus公司；BD FACSCALIBUR流式細胞儀購于美國BD公司；CO2培養箱、Multiskan Spectrum型多功能酶標儀購于美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 ASCs的分離培養與鑒定

1.2.1.1 ASCs的獲取 取成人吸脂術后的脂肪組織10 mL，加入等體積1.0 mg/mL的Ⅰ型膠原酶溶液混勻后37 ℃恒溫水浴消化40 min，定時搖勻。1 000 r/min離心5 min，去除上層油脂及液體成分，200目濾網過濾。10% FBS低糖DMEM培養基調整細胞濃度為(5～10)×105/L,接種至25 cm培養瓶中常規培養。48 h后首次換液，之后胰蛋白酶消化傳代。傳至第3代用。

1.2.1.2 流式細胞術檢測ASCs表面抗原 取第3代ASCs,胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加少量磷酸鹽緩沖液(PBS)吹打均勻，調整細胞濃度為1×109/L，將細胞懸液移入EP管(每管100 μL)，每管分別加入兩種不同熒光素標記的流式抗體各5 μL，以同型藻紅蛋白標記的免疫球蛋白(PE-IgG)和異硫氰酸熒光素標記的免疫球蛋白(FITC-IgG)為陰性對照，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌兩次以去除未結合的抗體，離心棄上清液后每管加500 μL PBS重懸均勻，上機行雙熒光標記檢測。

1.2.1.3 ASCs的成脂誘導和油紅O染色 取第3代ASCs,胰蛋白酶消化,接種到置有蓋玻片的6孔培養板上,待細胞貼壁融合較多時，將培養基更換為成脂誘導培養基[高糖DMEM，10% FBS,1 μmol/L地塞米松,10 μmol/L胰島素,0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)，200 μmol/L吲哚美辛]，陰性對照用10% FBS的完全培養基培養，每周換液2～3次。定期觀察細胞形態變化，培養2周后取細胞爬片，PBS清洗后4%多聚甲醛固定5 min，洗滌后加入油紅O工作液染色15 min，PBS洗滌兩次后行顯微鏡觀察。

1.2.2 纖維蛋白膠對ASCs毒性檢測 ASCs消化后用含血清培養基調整為1×104/mL細胞懸液，按以下種板方式接種于96孔板中。空白支架組：用雙聯注射器各抽取50 μL的纖維蛋白原和凝血酶，注射入孔板底部形成100 μL纖維蛋白膠，不加細胞懸液。支架復合細胞組：同法形成100 μL纖維蛋白膠鋪于板底，成膠后再每孔加入100 μL細胞懸液。對照組：每孔加入100 μL細胞懸液。每組5個復孔，共接種5塊96孔板。分別在1、2、3、5、7 d各取出一板，于支架復合細胞組和對照組分別加入CCK-8 10 μL，孵育2 h，酶標儀檢測450 nm處光密度(OD)值。實驗組OD值=(支架復合細胞組OD值-空白支架組OD值)。將各點OD值用統計學作圖軟件在坐標紙上繪出實驗組和對照組增殖曲線。

1.2.3 ASCs與不同濃度纖維蛋白膠支架復合后早期存活狀況 將凝血酶用DMEM溶解為500 IU/mL的凝血酶溶液，用該溶液將ASCs制成約1×105/mL懸液。然后將纖維蛋白原分別溶解稀釋為200.0、100.0、50.0、25.0 mg/mL 4組。通過雙聯注射器各抽取0.2 mL混合ASCs的凝血酶溶液和以上相應濃度的纖維蛋白原溶液，分別注入24孔板中，同法種板3塊，纖維蛋白原終濃度被等比稀釋為100.0、50.0、25.0、12.5 mg/mL 4組，待成膠后再各孔加含血清培養基1 mL培養24 h,光鏡下觀察4組中ASCs生長形態，存活數量差異，并且每組取3張照片通過兩名實驗者用photoshop點計數工具進行細胞計數，通過統計學作圖軟件制作柱狀圖。

1.2.4 ASCs與不同濃度纖維蛋白膠支架復合后期生長狀況 將以上纖維蛋白原濃度為100.0、50.0、25.0、12.5 mg/mL的纖維蛋白膠+ASCs復合物于培養第5天取一塊孔板，用PBS洗滌兩遍，按說明書往孔板中加入含1/10體積2、4 μmol/L的Calcein-AM和PI的細胞培養基，置于37 ℃孵箱孵育15 min，再用PBS洗滌兩遍。在熒光顯微鏡下，先使用490 nm激發波長觀察綠色的活細胞，然后用545 nm激發波長觀察紅色的死細胞。觀察各組細胞形態特征、活細胞/死細胞(DEAD/LIVE)數量。每組選取3個視野下拍攝的綠色熒光和紅色熒光圖片通過兩名實驗者用photoshop點計數工具進行細胞計數，通過統計學作圖軟件制作柱狀圖。

2 結 果

2.1ASCs光鏡下形態學觀察 第3代ASCs為典型的成纖維細胞樣形態，呈細長梭形，有粗大的分支，核仁明顯，細胞骨架伸展較大，細胞生長密集時呈現漩渦性，見圖1。

A:100倍;B:200倍。

圖1 第3代ASCs蘇木素-伊紅染色觀察

2.2 流式細胞術檢測ASCs表面抗原表達結果 選取的第3代ASCs經6種流式抗體結合后上機檢測，結果顯示ASCs高表達CD49d(94.8%)，CD90(99.8%)，CD105(99.8%)，不表達或極低表達CD34(3.1%)，CD45(2.9%)，CD106(1.3%)，見圖2。

圖2 第3代ASCs流式細胞術檢測表面抗原

2.3ASCs的成脂誘導和油紅O染色結果ASCs在成脂誘導培養基中誘導兩周后脂滴形成較多，融合為較大脂滴，經油紅O染色后可見脂滴被染成紅色，見圖3。

A:染色前；B:染色后。

圖3ASCs成脂誘導2周油紅O染色(倒置相差顯微鏡，×200)

2.4 纖維蛋白膠對ASCs增殖的影響檢測結果 通過CCK-8檢測實驗組和對照組1、2、3、5、7dA值，間接反映兩組細胞增殖情況，在坐標上繪成曲線，各時間點實驗組和對照組組間差異無統計學意義(P=0.113、0.264、0.436、0.605、0.468)，顯示纖維蛋白膠對ASCs增殖無明顯毒害影響，見圖4。

圖4 CCK-8檢測實驗組和對照組ASCs增殖曲線

2.5ASCs與不同濃度的纖維蛋白膠支架復合后早期存活狀況 復合培養24h顯示細胞伸展受到一定限制，細胞變成細長，呈三維立體生長，并可見部分未伸展出來的死細胞。組間可見明顯差異，100.0、50.0mg/mL組中細胞形態極度變形，細胞伸展程度較小，并且活細胞數明顯偏少，25.0、12.5mg/mL組細胞形態較為飽滿規則，細胞伸出多個突起，細胞存活數明顯增多。細胞計數顯示隨支架濃度降低ASCs存活率增高，25.0、12.5mg/mL組間差異無統計學意義(P=0.956)，存活率趨于穩定，濃度低于25.0mg/mL時ASCs存活良好，為適宜濃度，見圖5。

A：不同濃度的細胞支架復合物培養第24小時光鏡觀察(倒置相差顯微鏡，×100)；B:點計數各組中ASCs細胞數。

圖5ASCs與不同濃度的纖維蛋白膠復合后早期存活情況

2.6ASCs與不同濃度的纖維蛋白膠復合后期生長狀況 以上支架細胞復合物培養第5天，DEAD/LIVE試劑盒染色后可清晰地觀察到人ASCs在支架材料內的形態特征和生長狀況。可見ASCs在支架材料中保持大致梭形外形，細胞突起明顯較前增多。綠色熒光圖片顯示隨著支架濃度的減低，細胞形態趨于正常培養形態，生長數量明顯增多；紅色熒光圖片顯示細胞凋亡隨著支架濃度的減低逐漸減少。細胞點計數顯示隨纖維蛋白膠支架濃度降低，ASCs增殖速率明顯增高，細胞健康程度(DEAD/LIVE)明顯提高，25.0、12.5mg/mL兩組間活細胞數差異無統計學意義(P=0.424)，濃度低于25.0mg/mL時ASCs增殖速率和健康程度良好，為適宜濃度，見圖6。

A：不同濃度的細胞支架復合物培養第5天DEAD/LIVE試劑盒染色觀察(熒光倒置顯微鏡，×100)；B:點計數DEAD/LIVE雙染后各組細胞數。

圖6ASCs與不同濃度的纖維蛋白膠復合后期生長情況

3 討 論

脂肪組織工程的構建需要有合適的種子細胞，研究已經證實脂肪組織中含有大量ASCs[7-9]。由于脂肪組織量大，由此推測其可能是人體中最大的成體干細胞庫。

研究顯示擴增的ASCs表達間充質干細胞的表面標記物如CD90、CD105，表達黏附分子CD49d；缺乏造血系統標記物CD34、CD45，缺乏內皮細胞標記物CD31及免疫抗原標記組織相溶性抗原-DR(HLA-DR)，缺乏血管內皮細胞黏附分子CD106[10-13]，并且具有多向分化潛能[14-15]。本研究中獲取的ASCs綜合形態學特征、表面抗原標記和分化能力，符合ASCs的多種特性。

纖維蛋白膠為從血漿中制備的纖維蛋白原和凝血酶混合后模擬凝血反應最后通路聚合而成的纖維蛋白水凝膠。由于纖維蛋白膠具有良好的生物相容性和生物降解性，已經作為生物支架用于平滑肌、骨、軟骨組織工程研究中[16-17]。另外，研究也顯示纖維蛋白膠可以明顯提高移植脂肪存活率和微血管化[18-19]。其次，交聯的纖維蛋白可以支撐起細胞生長的立體的物理空間，使得細胞在其內呈現類似于體內生長時的三維生長模式。現有的研究已經表面，二維培養時細胞的黏附、增殖、基因表達均不同于立體三維培養[20-21]，細胞處于三維培養將更接近細胞在體內的生長環境[22]。這些構成了纖維蛋白膠作為組織工程支架的理論基礎。

本研究結果顯示纖維蛋白膠對于二維培養下的ASCs的增殖沒有明顯影響，提示纖維蛋白膠對于二維培養的ASCs不產生直接的毒性作用，顯示了與ASCs良好的生物相容性。將ASCs與纖維蛋白膠支架復合后三維培養，可見ASCs在纖維蛋白膠支架內沿著三維凝膠支架各個方向伸展。由于調節纖維蛋白聚合的濃度即可以產生不同的力學強度和纖維排列，因而不同濃度的纖維蛋白膠支架對于ASCs的三維生長具有重要影響，本研究結果也證實了這種顯著差異。復合24h后光鏡下觀察顯示100.0mg/mL、50.0mg/mL組中提示過高的濃度會使得細胞處于過大的力學壓迫，限制了細胞生長空間，也使得細胞獲取營養更加困難，造成了ASCs早期的大量死亡。25mg/mL、12.5mg/mL組細胞形態較為飽滿規則，細胞伸出多個突起，細胞存活明顯增多。早期總體表現為隨支架濃度降低細胞存活增加，纖維蛋白濃度低于25.0mg/mL時ASCs存活良好，為適宜濃度。

DEAD/LIVE試劑盒是通過Calcein-AM和PI分別將活細胞胞質和死細胞核染成綠、紅色，可進行細胞標記，也用于檢測細胞存活率[23]。以上支架細胞復合物培養后期(第5天)，DEAD/LIVE試劑盒染色后清晰地觀察到ASCs在支架材料內的形態特征和生長狀況。黃綠色熒光圖片中顯示隨著支架濃度的減低，細胞增殖速率明顯增高，細胞形態更符合正常培養形態；同一視野下紅色熒光圖片顯示細胞凋亡數隨著支架濃度的減低逐漸減少，顯示細胞健康程度(LIVE/DEAD)明顯升高。25.0、12.5mg/mL兩組間差異無統計學意義，細胞生長趨于相似，亦提示纖維蛋白濃度低于25.0mg/mL時ASCs的增殖速率及健康程度均較為良好。

本研究結果顯示ASCs與纖維蛋白膠具有良好的生物相容性，纖維蛋白膠支架可能作為脂肪組織工程優良的可注射型三維支架材料；不同濃度的纖維蛋白膠支架對于ASCs的生長影響具有顯著差異，支架中纖維蛋白濃度低于25mg/mL為適宜濃度，由此為后續進行以纖維蛋白膠作為支架材料的脂肪組織工程研究提供了重要參數指導。

[1]ChangQ,LuF.Anovelstrategyforcreatingalargeamountofengineeredfattissuewithanaxialvascularpedicleandaprefabricatedscaffold[J].MedHypotheses,2012,79(2):267-270.

[2]TanziMC,FarèS.Adiposetissueengineering:stateoftheart,recentadvancesandinnovativeapproaches[J].ExpertRevMedDevices,2009,6(5):533-551.

[3]陽水發，易陽艷．脂肪干細胞構建可注射型組織工程脂肪的研究進展[J]．中國修復重建外科雜志，2015，29(2)：245-249．

[4]MurphyKC,FangSY,LeachJK.Humanmesenchymalstemcellspheroidsinfibrinhydrogelsexhibitimprovedcellsurvivalandpotentialforbonehealing[J].CellTissueRes,2014,357(1):91-99.

[5]CatelasI,SeseN,WuBM,etal.Humanmesenchymalstemcellproliferationandosteogenicdifferentiationinfibringelsinvitro[J].TissueEng,2006,12(8):2385-2396.

[6]張云松，高建華，魯峰，等．人脂肪來源干細胞復合纖維蛋白膠構建可注射型工程化脂肪組織的實驗研究[J]．中華醫學雜志，2008，88(38)：2705-2709．

[7]ZukPA,ZhuM,MizunoH,etal.Multilineagecellsfromhumanadiposetissue:implicationsforcell-basedtherapies[J].TissueEng,2001,7(2):211-228.

[8]MizunoH,TobitaM,UysalAC.Concisereview:adipose-derivedstemcellsasanoveltoolforfutureregenerativemedicine[J].StemCells,2012,30(5):804-810.

[9]StremBM,ZhuM,AlfonsoZ,etal.Expressionofcardiomyocyticmarkersonadiposetissue-derivedcellsinamurinemodelofacutemyocardialinjury[J].Cytotherapy,2005,7(3):282-291.

[10]TahaMF,HedayatiV.Isolation,identificationandmultipotentialdifferentiationofmouseadiposetissue-derivedstemcells[J].TissueCell,2010,42(4):211-216.

[11]BianchiF,MaioliM,LeonardiE,etal.Anewnonenzymaticmethodanddevicetoobtainafattissuederivativehighlyenrichedinpericyte-likeelementsbymildmechanicalforcesfromhumanlipoaspirates[J].CellTransplant,2013,22(11):2063-2077.

[12]KoMS,JungJY,ShinIS,etal.Effectsofexpandedhumanadiposetissue-derivedmesenchymalstemcellsontheviabilityofcryopreservedfatgraftsinthenudemouse[J].IntJMedSci,2011,8(3):231-238.

[13]MiranvilleA,HeeschenC,SengenèsC,etal.Improvementofpostnatalneovascularizationbyhumanadiposetissue-derivedstemcells[J].Circulation,2004,110(3):349-355.

[14]楊平，尹爍，崔磊，等．脂肪干細胞向血管平滑肌細胞誘導的實驗研究[J]．中國修復重建外科雜志，2008，22(4)：481-486．

[15]ChoiYS,MatsudaK,DustingGJ,etal.Engineeringcardiactissueinvivofromhumanadipose-derivedstemcells[J].Biomaterials,2010,31(8):2236-2242.

[16]IkariY,FujikawaK,YeeKO,etal.Alpha(1)-proteinaseinhibitor,alpha(1)-antichymotrypsin,oralpha(2)-macroglobulinisrequiredforvascularsmoothmusclecellspreadinginthree-dimensionalfibringel[J].JBiolChem,2000,275(17):12799-12805.

[17]MeinhartJ,FusseneggerM,H?blingW.Stabilizationoffibrin-chondrocyteconstructsforcartilageReconstruction[J].AnnPlastSurg,1999,42(6):673-678.

[18]Kara?alN,CobanogluU,AmbarciogluO,etal.Theeffectoffibringlueonfatgraftsurvival[J].JPlastReconstrAesthetSurg,2007,60(3):300-303.

[19]BeckerJC,DomschkeW,PohleT.Biologicalinvitroeffectsoffibringlue:fibroblastproliferation,expressionandbindingofgrowthfactors[J].ScandJGastroenterol,2004,39(10):927-932.

[20]NelsonWJ.Adaptationofcoremechanismstogeneratecellpolarity[J].Nature,2003,422(6933):766-774.

[21]TibbittMW,AnsethKS.Hydrogelsasextracellularmatrixmimicsfor3Dcellculture[J].BiotechnolBioeng,2009,103(4):655-663.

[22]KraehenbuehlTP,LangerR,FerreiraLS.Three-dimensionalbiomaterialsforthestudyofhumanpluripotentstemcells[J].NatMethods,2011,8(9):731-736.

[23]ZhouS,CuiZ,UrbanJ.Deadcellcountsduringserumcultivationareunderestimatedbythefluorescentlive/deadassay[J].BiotechnolJ,2011,6(5):513-518.

Compatibility between human adipose derived stem cells and different concentrations of fibrin gel*

YangShuifa,YiYangyan△,HuangYan,WuShu,WangZhaohui

(DepartmentofPlasticSurgery,SecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330000,China)

Objective To research the in vitro compatibility between adipose-derived stem cells (ASCs) and fibrin gel scaffold.Methods The human primary ASCs were obtained and identified.The toxicity of fibrin gel on ASCs was detected by CCK-8 test.The light microscopy and DEAD/LIVE double labelled staining fluorescence were used to observe the ASCs growth situation after three dimensional culture of ASCs with 4 concentrations of 100.0,50.0,25.0,12.5 mg/mL fibrin gel scaffold.Results The CCK-8 test showed no significant toxicity of fibrin gel on ASCs.The light microscopy and DEAD/LIVE double labelled staining fluorescence direct observation revealed that ASCs showed a stereo three-dimensional cell growth pattern after cultivation with fibrin gel scaffold,the ASCs proliferation rate and health degree(DEAD/LIVE value) were elevated with the fibrin concentration decrease,in the fibrin concentration less than 25 mg/mL,the cellular proliferation rate and health degree tended to be better.Conclusion ASCs and fibrin gel scaffold have favorable in vitro biocompatibility,and the fibrin gel concentration which is less than 25.0 mg/mL is appropriate for ASCs three-dimensional culture.

stem cells；fats；fibrin tissue adhesive；tissue engineering;scaffold;histocompatibility

??·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.006

江西省科技支撐計劃(2010BSA15100,2010BSB00201)；江西省自然科學基金(20151BAB205034)。

陽水發(1989-)，在讀碩士，主要從事組織工程和脂肪移植方面研究。△

E-mail:yyy0218@126.com。

R

A

1671-8348(2017)02-0165-04

2016-06-18

2016-09-26)