長鏈非編碼RNABANCR在肝細胞癌組織中表達上調及其對患者疾病預后價值探討

趙 冀，周 超，李宏敏，楊洪吉

(四川省人民醫院：1.器官移植中心；2.消化內科；3.腫瘤科，成都 610000)

長鏈非編碼RNABANCR在肝細胞癌組織中表達上調及其對患者疾病預后價值探討

趙 冀1，周 超2，李宏敏3，楊洪吉1

(四川省人民醫院：1.器官移植中心；2.消化內科；3.腫瘤科，成都 610000)

目的 探討BRAF激活的長鏈非編碼RNA(BANCR)在肝細胞癌(HCC)組織中表達上調及其對患者疾病預后價值。方法 采用實時定量PCR檢測HCC組織和細胞系中BANCR表達情況，分析BANCR表達水平與患者臨床病理學特征關系，采用四甲基噻唑藍(MTT)、流式分析和腫瘤細胞體外侵入遷移分析探討BANCR在HCC細胞中的生物學功能。結果 與臨近非腫瘤組織相比，HCC組織標本中BANCR表達水平明顯上調(P<0.01)，且HCC細胞系中BANCR表達水平也明顯上調(P<0.05)。臨床病理學特征分析結果提示BANCR表達升高與較高的腫瘤分級、腫瘤直徑、靜脈侵入及較高的TNM分期密切相關(P<0.05)。BANCR過表達HCC患者總生存期明顯短于低表達患者(P<0.01)。多重變量Cox回歸分析提示BANCR表達(RR=4.245，P=0.015)、腫瘤直徑(RR=2.655，P=0.039)、靜脈侵入(RR=3.278，P=0.022)和TNM分期(RR=6.379，P=0.006)是HCC患者總生存期獨立預后因素。此外，Hep3B細胞中BANCR表達下調能明顯抑制細胞侵入和轉移，同時導致波形蛋白下調和E-鈣黏蛋白上調。結論 本研究結果表明BANCR可能參與HCC的發生和發展過程，可以作為HCC患者疾病預后標志物和臨床治療靶標。

RNA；肝腫瘤；癌，肝細胞；長鏈非編碼RNA，BANCR；預后

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)在全球常見腫瘤中排第5，其發病率呈逐年上升趨勢，在中國也是如此[1]。盡管臨床和實驗腫瘤學不斷取得進展，但由于患者大多在腫瘤晚期確診，缺乏有效治療和介入方法，因此臨床長期預后較差。早期研究揭示了多種與HCC相關的調節基因和信號通路[2-3]，然而HCC發生和發展潛在的高度復雜的分子機制目前仍所知甚少。因此，臨床急需一種HCC早期診斷，有效治療和預后的分子標志物。BRAF激活的非編碼RNA(BANCR)為693 bp的長鏈非編碼RNA(lncRNA)，由Flockhart等[4]在黑色素瘤細胞中發現。隨后，甲狀腺乳頭狀癌[5]、視網膜母細胞癌[6]、肺癌[7-8]、胃癌和結直腸癌[9]中均發現lncRNA BANCR表達異常。上述腫瘤中BANCR均參與腫瘤細胞增殖、遷移和侵入，然而其在HCC中表達的研究較少。本研究檢測BANCR在HCC組織和細胞系中的表達，同時分析其表達與HCC患者臨床病理學特征的關系，此外，本研究還初步探討了BANCR對HCC細胞的調節作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 HCC組織和相應臨近非腫瘤組織均采集于2009～2011年本院治療的109例HCC患者，均在術中采集并置于液氮中保存。所有患者均為原發病例，患者臨床病理學特征從病歷中獲取，入組前均未接受任何治療，并將所取組織分為HCC組織組和非腫瘤組織組。本研究通過本院倫理委員會審批。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與RNA干擾 HCC細胞系(HuH-7，Hep3B，HepG2和H2-M)及健康人肝細胞CL-48均購自ATCC(美國)，采用高糖(4.5 g/L)DMEM培養基，培養條件為5% CO237 ℃。青、鏈霉素終濃度為100 U/mL，此外還添加10%胎牛血清。lncRNA BANCR干擾RNA(si-BANCR)和對照干擾RNA(siRNA)均購自Sigma-Aldrich公司，采用Lipofectamine 2000進行轉染，48 h收集細胞。

1.2.2 RNA提取和實時定量PCR檢測 組織miRNA采用mirVana miRNA提取試劑盒(AB公司，美國)提取，通過SPECTRAmax微孔板紫外分光光度計(Molecular devices corp，美國)測定微RNA(miRNA)濃度，參考文獻[6]合成BANCR和內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)擴增引物。通過2-ΔΔCt方法，根據內參含量計算miRNA-21的相對表達水平。

1.2.3 細胞增殖、凋亡分析 采用四甲基噻唑藍(MTT)方法進行細胞增殖分析，步驟如下：鋪96孔板，每孔細胞1×103，連續培養。兩組都加入20 μL MTT(5 mg/mL)，孵育4 h后移去上清液，DMSO每孔150 μL，測定光密度(OD) 490 nm值。轉染48 h后，收集細胞，預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌、重旋后，采用碘化丙啶(10 μg/mL)和鈣磷脂結合蛋白Ⅴ(50 μg/mL)處理細胞，黑暗環境下室溫孵育15 min后，進行流式分析。

1.2.4 細胞侵入和轉移分析 采用6孔transwell小室(直徑8 μm)進行腫瘤細胞的侵入和轉移分析，進行轉移分析時，將轉染后的1×105的HCC細胞加入不含血清培養基的上室中，下室為含20%胎牛血清的全培養基，刺激細胞轉移，孵育48 h，取出下室置于95%的乙醇中，固定 10 min，0.1%的結晶紫染色20 min，顯微計數。進行腫瘤細胞侵入分析時，上室中加入5 mg/mL的基質膠，其他步驟與轉移分析相同。

1.2.5 Western blot分析 采用含蛋白酶的RIPA溶液裂解細胞，并抑制內源性磷酸酶活性，采用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進行電泳后轉印蛋白至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，常規封閉后，孵育一抗(Cell signal，美國)，之后采用H辣根過氧化酶(HRP)標記的二抗進行孵育，加入電化學發光(ECL)Plus進行發光， GAPDH作為內參蛋白。

1.3 統計學處理 采用SPSS19.0軟件處理，BANCR表達水平與其他因素的相關性采用卡方檢驗和Fisher′s精準檢驗或獨立t檢驗。采用Kaplan-Meier方法計算患者生存期，根據術后隨訪結果計算患者總生存期。組間生存期比較則采用秩和檢驗，對于單一變量檢測影響HCC患者總生存期的顯著性因素進行多重變量分析，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HCC組織和細胞系中BANCR表達檢測 采用實時定量PCR檢測HCC組織和細胞系中BANCR表達水平。與臨近非腫瘤組織相比，HCC組織中BANCR表達顯著上調(P<0.01)，且4株HCC細胞系中BANCR表達也顯著上調(P<0.05)，見圖1。其中Hep3B細胞系中BANCR表達升高水平高于其他3株細胞，因此選擇其進行后續體外實驗。

A:HCC組織和臨近非腫瘤組織BANCR表達檢測；B:4株HCC細胞系中BANCR表達檢測。

圖1 HCC組織和細胞系中BANCR表達實時定量PCR檢測

2.2 BANCR表達與HCC患者臨床病理學特征關系分析 本研究進一步探討BANCR表達與HCC患者臨床病理學特征關系，根據109例患者HCC組織標本BANCR表達檢測的平均值將其分成低表達組(55例)和高表達組(54例)。結果表明BANCR表達與較高腫瘤分級(P=0.007)、較大腫瘤直徑(P=0.003)、靜脈侵入(P=0.001)和較高的TNM分期(P=0.002)密切相關，而與患者的年齡、性別、肝硬化、血清AFP水平和實體瘤數量無關，見表1。

2.3 BANCR表達與HCC患者疾病預后 為探討BANCR表達升高對HCC患者總生存期預后的價值，本研究采用Kaplan-Meier方法和秩和檢驗進行統計分析，結果提示BANCR過表達HCC患者總生存期顯著短于低表達患者(P<0.01)，見圖2。此外，僅在較小腫瘤直徑(P=0.025)、分化良好腫瘤(P=0.037)、靜脈侵入陰性(P=0.008)和TNM早期(P<0.01)患者中觀察到生存效益，見表2。多重變量Cox回歸分析提示BANCR表達(RR=4.245，P=0.015)、腫瘤直徑(RR=2.655，P=0.039)、靜脈侵入(RR=3.278，P=0.022)和TNM分期(RR=6.379，P=0.006)是HCC患者總生存期獨立預后因素。

表1 BANCR表達與HCC患者臨床病理學特征關系分析

續表1 BANCR表達與HCC患者臨床病理學特征關系分析

圖2 HCC患者BANCR表達的Kaplan-Meier分析

相關因素單一變量分析RRP多重變量分析RRP性別0.7210.455--年齡0.7850.323--腫瘤直徑3.2520.0252.6550.039實體瘤數量0.8680.156--血清AFP0.8160.194--肝硬化0.9040.092--腫瘤分級2.3870.0370.7950.146TNM分期6.225<0.016.3790.006靜脈侵入5.1530.0083.2780.022BANCR表達5.983<0.014.2450.015

-:無數據。

2.4 BANCR表達下調對Hep3B細胞生物學行為影響 本研究進一步探討BANCR表達下調對Hep3B細胞生物學行為影響，采用si-BANCR轉染Hep3B細胞。與對照組(Si-NC)相比，BANCR表達下調能顯著抑制Hep3B細胞增殖，并能促進細胞凋亡。此外，Hep3B細胞的侵入和轉移能力也顯著下降，見圖3。

2.5 BANCR介導的EMT表型分析 Western blot提示BANCR下調導致波形蛋白(Vimentin)表達下調和E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達上調，見圖4。

A:BANCR表達水平實時定量PCR檢測；B:Hep3B細胞MTT分析；C:Hep3B細胞流式分析；D、E:Hep3B細胞腫瘤細胞體外侵入遷移分析。

圖3 BANCR表達下調對Hep3B細胞生物學行為影響分析

圖4 Western blot方法檢測波形蛋白和E-cadherin表達情況

3 討 論

對調節HCC形成和發展的新型分子進行鑒定有利于疾病的預防，并對其診斷和治療具有重要意義，lncRNAs與腫瘤之間的關系成為當前腫瘤研究的熱點領域，目前研究報道了幾種HCC組織中表達異常的lncRNAs，例如HCC細胞系中lncRNA AOC4P過表達可以通過抑制內皮細胞間質化(EMT)，進而抑制細胞增生、遷移和侵入[10-11]。lncRNA UCA1在HCC組織中表達異常升高，且與患者TNM分期、轉移和術后生存期密切相關[12]，體內/體外敲除UCA1后HCC細胞生長均受到抑制。血清lncRNA-AF085935可以用于鑒別診斷非乙型肝炎病毒(HBV)感染的HCC患者和HBV感染的HCC患者[13]。負荷HCC腫瘤小鼠注射lncRNA PTENP1表達質粒后能有效控制腫瘤生長，抑制瘤內細胞增殖、引發凋亡、自噬和抑制腫瘤的血管生成[14]。上述研究表明lncRNAs在HCC的發生和發展中發揮重要作用，且具備較好的臨床運用潛力。

本研究中結果表明HCC組織和細胞系中BANCR表達明顯升高，提示BANCR過表達與HCC的發生密切相關。其次，BANCR表達增加與患者HCC的侵襲性臨床病理學特征相關。下調BANCR 在Hep3B細胞中表達水平能降低細胞增生，促進細胞凋亡和減弱細胞侵襲和轉移。這些發現提示BANCR可能參與HCC發展，可能作為腫瘤治療的靶分子。最后，本研究發現BANCR高表達的HCC患者的總生存期顯著短于低表達患者。多重變量Cox回歸分析表明，BANCR過表達是HCC患者疾病預后不良的獨立因素。

研究報道表明BANCR是多種人類腫瘤的癌基因，BANCR在人類惡性黑色素瘤組織中表達增加與腫瘤晚期相關，且敲除BANCR可以通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑抑制黑色素瘤細胞增殖和遷移[4,15]。在結直腸癌中BANCR過表達與患者腫瘤分期和淋巴結轉移密切相關，且可以通過EMT機制促進腫瘤細胞轉移。與臨床非腫瘤組織相比，胃癌組織中BANCR表達顯著升高，且BANCR表達水平與胃癌患者臨床分期、腫瘤深度、淋巴結轉移、遠處轉移和預后不良呈正相關[9]。體外研究表明，BANCR可以調節視網膜母細胞瘤細胞增殖、遷移和侵入，且BANCR過表達與腫瘤直徑、脈絡膜侵入和視神經侵入密切相關[6]。

EMT是原位腫瘤細胞獲得遷移能力的關鍵步驟[16]，Vimentin上調和E-cadherin下調與HCC發展相關[17-18]，越來越多研究證實lncRNAs，包括BANCR，可能參與EMT途徑的調節[10,11,19,20]。本研究中BANCR表達下調后導致Vimentin下調和E-cadherin上調，提示BANCR可能參與HCC的EMT調節，進而為BANCR相關的細胞高轉移傾向提供了合理的解釋。

總之，本研究證實HCC組織和細胞系中BANCR表達上調，且其過表達與腫瘤發展和預后不良密切相關，調控HCC細胞系中BANCR表達會影響細胞的生物學特性。上述結果提示BANCR可能是參與HCC發生和發展的癌基因，可以作為HCC預后的新型標志物和潛在的治療靶分子。

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Expression up-regulation of lncRNA BANCR in hepatocellular carcinoma tissue and its prognostic value on patients′ disease

ZhaoJi1，ZhouChao2，LiHongmin3，YangHongji1

(1.OrganTransplantationCenter;2.DepartmentofGastroenterology;3.DepartmentofOncology,SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu,Sichuan610000,China)

Objective To investigate the expression up-regulation of BRAF activated LncRNA(BANCR) in hepatocellular carcinoma(HCC) tissue and its prognostic value on patients′ disease.Methods The quantitative real-time PCR(qRT-PCR) was used to detect BANCR expression in HCC tissues and cell lines.The association between BANCR expression level and clinicopathological features was also analyzed.3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT),flow cytometry,and transwell invasion and migration assays were used to investigate the biological function of BANCR in the HCC cells.Results Compared with adjacent noncancerous tissues,BANCR expression was remarkably increased in HCC tissue sample (P< 0.01),moreover BANCR expression in HCC cell lines was also significantly up-regulated (P<0.05).The clinicopathologic features analysis revealed that the BANCR expression increase was closely correlated with higher tumor grade,tumor size,venous infiltration and higher TNM staging(P<0.05).The total survival period in HCC patients with BANCR overexpression was significantly shorter than that in the patients with BANCR low expression (P<0.01).The multi-variate Cox regression analysis indicated that the BANCR expression(RR=4.245，P=0.015),tumor diameter(RR=2.655，P=0.039),venous invasion(RR=3.278，P=0.022) and TNM staging(RR=6.379，P=0.006) were the independent prognostic factor of the total survival period in the HCC patients.Moreover,BANCR expression down-regulation in Hep3B cells could significantly inhibit the cellular invasion and transfer,meanwhile led to vimentin down-regulation and E-cadherin up-regulation.Conclusion This research results suggest that BANCR may contribute to HCC initiation and development process and would be used as a marker of the prognosis in HCC patients as well as a therapeutic target.

RNA；liver neoplasms;hepatocellular carcinoma;long non-coding RNA,BANCR;prognosis

趙冀(1980-)，主治醫師，博士，主要從事器官移植、肝癌方面研究。

? 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.002

R

A

1671-8348(2017)02-0148-04

2016-07-20

2016-09-09)