WTX基因對結腸癌細胞增殖和凋亡的作用*

曹夢園，白 洋，許 穎

(1.吉林省醫學期刊社，長春 130021；2.吉林大學第一醫院超聲科，長春 130021；3.吉林大學第一醫院腎內科，長春 130021)

WTX基因對結腸癌細胞增殖和凋亡的作用*

曹夢園1，白 洋2，許 穎3△

(1.吉林省醫學期刊社，長春 130021；2.吉林大學第一醫院超聲科，長春 130021；3.吉林大學第一醫院腎內科，長春 130021)

目的 WTX基因轉染結腸癌Lovo細胞株，分析WTX基因對結腸癌細胞增殖和凋亡的影響。方法 將結腸癌Lovo細胞株分為WTX基因轉染組和對照組，WTX基因轉染組給予WTX質粒轉染，對照組給予空載質粒轉染。觀察WTX基因轉染組和對照組WTX基因的表達情況，兩組Lovo細胞株結腸癌細胞的增殖情況、凋亡情況及細胞周期變化。結果 WTX基因轉染組結腸癌細胞WTX蛋白表達明顯高于對照組(P<0.05)；WTX基因轉染組結腸癌轉染后4、7 d光密度值均明顯低于對照組(P<0.05)；WTX基因轉染組G1期細胞比例明顯高于對照組(P<0.05)，WTX基因轉染組G2期和S期細胞比例明顯低于對照組(P<0.05)。結論 WTX基因抑制結腸癌細胞的增殖，影響結腸癌細胞周期，對結腸癌細胞凋亡沒有影響。

結腸腫瘤；基因；流式細胞術；細胞凋亡；WTX基因；結腸癌Lovo細胞株；細胞增殖

結腸癌的發生是一個多階段、多步驟的比較復雜的過程，近年來其發病率和病死率有上升趨勢[1]，目前結腸癌的治療效果欠佳，預后比較差，主要的治療方法是手術切除、放化療和生物治療等的綜合治療[2]。結腸癌發生的分子機制主要有DNA損傷修復基因的功能異常，抑癌基因的缺失突變，癌基因激活，凋亡機制異常等，多種癌基因的激活和過度表達及多種抑癌基因的缺失和突變在結腸癌的發展過程中發揮重要作用[3]。WTX基因和腫瘤的發生、發展，以及腫瘤的增殖凋亡有一定關系，對腫瘤有抑制作用[4]。Wnt通路和結腸癌的發生、發展關系密切，WTX是Wnt通路的負向調節因子[5-6]。因此，WTX基因可能和結腸癌的發病有一定關系。本研究通過WTX基因轉染結腸癌Lovo細胞株，探討WTX基因對結腸癌細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 結腸癌細胞株 Lovo結腸癌細胞株購自昆明動物所細胞庫。

1.1.2 主要試劑和儀器 質粒(美國Fermentas公司)，質粒小提試劑盒(美國Fermentas公司)，DMEM培養基(美國Fermentas公司)，胎牛血清(四季青生物工程材料有限公司)，胰酶(美國Fermentas公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS，美國Fermentas公司)等；電泳儀(美國BD公司)，流式細胞儀(美國BD公司)，培養箱(美國BD公司)等。

1.2 方法

1.2.1 實驗方法 (1)分組：分為WTX基因轉染組和對照組，WTX基因轉染組給予WTX質粒轉染，對照組給予空載質粒轉染。(2)質粒提取：將PLV.E3d.null-EF1A>IRES/eGFP空載質粒和PLV.E3d.null-EF1A>WTX>IRES/eGFP WTX質粒在培養皿中劃線，過夜培養，挑選單克隆菌落移入離心管中，搖床搖菌，用EndoFree Plasmid Maxi Kit試劑盒提取質粒。(3)細胞轉染：將轉染前傳代培養生長良好的結腸癌細胞株Lovo加入培養液重懸細胞，然后加入12孔板孔中(每孔含細胞3×105)，細胞培養6 h，質粒DNA加入Attractene Transfction Reagent形成轉染復合物，將轉染復合物加入細胞中轉染細胞2～3 d。(4)觀察轉染結果：空載質粒濃度2 100 μg/mL，WTX質粒濃度1 250 μg/mL，符合轉染要求，空載質粒72 h后轉染率68%，WTX質粒72 h后轉染率37%。

1.2.2 觀察指標 兩組WTX基因的表達情況，兩組Lovo細胞株結腸癌細胞的增殖情況、凋亡情況及細胞周期變化。(1)WTX蛋白表達的測定：采用Western blot法檢測兩組WTX蛋白的表達情況。(2)增殖情況：將轉染細胞加入CCK-8溶液，孵育4 h染色，在酶標儀上測定第1、4、7天450 nm波長的光密度(optical density，OD)值。(3)凋亡情況測定：采用流式細胞儀測定轉染后1、4、7 d 兩組細胞的早期凋亡、晚期凋亡和總凋亡情況。(4)生長周期測定：采用流式細胞儀測定細胞生長周期情況，檢測結果用細胞周期擬合軟件進行分析。

2 結 果

2.1 兩組WTX基因的表達情況Westernblot結果顯示：WTX基因轉染組結腸癌細胞WTX蛋白表達明顯高于對照組(P<0.05)，過表達WTX基因結腸癌細胞株成功建立，見圖1、表1。

2.2 兩組結腸癌細胞的增殖情況CCK8染色檢測結果：WTX基因轉染組結腸癌轉染后4、7dOD值均明顯低于對照組(P<0.05)，WTX基因轉染組結腸癌轉染后1dOD值和對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3 兩組結腸癌細胞的凋亡情況 流式細胞儀法檢測結果：WTX基因轉染組轉染后1、4、7d結腸癌細胞的早期凋亡率、晚期凋亡率與總凋亡率和對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。

圖1 兩組WTX蛋白電泳圖

組別β-actin灰度值WTX灰度值WTX基因轉染組54.32±11.0270.02±12.42對照組55.17±10.3840.21±6.34t0.3747.342P0.9670.000

表2 兩組結腸癌細胞的OD值

表3 轉染后1、4、7 d 兩組結腸癌細胞的凋亡情況

2.4 兩組結腸癌細胞周期比較 流式細胞儀檢測結果發現：WTX基因轉染組G1期細胞比例明顯高于對照組(P<0.05)，WTX基因轉染組G2期和S期細胞比例明顯低于對照組(P<0.05)，見表4、圖2。

表4 兩組結腸癌細胞周期比較

A：WTX基因轉染組；B:對照組。

圖2 兩組細胞周期圖

3 討 論

WTX位于X染色體上，是一種對腫瘤具有抑制作用的基因，WTX基因蛋白存在于細胞質和細胞膜內。因WTX基因位置比較特殊，使其抑癌作用具有獨特性。Wnt/β-catenin信號通路比較保守，能夠調節細胞的分化增殖和凋亡，在細胞穩態、胚胎發育和多種疾病的發病過程中發揮重要作用[7]。β-catenin是Wnt信號通路的關鍵因子，是粘連素家族成員，位于細胞質、細胞膜和細胞核中，參與細胞之間的黏附，正向調節Wnt通路，β-catenin在細胞核內累積及在細胞質中降解失去平衡等會激活靶基因轉錄，引起腫瘤的發生[8]。WTX和β-catenin關系密切，能夠與β-catenin形成復合物，形成的復合物對β-catenin蛋白降解和泛素化，對Wnt/β-catenin信號通路有負向調節作用[9-10]。WTX還可以抑制核因子E2相關因子2(NRF2)的泛素化，WTX缺失引起NRF2迅速降解和泛素化，降低其對細胞的毒性反應。WTX還影響P53的活性及其對癌癥的抑制作用。因此WTX既可以影響P53的抑癌通路，又可以影響Wnt/β-catenin的致癌通路[11]。

在Willms瘤患者中存在有WTX基因突變，在胃癌、肝癌等其他惡性腫瘤中，很少發現WTX基因突變，考慮WTX和其他惡性腫瘤的關系可能與其表達缺失有關[12-13]。在結腸癌中，WTX基因突變對β-catenin降解復合物的功能有一定影響，同時與腫瘤的增殖凋亡和生長發育有關，對腫瘤有抑制作用。WTX縮短突變能夠增加β-catenin的表達，Wnt/β-catenin信號通路在結腸癌的發生、發展過程中發揮重要作用，Wnt/β-catenin信號通路異常激活能夠引起結腸癌的發生[14-15]，WTX是Wnt/β-catenin信號通路的負向調節因子，在結腸癌的發生中可能也發揮重要作用。本研究通過WTX基因轉染結腸癌Lovo細胞株，分析WTX基因對結腸癌細胞增殖和凋亡的影響。結果發現，WTX基因轉染組結腸癌細胞與對照組細胞比較，WTX蛋白表達升高，細胞增殖OD值降低，G1期細胞比例升高，G2期和S期細胞比例降低。可見，WTX基因對結腸癌Lovo細胞的凋亡沒有影響，WTX基因明顯抑制結腸癌細胞的增殖，WTX基因對結腸癌細胞生長的影響可能是通過抑制結腸癌細胞的增殖實現的，WTX基因影響結腸癌細胞的生長周期，結腸癌細胞主要被WTX基因阻滯在G1期，很少有細胞進入S期 ，表明WTX基因通過將結腸癌細胞阻滯于DNA合成期，從而發揮其抑癌作用的。

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Effect of WTX gene on colon cancer cell proliferation and apoptosis*

CaoMengyuan1,BaiYang2,XuYing3△

(1.MedicalJournalofJilinProvince，Changchun,Jilin130021,China;2.DepartmentofUltrasound,FirstHospital,JilinUniversity,Changchun,Jilin130021,China;3.DepartmentofNephrology,FirstHospital,JilinUniversity,Changchun,Jilin130021,China)

Objective To use WTX gene for transfecting into Lovo colon cancer cell line,and to analyze the impact of WTX gene on colon cancer cell proliferation and apoptosis.Methods Lovo colon cancer cell line was divided into the WTX gene transfection group and control group.The WTX gene transfection group was given WTX plasmid transfection,while the control group received empty vector transfection.The expression of WTX gene in the WTX gene transfection group and control group was observed.The proliferation,apoptosis and cell cycle change of Lovo colon cancer cells in two groups were also observed.Results The WTX protein expression in the WTX gene transfection group was significantly higher than that in the control group(P<0.05);the OD values on 4,7 d after transfection in the WTX gene transfection group were significantly lower than those in the control group (P<0.05);the G1phase cells proportion in the WTX gene transfection group was significantly higher than that in the control group(P<0.05),the G2and S phase cells proportion in the WTX gene transfection group was significantly lower than that in the control group (P<0.05).Conclusion WTX gene inhibits the proliferation of colon cancer cells,affects colon cancer cells cycle,has no effect on apoptosis of colon cancer cells.

colonic neoplasms；genes；flow cytometry；apoptosis；WTX gene；colon cancer Lovo cell line；cell proliferation

? 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.001

吉林省科技發展計劃項目(2013052218JH)。

曹夢園(1979-)，副編審，碩士，主要從事老年病學方面研究。△

R656.9

A

1671-8348(2017)02-0145-03

2016-07-19

2016-09-18)