綠木霉ZY-01的外切葡聚糖酶CBH Ⅰ基因的克隆及在E.coli中的表達

阮 濤，曹一丁，劉貝貝，楊 睿，展寶睿，張士堯，馬 龍，翟 蓉，楊忠華*

(1.武漢科技大學化學與化工學院，湖北 武漢430081；2.武漢東湖學院生命科學與化學學院，湖北 武漢 430212)

綠木霉ZY-01的外切葡聚糖酶CBH Ⅰ基因的克隆及在E.coli中的表達

阮 濤1，曹一丁1，劉貝貝1，楊 睿1，展寶睿1，張士堯1，馬 龍1，翟 蓉2，楊忠華1*

(1.武漢科技大學化學與化工學院，湖北 武漢430081；2.武漢東湖學院生命科學與化學學院，湖北 武漢 430212)

以前期分離篩選得到的高產纖維素酶菌株TrichodermavirensZY-01的總RNA為模板合成cDNA，經PCR克隆得到外切葡聚糖酶(cellobiohydrolase,CBH)Ⅰ基因；并構建了pET-32a-cbh1表達載體，通過轉化至E.coliBL21(DE3)中，獲得CBH Ⅰ重組表達系統，成功表達出可溶性CBH Ⅰ蛋白。結果表明，TrichodermavirensZY-01 CBH Ⅰ堿基序列與TrichodermavirideAS 3.3711 CBHⅠ基因(GenBank：AY368686.1)序列相似度高達91.95%，氨基酸同源性高達99.22%；通過SDS-PAGE檢測，表明該基因在E.coli中得到可溶性表達，分子量約為53 kDa，與基因翻譯出的氨基酸序列相一致。該研究為CBH Ⅰ基因的工程化及應用提供了基礎。

綠木霉；纖維素酶；外切葡聚糖酶；CBH Ⅰ基因；基因重組；原核表達

纖維素廣泛存在于植物殘體中，是一種重要的可再生資源，隨著農業的發展，秸稈類是纖維素生物質的主要來源之一。然而在我國，大多數秸稈被直接焚燒處理，不僅浪費了大量資源，也污染了環境，若加以有效利用，不僅能有效解決資源問題，也能幫助我們解決大氣污染的問題[1]。纖維素酶是用來水解纖維素的一類復合酶，主要包括外切葡聚糖酶(cellobiohydrolase，CBH)、內切葡聚糖酶(endoglucanase，EG)及β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BG)。然而，天然纖維素酶的酶活及產量較低等因素限制了纖維素酶的大規模工業化應用。

CBH是降解天然纖維素的主要組分，屬于水解酶第七家族，是存在于真菌中的組成型纖維素酶，主要作用于結晶纖維素，能從纖維素鏈的非還原末端水解β-1,4-糖苷鍵，每次切下一個纖維二糖單位，在打開纖維素天然晶體的結構中起到重要作用。因此國內外學者對CBH進行了大量的研究，大多在真核表達系統中進行表達。如張煜等[2]將TrichodermareeseiCBH Ⅱ基因轉化到畢赤酵母表達系統中進行了表達；黃時海等[3]克隆了TrichodermakoningiiCBH Ⅰ基因，并在畢赤酵母中成功表達，表達產物酶活24.1 U·L-1；劉澤寰等[4]從綠木霉中克隆得到CBH Ⅱ基因，并在釀酒酵母中成功表達，培養液中表達產物的酶活可達7.7 U·mL-1；Godbole 等[5]將里氏木霉中的CBH Ⅰ基因進行了克隆，并在畢赤酵母中成功表達；丁新麗等[6]構建了能夠同時表達CBH Ⅰ和EG Ⅰ基因的重組酵母工程菌。而隨著基因工程技術的飛速發展，已有80多種纖維素酶的相關基因被克隆，大多數都可在E.coli中進行原核表達[7-8]。

綠木霉是高效的纖維素酶產生菌之一。作者從實驗室前期篩選出的高產纖維素酶菌株TrichodermavirensZY-01中克隆出CBH Ⅰ基因，并將其轉化到E.coliBL21(DE3)中進行原核表達，為構建高效纖維素酶工程菌株提供技術基礎。

1 實驗

1.1 材料與試劑

綠木霉(Trichodermavirens)ZY-01由本實驗室篩選保存，保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC No：M 2012205)。克隆菌E.coliDH5α、表達宿主菌E.coliBL21(DE3)、表達載體質粒pET-32a均由本實驗室保存。

RNAprep Pure Plant Kit 植物總RNA提取試劑盒、T4DNA連接酶、DNA Marker，Tiangen公司；Revert Aid First strand cDNA synthesis Kit逆轉錄試劑盒，Fermentas公司；ePfu mix、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、PCR產物純化試劑盒、質粒快速提取試劑盒，武漢川流生物科技有限公司；限制性內切酶XhoⅠ、SalⅠ(HF)及相關試劑，NEB公司。

LB培養基主要用于篩選、誘導過程中E.coli的培養。SOB培養基主要用于Inoue法制備E.coli超級感受態細胞。

1.2 方法

1.2.1T.virensZY-01總RNA的提取及逆轉錄合成cDNA

根據RNAprep Pure Plant Kit 植物總RNA提取試劑盒說明書提取T.virensZY-01的總RNA。以總RNA為模板，根據Revert Aid First strand cDNA synthesis Kit逆轉錄試劑盒說明書，逆轉錄合成cDNA，保存于-70 ℃，用作PCR模板。

1.2.2 引物設計

根據GenBank收錄的與綠木霉(T.virens) ZY-01 CBH Ⅰ同種屬菌含有的CBH Ⅰ基因序列信息，以及質粒pET-32a上的多克隆酶切位點，利用Primer 5.0軟件設計引物，交由北京擎科新業生物技術有限公司合成。引物序列分別為：

正向引物：5′-CCGCTCGAGTTACAGGCACTGAGAGTAGT-3′(下劃線部分為XhoⅠ酶切位點)；

反向引物：5′-ACGCGTCGACATGTATCGGAAGTTGGCCGT-3′(下劃線部分為SalⅠ 酶切位點)。

1.2.3 CBH Ⅰ 基因的擴增

以cDNA為模板，通過PCR擴增出CBH Ⅰ基因片段。反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，64 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，34個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒和PCR產物純化試劑盒對擴增產物分別進行回收和純化，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收和純化效果，并保存于-20 ℃用于后續操作。1.2.4 重組質粒pET-32a-cbh1的構建及測序鑒定使用質粒快速提取試劑盒提取質粒pET-32a，采用Inoue法制備E.coli超級感受態細胞。將回收純化后的PCR產物和質粒載體pET-32a分別用XhoⅠ和SalⅠ進行雙酶切后，膠回收并純化。將CBH Ⅰ基因與載體pET-32a經T4DNA連接酶于16 ℃連接過夜后，轉化至感受態細胞E.coliDH5α，利用LB/Amp100抗性平板篩選得到陽性轉化子。培養并利用質粒快速提取試劑盒提取質粒。

通過對重組質粒進行雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質粒交由北京擎科新業生物技術有限公司測序，測序使用的pET-32a通用引物序列為：正向引物：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′；反向引物：5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′。測序結果與TrichodermavirideAS 3.3711 CBH Ⅰ基因(GenBank：AY368686.1)進行堿基序列及氨基酸序列比對，并根據軟件分析得到目的基因表達出的蛋白理論大小。

1.2.5 目標蛋白在E.coliBL21(DE3)中的誘導表達及鑒定

將測序正確的重組質粒pET-32a-cbh1用熱激法導入表達菌E.coliBL21(DE3)中，挑取陽性菌落至LB/Amp100液體培養基中，于37 ℃、200 r·min-1振蕩培養3 h。待OD600為0.4～0.6時，降溫至30 ℃，加入IPTG誘導CBH Ⅰ基因的表達。IPTG終濃度0.5 mmol·L-1，誘導時間6 h，誘導溫度30 ℃。12 000 r·min-1離心10 min，收集沉淀，用pH=7.4的Tris-HCl緩沖液對菌體進行重懸，反復凍融后，進行超聲破胞，破胞后于4 ℃、10 000 r·min-1離心，收集上清液和沉淀，分別加入50 μL 1×蛋白上樣緩沖液，進行SDS-PAGE電泳檢測。實驗中設置對照組如下：

實驗組：重組菌E.coliBL21(DE3)(pET-32a-cbh1)，加IPTG誘導。

對照組1：導入質粒pET-32a的E.coliBL21(DE3)，加IPTG誘導。

對照組2：不含質粒pET-32a的E.coliBL21(DE3)，加IPTG誘導。

對照組3：重組菌E.coliBL21(DE3)(pET-32a-cbh1)，不加IPTG誘導。

2 結果與討論

2.1 T.virens ZY-01總RNA的提取

T.virensZY-01總RNA提取產物的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1所示。

M.DL5000 markerⅢ 1.RNA提取產物圖1 RNA提取產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophorogram of RNA extraction

從圖1可以看出，28 s亮度是18 s的兩倍，表明成功提取出總RNA。

2.2 PCR擴增CBH Ⅰ基因

以T.virensZY-01的總RNA為模板，通過RT-PCR得到cDNA，再以cDNA為模板克隆得到目的基因CBH Ⅰ，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對PCR產物回收純化后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2所示。

M.DL5000 markerⅢ 1.PCR產物圖2 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophorogram of PCR products

由圖2可以看出，目的條帶大小約1 700 bp，與GenBank公布的CBH Ⅰ基因大小(1 746 bp)基本相符，說明成功克隆出CBH Ⅰ基因。

2.3 重組質粒pET-32a-cbh1的構建

分別對PCR產物及質粒pET-32a進行XhoⅠ和SalⅠ雙酶切，經連接、轉化、篩選后，將陽性轉化子于含Amp抗性的LB液體培養基中培養后，提取質粒，利用XhoⅠ和SalⅠ進行雙酶切，酶切產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖3所示。

M.DL5000 markerⅢ 1.重組質粒雙酶切產物圖3 重組質粒雙酶切產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophorogram of recombinant plasmid products by double digestion

由圖3可以看出，圖中出現大小約為1 700 bp和5 900 bp的條帶，與預期結果相符，表明重組質粒pET-32a-cbh1構建成功。

2.4 重組質粒pET-32a-cbh1的測序鑒定

T.virensZY-01 CBH Ⅰ與T.virideAS 3.3711 CHB Ⅰ基因的堿基序列比對結果如圖4所示，氨基酸序列比對結果如圖5所示。

圖4 T.virens ZY-01 CBH Ⅰ與T.viride AS 3.3711 CBH Ⅰ堿基序列比對結果Fig.4 CBH Ⅰ gene base sequence alignment results ofT.virens ZY-01 and T.viride AS 3.3711

圖4比對結果表明，T.virensZY-01 CBHⅠ基因與T.virideAS 3.3711 CBHⅠ基因的堿基序列的相似度高達91.95%。與T.virideAS 3.3711堿基序列相比，T.virensZY-01 CBH Ⅰ基因的序列中有4個堿基突變，分別為C突變為T、G突變為A、G突變為A、G突變為A，并且顯示有兩段內含子序列，可能是因為RNA模板存放時間較長，或實驗前沒有加入DNAase進行消化，導致模板中混入了基因組DNA。根據測序結果，分析CBH Ⅰ蛋白分子量約為53 kDa，編碼513個氨基酸，與T.virideAS 3.3711編碼的514個氨基酸相比，有4個編碼氨基酸不同(甘氨酸突變為谷氨酸，天冬氨酸突變為天冬酰胺，脯氨酸突變為精氨酸，還有一個氨基酸缺失)，同源性高達99.22%(圖5)。此結果進一步說明成功克隆出CBH Ⅰ基因。

圖5 T.virens ZY-01 CBH Ⅰ與T.viride AS 3.3711 CBH Ⅰ氨基酸序列比對結果Fig.5 Amino acid sequence alignment results ofT.virens ZY-01 and T.viride AS 3.3711

2.5 目標蛋白的誘導表達及分子量鑒定

分別對重組菌菌體總蛋白、破胞后的上清液及沉淀進行SDS-PAGE電泳檢測，結果見圖6、圖7。

M.protein marker 1.對照組1 2.對照組2 3.對照組3 4.實驗組

圖6 菌體總蛋白SDS-PAGE電泳

Fig.6 SDS-PAGE electrophorogram of total bacterial protein

從圖6可以看出，全蛋白中有約為53 kDa的蛋白條帶。

M.protein marker 1.對照組1沉淀 2.對照組2沉淀 3.對照組3沉淀 4.實驗組沉淀 5.對照組1上清液 6.對照組2上清液 7.對照組3上清液 8.實驗組上清液

圖7 CBH Ⅰ蛋白的SDS-PAGE電泳

Fig.7 SDS-PAGE electrophorogram of CBH Ⅰ protein

從圖7可以看出，破胞上清液及沉淀中均有53 kDa的蛋白條帶，這與利用DNA測序預測的蛋白分子量相符合，說明CBH Ⅰ基因成功在E.coliBL21(DE3)中表達，一部分為可溶性蛋白，一部分可能以包涵體的形式存在。

2.6 討論

到目前為止，人們已從近百個物種中克隆到纖維素酶基因，主要來自細菌和真菌[9]，而大多數真菌都能夠合成纖維素酶，綠木霉就是木霉屬中纖維素酶表達量較高的菌株之一。纖維素酶作為生物降解纖維素過程中的一個復合酶，其組分相互協作，有序作用，各組分的比例由微生物內部的調控機制進行調控[1]。因此，將產纖維素酶菌株中某種纖維素酶單一組分的基因進行克隆、表達，對研究纖維素酶降解纖維素的機制以及尋找合適纖維素酶的組合比例有重要的意義。

考慮到真核基因在原核中表達普遍存在表達量低的現象，所以本研究利用具有T7 lac強啟動子的pET-32a質粒作為表達載體，克隆T.virensZY-01中的CBH Ⅰ基因，并在E.coliBL21(DE3)進行誘導表達，檢測過程中發現在破胞后的上清液和沉淀中均有目標蛋白條帶，可能是因為真核基因在原核中表達時一部分蛋白以包涵體的形式存在于細胞內。該蛋白的酶學性質，探究pH值、溫度、金屬離子種類及濃度等對酶催化效率的影響，優化蛋白表達的條件，提高蛋白表達量以及更換為真核表達系統的工作還在進一步研究之中。

3 結論

成功克隆得到了綠木霉(T.virens) ZY-01的外切葡聚糖酶CBH Ⅰ基因，其開放閱讀框為1 700 bp，編碼513個氨基酸，與GenBank編號為AY368686.1的T.virideAS 3.3711 CBH Ⅰ 基因進行序列比對，其堿基序列相似度為91.95%，氨基酸序列的同源性高達99.22%。同時，利用pET-32a質粒構建了重組菌E.coliBL21(DE3)(pET-32a-cbh1)，使目的基因CBH Ⅰ得以在E.coliBL21(DE3)中初步表達，對破胞前菌體總蛋白和破胞后的上清液、沉淀分別進行了SDS-PAGE電泳，結果顯示，目的蛋白CBH Ⅰ是胞內蛋白，并且一部分以可溶性蛋白的方式存在于菌體內，還有一部分可能以包涵體的形式存在于細胞內，其蛋白分子量約為53 kDa。

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Cloning of CBH Ⅰ Gene fromTrichodermavirensZY-01 and Its Expression inE.coli

RUAN Tao1，CAO Yi-ding1，LIU Bei-bei1,YANG Rui1，ZHAN Bao-rui1，ZHANG Shi-yao1，MA Long1,ZHAI Rong2,YANG Zhong-hua1*

(1.SchoolofChemistryandChemicalEngineering，WuhanUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430081,China；2.CellegeofLifeScienceandChemistry,WuhanDonghuUniversity,Wuhan430212,China)

CBHⅠgenewasclonedbyPCRwithsyntheticcDNAusingthetotalRNAofTrichoderma virensZY-01,whichisahigh-yieldcellulasestrainandscreenedinourpreviouswork,asatemplate.TheexpressionvectorpET-32a-cbh1wasconstructedandtransformedintoE.coliBL21(DE3)toobtaintheCBHⅠrecombinantexpressionsystem.AndthesolubleCBHⅠproteinwassuccessfullyexpressed.Theresultsshowedthat,thebasesequencesimilarityofCBHⅠtoTrichoderma virideAS3.3711CBHIgene(GenBank:AY368686.1)wasashighas91.95%andtheaminoacidhomologywas99.22%.TheresultofSDS-PAGEindicatedthattheexpressedproteinwassolubleinE.coliandhadamolecularweightofabout53kDa,whichwasconsistentwiththeaminoacidsequencetranslatedfromthegene.ThisworkprovidesthebasisfortheindustrialapplicationofcellobiohydrolaseCBHⅠgene.

Trichoderma virens;cellulase;cellobiohydrolase;CBHⅠgene;generecombination;prokaryoticexpression

國家自然科學基金資助項目(21376184)，教育部回國人員科研啟動基金資助項目，湖北省教育廳科研重點項目(D20121108)，生物強化技術與新進冶金工業廢水創新團隊項目

Q 786 Q 556.5

A

1672-5425(2017)01-0027-05

阮濤，曹一丁，劉貝貝，等.綠木霉ZY-01的外切葡聚糖酶CBH Ⅰ基因的克隆及在E.coli中的表達[J].化學與生物工程，2017，34(1)：27-31.