1例攜帶HFE基因剪切突變的遺傳性血色病患者家系調查

寧會彬， 何 佳， 李俊利， 劉俊平， 肖二輝， 尚 佳

(河南省人民醫院 感染科， 鄭州 450000)

1例攜帶HFE基因剪切突變的遺傳性血色病患者家系調查

寧會彬， 何 佳， 李俊利， 劉俊平， 肖二輝， 尚 佳

(河南省人民醫院 感染科， 鄭州 450000)

目的 探討1例新型的遺傳性血色病(HH)患者家系HFE基因突變形式。方法 對確診的1例HH患者分析其與5位相關親屬的血色病基因，提取血液基因組 DNA，采用PCR擴增相關基因 HFE、HJV、HAMP、轉鐵蛋白受體(TfR)2、SLC40A1的外顯子、內含子剪切序列，瓊脂糖凝膠電泳、純化后，雙向直接測序檢測突變位點。結果 先證者肝功能異常，血清鐵(SI)、總鐵結合力(TIBC)、鐵蛋白(SF)、轉鐵蛋白飽和度(TS)均升高，HFE基因外顯子EXON2的區間序列2號內含子第4個堿基出現T→C純合突變(IVs 2+4T→C, C/C 純合，splicing，異常)，HJV、HAMP、TfR2、SLC40A1未見異常，患者兒子出現與其相同純合突變，3位親屬存在雜合突變，1位親屬無異常突變。 結論 基因檢測在血色病診斷中起著重要作用，HFE基因IVs 2+4T→C突變可能是新型的中國HH的致病遺傳基因突變類型。

血色素沉著癥； 點突變； 基因, 調節； 系譜

原發性血色病又稱遺傳性血色病(hereditary hemochromatosis, HH)，是由于第 6號染色體存在血色病突變基因而導致不相宜的自飲食中鐵吸收增多，是與人類白細胞抗原相關的常染色體隱性遺傳的鐵負荷過多性疾病。隨著大量鐵離子逐漸沉積于肝、心、胰腺等器官的實質細胞中，導致組織纖維化和結構改變，最終可引起器官功能障礙和衰竭，如肝硬化、肝癌、糖尿病、心力衰竭、垂體及性腺功能減退、關節疾病和皮膚色素沉著等[1]。對1例發生基因突變的HH患者家系進行遺傳分析，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 患者男性，32歲，因“反復轉氨酶升高5年余”于2016年5月入院。查體：面色青黑，其他皮膚褶皺處色素沉著，脾大，肋下3 cm可觸及，心肺聽診未見明顯異常。實驗室檢查：ALT 122 U/L，AST 49 U/L，Alb 43.3 g/L，空腹血糖5.2 mmol/L，血清鐵蛋白(serum ferritin,SF) 7614 ng/ml，血清鐵(serum iron,SI) 201 μmol/L，總鐵結合力(total iron binding capacity,TIBC) 279 μmol/L，轉鐵蛋白飽和度(transferrin saturation,TS)72%；嗜肝病毒和非嗜肝病毒、甲狀腺功能、血常規、尿常規檢測均陰性。彩超：肝實質回聲致密增強，脾臟增大。患者無肝活組織檢查禁忌，與患者溝通后簽署知情同意書，行肝穿刺活組織檢查：肝細胞內彌漫性含鐵血黃素顆粒沉積，肝小葉灶狀壞死，伴巨噬細胞聚集并吞噬含鐵血黃素顆粒，部分小膽管上皮細胞內可見含鐵血黃素顆粒，普魯士藍染色肝細胞內彌漫性陽性，部分膽管上皮細胞及吞噬細胞陽性，符合HH表現(圖1)。

圖1 肝穿刺活組織檢查(×100) a：HE染色顯示肝細胞內彌漫含鐵血黃素顆粒沉積；b：普魯士藍染色顯示彌漫性陽性改變

診斷標準參考2011年版《美國血色病診療指南》[2](圖2)，結合患者臨床表現、實驗室檢測和病理結果明確診斷為HH。為進一步明確其遺傳背景，在告知并簽署知情同意書后，采集患者及其他5位家屬外周靜脈血，離心后分離血清、血漿，并將樣本置于-80 ℃冰箱保存，用于基因檢測。

圖2 HH診斷流程

1.2 研究方法

1.2.1 材料與設備 OLYMPUS AU600全自動生化分析儀(日本 Olympus 公司)；羅氏 Cobas e601電化學發光免疫分析儀，基因組 DNA 提取試劑盒(TIANGEN 公司)；HH相關5種基因引物合成(生工生物工程上海股份有限公司); DNA gel extraction 試劑盒(德國QIAGEN 公司)； PCR 儀(美國Applied Biosystems公司)；ABI XL-3730DNA測序儀(美國PE公司)。

1.2.2 鐵代謝及生化指標檢測 檢測SF、SI、TIBC水平，TS=SI/TIBC×100%。正常值參考區間如下。SF：男30～350 ng/ml，女20～300 ng/ml；SI：男 8.1～28.3 μmol/L，女6.6～26.0 μmol/L; TIBC：46.4 ～ 69.5 μmol/L; TS： 20%～55%。同時檢測血清轉氨酶、膽紅素、血糖等生化指標。

1.2.3 基因檢測 抽提患者外周血基因組DNA。PCR擴增 HFE、HJV、HAMP、轉鐵蛋白受體(transferring receptor,TfR)2、SLC40A1基因外顯子、內含子剪切序列及5′、3′端的非翻譯區(untranslated region,UTR)。擴增引物通過Primer3.0軟件設計(表1)。PCR程序: 95 ℃預變性5 min，95 ℃變性 45 s，退火溫度55 ℃ 45 s，72 ℃延伸90 s，35個循環。PCR產物經10 g/L瓊脂糖電泳、切膠、回收。同樣方法對患者家屬行HFE基因檢測處理，純化產物送北京宏微特斯生物科技有限公司雙向直接測序，測序結果與基因文庫中的基因序列進行對照, 應用 Sequencher 4.2 軟件分析測序結果。然后通過最新的系統Polphen、Mutationtaster、SIFT、I-mutant和PROVEAN軟件預測該基因突變是否可能與疾病相關。

1.2.4 家系調查和家系遺傳圖譜分析 家系調查問卷內容包括性別、年齡、是否近親婚配、健康狀況、有無慢性肝病、既往肝功能檢查結果、膽紅素水平等。獲取部分家系成員HFE基因 DNA測序分析結果后, 根據HFE基因突變按遺傳作圖方法標記出HFE基因突變家系成員的位置, 分析突變基因的來源和遺傳方式。

2 結果

2.1 一般資料 先證者及家系成員一般資料及鐵代謝相關檢測結果見表2。

2.2 基因檢測 先證者血色病相關HFE、HJV、HAMP、 TfR2、SLC40A1基因檢測中，僅在HFE基因外顯子EXON2 相應區間序列2號內含子第4個堿基出現T→C純合突變(IVs 2+4T→C, C/C純合，splicing，異常)。患者兒子與先證者同為HFE IVs 2+4T→C純合突變，患者父母和妻子均為IVs 2+4T→C, C/T雜合突變，患者妹妹為正常TT純合表型(圖3)。

2.3 家系成員遺傳圖譜 根據測序結果, 明確每位家系成員的HFE基因型, 以IVs 2+4T→C等位基因為基礎,繪制家系圖譜(圖4)。

3 討論

隨著基因檢測技術的不斷發展，血色病的診治有了飛速的進展[3]。目前認為HH的發病機制可能與HFE、HJV、HAMP、TfR2和 SLC40A1等基因突變有關，導致轉鐵蛋白-轉鐵蛋白受體機制紊亂[4]。在國外，HFE基因異常尤其是C282Y位點的基因突變與80%的HH患者有明確的相關性，被認為是診斷HH的有力依據。在我國HH基因突變主要為個案報道[5-6]，僅發現HJV C321X、HFE H63D和HFE IVS 3+5T>C等少數非典型HFE突變，然而其遺傳機制尚不明確。HFE 是第一個被確定的血色病相關基因，其中C282Y(酪氨酸取代282位半胱氨酸)和H63D(天冬氨酸取代63位組氨酸)是最主要的2個致病性突變位點。在歐美國家，尤其是在高加索人群中，約85%～90%的HH患者帶有C282Y純合突變或C282Y/H63D復合突變，然而HFE C282Y基因突變在亞洲人群中較低。這也提示亞洲人群中HH的遺傳基因或以非HFE 相關性血色病為主[7]。因此應更關注非HFE的突變類型，以期發現中國HH的基因遺傳背景。

表1 HFE /HJV/HAMP/TfR2/SLC40A1基因引物序列

表2 先證者及家系成員一般資料及鐵代謝相關檢測結果

編號性別年齡ALT(U/L)AST(U/L)SF(ng/ml)SI(μmol/L)TIBC(μmol/L)TS(%)Ⅰ-1男61381482175233Ⅰ-2女58322679124725Ⅱ-1女312932101155129Ⅱ-2(先證者)男 32 122 49 7614 201 279 72 Ⅱ-3女27171863164833Ⅲ-1男7912142145326

圖3 基因檢測結果 a. HFE IVs 2+4T→C，C/C純合突變；b. HFE IVs 2+4T→C, C/T雜合突變；c. HFE正常

圖4 家系成員遺傳圖譜 Ⅱ-2為本研究HH患者(先證者)；Ⅰ-1、Ⅰ-2、Ⅱ-1為雜合子異常，Ⅱ-3為正常，Ⅲ-1為純合突變異常。除先證者外，其他親屬TS均正常

在線人類孟德爾遺傳數據庫根據不同基因突變情況將 HH 分為 4個類型：1 型為 HFE 突變所致，故又稱為 HFE 相關血色病；2 型為 HJV 基因(2A)和 HAMP 基因(2B)突變所致；3 型為 TfR2 基因突變所致；4型為 FPN 基因突變所致[1]。HJV mRNA 主要在肝臟、心臟和骨骼肌中表達[8]，其中肝實質細胞內 HJV的表達對鐵調素的分泌具有重要的調節功能，進而維持機體內鐵代謝的平衡，其異常突變導致鐵調素表達降低而致病，其中p.C321X突變類型在我國多次報道[9-10]，此外p.I281T 純合突變、p.R326X突變也被證實可引起 HJV 蛋白缺失尾部的糖基磷脂肌醇錨定結構域，進而形成可溶性HJV，最終引發鐵代謝異常，被認為是我國最常見的基因突變類型。HAMP 編碼的是肝臟分泌的小分子肽類激素，是負性鐵調節激素。HAMP 基因本身缺失的表型與HJV功能缺失導致的表型一致，其鐵蓄積嚴重且速度更快[11]。TfR2 基因突變是在2000年發現的常染色體隱性遺傳形式。它位于染色體7q22，由18個外顯子組成，編碼TfR2蛋白，參與肝細胞攝取轉鐵蛋白結合鐵，并與 HFE 結合后，調節鐵調素的表達從而致病[12-13]。FPN基因突變引起的鐵超負荷與前幾種基因不同。FPN 基因包括2種突變類型：一種是突變導致其編碼的鐵泵蛋白不能定位在細胞表面的“功能缺失性突變”，鐵離子主要沉積在網狀內皮系統 (肝和脾)，此種情況被稱為膜轉鐵蛋白疾病[14]；另一種是表達于細胞表面的FPN產生鐵調素抵抗“功能獲得性突破”，與HFE 相關血色病類似[15]。

本研究的HH家系中，先證者及其兒子屬于HFE基因突變，其表型為2號內含子第4個堿基出現T→C純合突變(IVs 2+4T→C, C/C 純合突變)，患者妻子和父母表現為該表型的T/C雜合突變，其妹妹為正常純合表型，該遺傳形式符合遺傳定律，屬于常染色體的隱性遺傳。該家系先證者發病，SF、TS、SI、TIBC均明顯升高，肝活組織檢查可見明顯大量鐵沉積，診斷明確。此外，指南[2]中提出HH按病程可分為3期: 1期為患者具有“遺傳易感性”, 但尚未發生鐵過度沉積；2期為患者具有鐵過度沉積的顯型證據, 尚無組織或器官損傷; 3期為患者鐵過度沉積, 導致組織和器官損傷。患者兒子存在同樣基因突變但尚未發病，處于疾病的1期階段，支持除遺傳因素外，多種因素所致患者體內鐵過載進而引起相應器官損傷而致病。本研究發現的基因突變在我國尚未見報道，這或許是我國HH患者發病相關的基因表型，但其影響基因突變相關氨基酸或蛋白質功能的變化及具體發病機制仍需要大量研究進一步證實和探討。鼓勵HH相關基因突變的新類型個例及家系的報道，積極開展有關血色病的大規模人群流行病學調查，確立與中國人群相關的 HH 基因突變類型庫，通過快速、有效的臨床基因診斷方法對疾病做出早期診斷及防治是HH研究的重點，這也是本病未來診治的基礎。

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引證本文：NING HB, HE J, LI JL, et al. A family with hereditary hemochromatosis carrying HFE gene splice site mutation: a case report[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(1): 155-159. (in Chinese) 寧會彬， 何佳， 李俊利， 等. 1例攜帶HFE基因剪切突變的遺傳性血色病患者家系調查[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(1): 155-159.

(本文編輯：朱 晶)

讀者·作者·編者

A family with hereditary hemochromatosis carrying HFE gene splice site mutation: a case report

NINGHuibin,HEJia,LIJunli,etal.

(DepartmentofInfectiousDiseases,HenanProvincialPeople′sHospital,Zhengzhou450000,China)

Objective To investigate a new type of HFE gene mutation in a family with hereditary hemochromatosis (HH). Methods The analysis of HFE gene was performed for one patient with a confirmed diagnosis of HH and five relatives. Blood genomic DNA was extracted and PCR multiplication was performed for the exon and intron splice sequences of related HFE, HJV, HAMP, transferrin receptor 2 (TfR2), and SLC40A1 genes. After agarose gel electrophoresis and purification, bi-directional direct sequencing was performed to detect mutation sites. Results The proband had abnormal liver function and increases in serum iron, total iron binding capacity, serum ferritin, and transferrin saturation, as well as T→C homozygous mutation in the fourth base of intron 2 in the intervening sequence of the exon EXON2 of HFE gene (IVs 2+4T→C, C/C homozygous, splicing, abnormal). There were no abnormalities in HJV, HAMP, TfR2, and SLC40A1 genes. The proband′s son had the same homozygous mutation, three relatives had heterozygous mutations, and one relative had no abnormal mutations. Conclusion Gene detection plays an important role in the diagnosis of hemochromatosis, and IVs 2+4T→C mutation may be a new pathogenic mutation for HH in China.

hemochromatosis； point mutation； genes, regulator； pedigree

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.01.034

2016-08-02；

2016-09-22。

國家臨床重點專科建設項目(2013年度)；河南省衛生廳科技攻關計劃項目基金資助項目(201503171)

寧會彬(1989-)，男，主要從事慢性肝病基礎和臨床研究。

R364.23； R596.3

A

1001-5256(2017)01-0155-05