胃黏膜P16 hMLH1DNA甲基化水平與慢性萎縮性胃炎中醫證型差異研究

劉慶生 邱 靜 蔡丹莉 桑 怡 陳芝蕓

我國是胃癌高發地區，其病死率居于各種惡性腫瘤的首位，慢性萎縮性胃炎（CAG）的胃黏膜腸上皮化生和異型增生被廣泛認為是胃癌前病變，CAG伴腸腺化生或不典型增生的癌變率為7%～9%。研究發現，胃黏膜組織存在腺體萎縮和慢性炎癥時，該部位黏膜細胞抑癌基因啟動子區域呈高甲基化狀態和抑癌基因蛋白的低表達。目前關于CAG不同中醫證型與胃癌關系研究報道較少，然而文獻報道CAG的產生與胃黏膜組織中P16、hMLH1基因的表達有關［1］。因此本研究以P16、 hMLH1 DNA甲基化表達為切入點，采用焦磷酸測序法檢測經病理組織學證實的CAG患者胃黏膜中的P16、hMLH1 DNA甲基化表達。分析CAG不同中醫證型胃黏膜p16、hMLH1 DNA甲基化水平差異及其相關性，探討癌基因侵襲、發生、發展與中醫證型之間的關系，尋求這些差異產生的可能原因。

1 材料與方法

1.1 一般資料 2013年1月至2014年12月就診于本院經電子胃鏡以及胃黏膜組織病理證實為CAG的患者180例［2］，辨證分型為肝胃不和型、瘀毒內阻型、痰濕凝結型、脾胃虛寒型、胃熱傷陰型、氣血雙虧型［3］，每組各30例。其中男86例，女94例；年齡30～75歲，平均年齡（62.98±10.06）歲。再每組選取無嗜酒史、無服藥史的患者12例，共72例CAG患者檢測胃黏膜DNA甲基化率，其中男32例，女40例；年齡30～75歲，平均年齡（60.94±11.14）歲。各證型間年齡、性別比較差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究經院倫理委員會審查通過。

1.2 病例納入與排除標準 納入標準：（1）符合CAG診斷標準的患者（男女不限）［3］。（2）年齡 18～75 歲。（3）近4周未服用過質子泵抑制劑及抗生素。（4）自愿參加研究并簽署知情同意書。排除標準：（1）有胃部手術史者。（2）已確診為胃癌或者其他系統惡性腫瘤患者。（3）長期服用非甾體抗炎藥（NSAID）患者。

1.3 實驗材料及方法 （1）標本采集：常規胃鏡檢查，取胃竇、胃角和胃體胃黏膜進行病理組織活檢，新鮮標本立即放置于EP管中，迅速保存至液氮中。（2）方法：檢測胃黏膜組織p16、mlh1DNA甲基化表達，嚴格按照試劑盒說明操作。Pyrosequencing檢測在96孔PCR反應板中加入反應結合珠2μl，結合緩沖液38μl，PCR產物40μl，室溫下充分混勻10min。開啟真空泵吸取結合珠及PCR產物混懸液，依次浸入70% 乙醇，0.2M NaOH和沖洗緩沖液中各5s；關閉真空泵，后將探頭上結合珠及PCR產物置人40μl退火緩沖液（含測序引物1.5μl），85℃變性2min，冷卻至室溫，使引物與模板退火雜交。根據Pyrose quencing軟件序列設計信息計算出劑量，在試劑艙中依次加入底物混合物、酶混合物及四種dNTP（QIAGEN），將試劑艙及96孔反應板放入Pyrosequencing檢測儀（PyroMark Q96 ID，QIAGEN）進行反應，Pyro Q-CpG軟件自動分析取得各位點甲基化定量分析數據。引物合成見表1。

表1 引物合成

1.4 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件。計量資料以（s）表示，行正態性檢驗和方差齊性檢驗，服從正態分布的采用多組均數比較的單因素方差分析，若不服從正態分布，采用非參數檢驗法；計數資料以n表示，行非參數檢驗法Kruskal Wallis檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 中醫各證型間性別和年齡的比較 CAG中醫各證型間性別和年齡比較差異均無統計學意義（P＞0.05），見表2、3。

表2 中醫各證型間性別的比較（n）

表3 中醫各證型間年齡的比較［歲，］

表3 中醫各證型間年齡的比較［歲，］

?

2.2 p16，hMLH1DNA基因甲基化與CAG中醫各證型關系 CAG的中醫各證型中p16基因甲基化率由高至低依次是肝胃不和＞脾胃虛寒＞氣血雙虧＞痰濕凝結＞胃熱傷陰＞瘀毒內阻。組間兩兩比較發現，胃熱傷陰、瘀毒內阻組與肝胃不和組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表 4。

表4 p16基因甲基化與CAG中醫各證型關系

2.3 基因甲基化與CAG中醫各證型關系 見表5。

表5 hMLH1DNA基因甲基化與CAG中醫各證型的關系

2.4 P16、hMLH1 DNA甲基化與病理分級關系 經Spearman相關法檢驗，發現CAG中醫各證型DNA甲基化與病理分級比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.5 P16、hMLH1 DNA 甲 基 化 與 Hp關 系 經Spearman相關性檢驗，發現CAG中醫各證型DNA甲基化與Hp感染比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

研究認為幽門螺旋桿菌（Hp）感染是觸發CAG形成和導致胃癌的重要危險因素，根除Hp可以延緩胃黏膜萎縮的進展，降低胃癌發生的危險性。KondoT等［4］在研究與胃MALT淋巴瘤發現，相關的11個基因的CpG島甲基化表型發生率與Hp感染率同步上升，其中尤其是p16，MINT31等基因的甲基化與Hp感染密切相關。另有研究發現，CAG癌前病變的病理變化與中醫證型之間存在一定的相關性，病理程度較輕時以實證為主，病理程度中、重度時以虛為主，虛實夾雜表現多見［5］。本研究經Spearman相關性檢驗，發現CAG中醫各證型p16及hMLH1DNA甲基化與病理分級比較差異無統計學意義（P＞0.05）。可能受近年來患者健康意識、胃鏡普查率的提高等因素影響，入組的病例以單純CAG伴輕度腸化患者居多，而中重度腸化及不典型增生病例相對太少有關。

DNA甲基化是最為重要的表觀遺傳學修飾，其熱點是啟動子區CpG島的高甲基化導致的抑癌基因表達失活和及低甲基化導致的原癌基因的激活。CpG島在正常狀態下一般是非甲基化的，當其發生甲基化時，常使重要的基因如抑癌基因、DNA修復基因、凋亡基因等發生轉錄沉寂，導致正常細胞的調控失常以及DNA損傷不能被及時修復，形成腫瘤。

抑癌基因啟動子區CpG 島的異常甲基化導致其功能失活是其參與腫瘤發生的重要機制之一。p16基因被認為是最重要的抑癌基因之一，其編碼的p16蛋白可通過與細胞周期蛋白依賴激酶 CDK4和CDK6 結合而抑制蛋白激酶的活性，從而對細胞周期起到負調控作用。與其他腫瘤不同的是，在胃癌中p16基因突變或缺失少見，而主要由于啟動子和第1外顯子甲基化導致。在正常細胞中p16基因啟動子區保持非甲基化狀態，基因可以正常表達、轉錄，基因啟動子甲基化可誘導p16、CDX2及 RASSF1A等抑癌基因的失活［7-9］。Yao等［6］研究顯示，21例由胃黏膜上皮異型增生發展為胃癌的病例中，有5例檢測到p16基因異常甲基化，并經基因測序證實該基因啟動子區域CpG島出現高甲基化，反映了癌的演變過程，也證明了其可能是早期事件。本實驗結果發現，各證型中p16基因甲基化率由高至低依次是肝胃不和＞脾胃虛寒＞氣血雙虧＞痰濕凝結＞胃熱傷陰＞瘀毒內阻。組間比較發現，胃熱傷陰、瘀毒內阻組與肝胃不和組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。而肝胃不和、脾胃虛寒、氣血雙虧組p16基因甲基化率較痰濕凝結、胃熱傷陰及瘀毒內阻高，且組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

hMLH1作為主要的DNA錯配修復基因之一，表達減少或缺失都會削弱DNA錯配修復的能力。Li等［7］研究191例胃癌組織、133例癌旁組織和42例非胃癌患者正常胃黏膜組織，發現其hMLH1表達分別為80.1%（153/191）、60.2%（80/133）和31.0%（13/42），癌組織hMLH1表達明顯高于癌旁組織和非胃癌患者的正常胃。由此得出，hMLH1基因啟動子區CpG島的異常甲基化是引起蛋白表達缺失的主要原因，hMLH1蛋白表達缺失與胃癌的發生有關。本研究經非參數檢驗，發現CAG的中醫各證型中hMLH1 DNA基因甲基化率比較差異無統計學意義（P＞0.05），提示hMLH1 DNA基因甲基化率與CAG中醫各證型無相關性。

本資料結果顯示，各證型中痰濕凝結、胃熱傷陰、瘀毒內阻型p16基因甲基化率較其他三型低，p16為抑癌基因，基因啟動子甲基化率降低可抑制抑癌基因的失活，因此，上述結果提示此三型CAG的人群癌變發生率可能低于其他三型。而肝胃不和、氣血雙虧、脾胃虛寒型p16基因甲基化率較其他三型高，提示這三型CAG的人群癌變發生率可能會增加，因此，在治療方面，對于肝胃不和、氣血雙虧、脾胃虛寒型的CAG應高度重視，定期隨訪，及早治療防止胃癌的發生。CAG萎縮部位與胃癌的發生率密切相關，已知的胃體萎縮癌變率高于胃竇，CAG不同部位萎縮的癌變率是否與上述中醫證型相關，有待進一步研究。

［1］ 劉麗華,張方信．胃癌前病變中DNA甲基化狀態與葉酸．世界華人消化雜志,2005,13(23):2770-2772．

［2］ 劉慶生,桑怡,蔡丹莉,等．慢性萎縮性胃炎中醫證型與病理﹑HP感染關系研究．浙江臨床醫學雜志,2015,17(12):2121-2123．

［3］ 鄭筱萸．中藥新藥臨床研究指導原則．中國醫藥科技出版社,2002:124-128．

［4］ T Kondo,T Oka,H Sato,et al． Accumulation of aberrant CpG hypermethylation by Helicobacter pylori infection promotes development and progression of gastric MALT lymphoma．Int JOncol,2009, 35(3):547-557．

［5］ 王俊,黃雅慧．CAG胃黏膜癌前病變病理變化與中醫證型及TRPV1﹑TRPM8的相關性研究．現代中西醫結合雜志,2014,23(24):2627-2630．

［6］ Yao JF,Chen WX,Yin YL,et al．Expressions and clinical significance of cyclo oxygenase-2 and p16 in gastric cancer and its precancerous lesion．Chin J Gastroentero,2009,14(1):31-34．

［7］ Li M,Liu L,Wang Z, et al． Overexpression of hMSH2 and hMLH1 protein incertain gastric cancers and their surrounding mucosae．Oncol Rep,2008,19(2):401-406．